丝素膜是一类新型生物材料，可轻松定制以适用于多种生物医学应用。所介绍的丝素膜培养系统具有高度适应性，可用于多种 体外 分析。该系统代表了一种生物材料设计平台，提供 体外 优化前直接转换为 体内 模型
本文内容
摘要
摘要
丝素蛋白薄膜是一种有前景的蛋白质基生物材料，可在实验室环境中高保真且经济地制备 1,2 这些材料具有理想的特性，因其具备高度可控的尺寸和材料特性，具有良好的生物相容性并能促进细胞黏附，可通过表面拓扑结构图案化或化学修饰表面进行功能化改造，并可作为生物活性分子的储库，用于药物递送相关应用。 3-8 此外，丝素蛋白薄膜相对易于定制设计，可设计为在几分钟内溶解或在数年内逐渐降解。 体外 或 体内，并且由于其本质上具有透明性，因而特别适用于成像应用 9-13该培养系统方法为细胞-丝素膜表面相互作用的快速评估提供了一种可扩展的技术途径。尤其值得关注的是，利用表面图案化丝素膜研究细胞增殖差异及细胞对取向的响应特性。 12,14 将接种的细胞培养物分别培养在微图案化和无图案的丝素蛋白薄膜基底上，随后通过延时相差显微成像、扫描电子显微镜以及代谢活性和核酸含量的生化检测进行评估。综上所述，该丝素蛋白薄膜 体外 培养系统提供了一种可定制的实验平台，适用于研究细胞与生物材料基底表面相互作用，进而可对其进行优化并转化为实际应用 体内 模型。目前，利用本文所述培养系统进行的观察正被应用于从基础细胞相互作用到医疗器械设计等多个领域，因此与广泛的生物医学领域相关。
方案
1. 硅橡胶模具的制备
- 制备或购买用于浇铸的所需拓扑表面。本出版物中将描述一种标准的100 mm蚀刻硅片（图1）。
- 按照所购试剂盒提供的说明，以1:9的比例称取聚二甲基硅氧烷（PDMS）封装剂（组分A）和催化剂（组分B）溶液（9 g封装剂和1 g催化剂）。
- 充分混合溶液以启动固化过程。
- 将硅片表面置于浇铸皿中。
- 在硅片表面称取4.5 g PDMS溶液。
- 将PDMS溶液铺展，覆盖硅片表面直径为100 mm的区域。
- 倾斜硅片以使PDMS溶液均匀铺展。
- 用直径为100 mm的培养皿盖覆盖硅片。
- 将浇铸装置放入60 °C烘箱中过夜，确保其在平坦表面上进行固化。
- 在取出前，将固化的PDMS/硅片放入70%乙醇浴中。
- 使用刀片先撬起边缘（整个圆周）开始从硅片上剥离PDMS。
- 在70%乙醇浴中用镊子轻轻将PDMS剥离，注意不要撕裂硅橡胶铸件。
- 使用14 mm打孔器冲出单个PDMS模具。该直径设计用于适配24孔板系统。
2. 蚕丝溶液的制备
- 在玻璃烧杯中将 2 L 去离子水（dH2O）加热至沸腾7。
- 将 5 g Bombyx mori 家蚕茧切成三等份。
- 若蚕茧内表面附着大量昆虫残渣，表明污染严重，应予以丢弃。
- 称取 4.24 g 碳酸钠。
- 将碳酸钠缓慢加入沸腾的 dH2O 中，防止水沸腾溢出，并在继续操作前确保其完全溶解。
- 将蚕茧碎片加入沸腾的 dH2O 中，持续煮沸 40 分钟，并使用聚四氟乙烯涂层搅拌子在煮沸过程中搅拌蚕茧。
- 煮沸后，小心将 dH2O 倒入水槽，并用手挤干丝素提取物以去除多余水分。
- 将丝素提取物在 1 L dH2O 中于实验烧杯中洗涤三次，每次 20 分钟，并使用搅拌子使烧杯内液体循环。
- 洗涤后，用手挤干丝素提取物，并将丝纤维提取物置于化学通风橱中，干燥 12 小时。
- 次日，称量干燥后的丝纤维，通常约为 ~3.5 g：___________-g
- 配制 9.3 M LiBr 溶液，用于制备 20% w/v 的丝素溶液。使用以下公式计算所需质量与体积：
- （第 10 步所得丝素提取物质量）×（4）= ___________-mL 总 9.3 M LiBr 溶液体积
- [(807.705) × (11.a 部分所得 LiBr 体积)] / 1000 = ___________ g 需加入 dH2O 的 LiBr 质量
- 将称量好的 LiBr 加入以下体积的 dH2O 玻璃烧杯中：
- （0.8）×（第 11.a 步计算体积）= ___________ mL dH2O
- 将该溶液倒入适当大小的量筒中，并加水至第 11.a 步计算的最终体积。
- 将丝素提取物放入烧杯中，倒入 LiBr 溶液，使用实验刮刀确保丝纤维完全浸没于 LiBr 溶液中。
- 将溶解的丝素置于 60 °C 烘箱中加热 4 小时：
开始时间：___________
结束时间：___________ - 使用适当大小的注射器吸取 12 mL 丝素溶液。在注射器末端安装 18G 针头，然后将溶液注入透析盒（3,500 分子量截留，Slide-A-Lyzer，Thermo Scientific）。填充透析盒后，用已排空的注射器抽出盒内残留空气。
- 将装有溶液的透析盒置于 1 L dH2O 中。
- 在 1 小时、4 小时、8 小时后更换 dH2O，之后每 12 小时更换一次，共更换 6 次：
- 开始：___________
- 1 小时：___________
- 4 小时：___________
- 8 小时：___________
- 12 小时：___________
- 12 小时：___________
- 12 小时：___________
- 结束：___________
- 透析结束后，用注射器缓慢从透析盒中收集丝素溶液。将溶液转移至可承受 10,000 g 离心力的离心管中。
- 在 4 °C 条件下，以 10,000 g 离心 20 分钟，重复两次。每次离心后，将上清液转移至新管中。
- 将丝素溶液储存于 4 °C 冰箱中。
- 用移液器吸取两份 0.5 mL 丝素溶液至小型称量皿中，并将称量皿置于 60 °C 干燥烘箱中 12 小时，或直至丝素溶液完全干燥。
- 称量两份样品中剩余的固体丝膜，以测定丝素溶液的重量/体积百分比蛋白浓度：
- 两份丝膜样品总质量：___________ mg
- （23.a 步所得质量）×（100）= ___________% 丝素
3. 蚕丝膜的制备与培养体系的建立
- 用透明胶带清洁PDMS铸模表面以去除灰尘。
- 通过将 PDMS 基底浸泡于 70% EtOH 中并用 dH₂O 洗涤三次来清洗2O.
- 将14 mm的PDMS模具放置于支架板上，支架板通常为24孔板盖。
- 为了生成一个 50 μm 厚膜，涂布 70 μls 使用通常为1 mL注射器尖端的液体涂布工具，在PDMS模具上涂布8%的丝素溶液 2.
- 将丝膜置于洁净的实验台面上，在150 Pa的气流压力下敞口干燥90分钟，或直至薄膜完全干燥。
- 薄膜干燥后，将整套薄膜（包括PDMS模具）放入水退火 chamber 中 >4 小时以生成不溶于水的薄膜。通常使用底部盛有水的干燥器腔室，在 25 kPa 的真空度下进行抽吸 15 .
- 从水热处理室中取出丝膜，并放置于洁净的实验台面上。
- 在35 mm培养皿中配制70%乙醇浴，将对照基质（如玻璃或塑料表面）和不锈钢环放入其中浸泡至少10分钟以灭菌。
- 用镊子将丝素蛋白膜从PDMS模具上取下，浸入70%乙醇中，然后放入预先加入1 mL 70%乙醇的24孔板中，确保图案面朝上，以利于细胞黏附。
- 将每片丝素膜样品放入相应的孔中后，在其上方放置不锈钢环形重物（内径 11.65 mm，外径 15.45 mm，厚度 1.18 mm）。
- 让带环的样品孵育10分钟，以确保无菌。
- 去除乙醇，每份样品用 1 mL PBS 洗涤 3 次，每次静置 5 分钟，以确保充分扩散。
- 使用抽吸玻璃移液管去除 PBS，同时确保除去丝素蛋白薄膜样品下方的大部分气泡。
- 准备细胞系以进行接种。以人角膜缘上皮细胞系（HCLE）为例，使用0.25%胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）溶液消化7分钟。加入与胰蛋白酶溶液等体积的含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）传代培养基以终止胰蛋白酶消化。将消化后的HCLE细胞离心，向细胞沉淀中加入8 mL无血清角质形成细胞培养基（K-SFM），轻轻振荡以重悬细胞，并进行细胞计数。
- 样本 500 μL 每孔加入 HCLE 悬浮液，通常为 10,000 个细胞/cm²2 密度
- 将培养物置于培养箱中 37 °C 和 5% CO2 并运行所需的实验方案。
4. 代表性结果
图1. 流程图，展示蚕丝膜制备及培养系统构建的10个简要步骤。
图2. (A) 在直径为90 mm的硅晶圆上，采用标准光刻和干法刻蚀技术制备的具有21种染料阵列的图案化线条表面形貌。(B) 丝素蛋白薄膜在浇铸于PDMS模具表面后，仍保留原有的平行线条图案化特征。(C) 示意图展示所选特征尺寸设计，旨在促进细胞定向排列。(D) 丝素蛋白薄膜的横截面，显示保留的平行线条图案化表面。
图 3. HCLE 细胞系在培养第 2 天时贴附于（A）图案化和（B）平整丝素蛋白薄膜的扫描电子显微图像。到培养第 8 天时，HCLE 细胞在（C）图案化和（D）平整表面持续增殖并达到汇合状态。
图 4. (A, D, G) 图案化丝素膜、(B, E, H) 平整丝素膜与 (C, F, I) 玻璃对照基底上培养 HCLE 细胞的比较结果，分别对应培养第 (A-C) 1 天、(D-F) 4 天和 (G-I) 8 天。(J) CyQuant 核酸含量检测结果与 (K) 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）代谢活性检测结果，显示 HCLE 细胞在图案化和平整丝素膜基底上的存活力随时间变化情况，并与玻璃对照表面进行比较（比例尺 = 100 μm）。
视频 1. HCLE 细胞在图案化丝素膜表面迁移的 18 小时延时相差成像。细胞以 10k/cm2 的密度接种，培养 2 小时后开始成像。点击此处观看视频。
视频 2. HCLE 细胞在 TCP 对照平面表面迁移的延时相差显微成像，时间跨度为 18 小时。细胞以 10k/cm2 的密度接种，培养 2 小时后开始成像。点击此处观看视频。
讨论
过去二十年中，由于对这种蛋白质材料特性的广泛表征及其生物材料应用价值的深入理解，再生丝素膜作为细胞培养基底的应用日益普及 3,8 . 此处所述的培养系统代表一种新型 体外 用于评估细胞在图案化丝素蛋白薄膜生物材料基底上表面相互作用的测试系统 7 该系统能够对细胞相互作用进行随时间推移的深入分析，并可轻松应用于高通量数据采集。这在很大程度上得益于丝素蛋白薄膜具有一系列可调控的生物材料特性，可通过修饰以直接影响细胞功能。 8,9,12，包括：表面微/纳米级形貌的控制 7；通过共价修饰或生物活性分子的吸附实现多种表面化学性质 13；优异的机械性能 15,16；材料亲水性/疏水性的调控 16 ；生物化合物的大规模加载以用于释放 4,8,17 ；并通过调控二级结构（β片层含量）控制其溶解/酶解速率 11,18,19 .
通过在真空条件下并存在水蒸气的环境中对丝素膜进行一段时间的退火处理，可实现其透明性7,15。该加工方法可促进β-片层二级结构的形成，使材料在水中不溶的同时对光的衍射最小化15。这种膜的透明性对于实现直接的活细胞成像至关重要，可在多种成像模式（如宽场成像和荧光成像）下，结合多种显微镜系统进行应用12,20。除了活细胞成像外，丝素膜还可方便地从培养体系中取出，以便进行后续的固定和其他分析。因此，该系统适用于多种细胞/组织来源，并可广泛应用于多个技术领域中的多种直接实验评估3,8,9,12,13,21。延时成像结果展示了如何采集实时培养数据，并以实例说明了表面形貌如何影响细胞相互作用。代表性结果展示了丝素膜生物材料可用于支持HCLE细胞的培养生长，并适用于多种标准的细胞增殖和代谢检测方法（图4）。此外，培养物还可进行固定并用于扫描电子显微成像或其他实验流程（图3）。
丝素膜基底可在实验室中以高保真度、高一致性和相对较低的成本制备（图1）。这使得培养系统的构建和实验结果均具有良好的可重复性。已有研究表明，通过水退火处理所制备的丝素膜材料在培养环境中具有稳定的性能，其降解速率取决于溶液中蛋白酶的浓度，因而具有明确可控的降解特性2,15,22。因此，这类材料可用于长期细胞培养，或根据植入部位的生理环境在体内留置数月甚至数年8。此外，近期研究显示，经水退火处理的丝素膜在蛋白结构和材料性能方面具有良好的批次间一致性，多种力学和生物物理检测方法已证实其可实现可重复的细胞培养结果15,16。同时，扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）以及细胞培养研究结果均表明，不同批次丝素膜材料的表面形貌具有高度一致性{Lawrence:2008wr, Omenetto:2008tc, Bray:2011kq}7,23,24。材料的稳定性与一致性是影响细胞通过各种机械转导通路感知培养基底的关键因素，并最终决定细胞产生预期或非预期的生物学响应25,26。
传统的细胞培养基质标准，如经组织培养处理的塑料或玻璃，可为细胞贴附提供足够的支持。然而，这些材料难以进行进一步的功能化改造以拓展其应用。 体内可以设想，丝素蛋白薄膜生物材料可被定制化 体外，一旦达到实验预期，定制的薄膜便可直接转化为 体内 模型。这种成对设计在 体外 和 体内 实验为这类可植入的丝素蛋白生物材料提供了显著优势，相较于其他常规使用的基底材料而言 体外.
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 K08EY015829、R21EY019561、R24EY015656、P41 EB002520 和 R01 EY020856，同时获得“防盲研究”职业发展奖以及三机构干细胞计划的支持。HCLE 细胞系由 Ilene Gipson 博士惠赠。作者谨此感谢康奈尔大学威尔医学学院的 Aihong Liu 博士在细胞培养方面的技术支持与指导，特殊外科医院的 Anthony Labissiere 在扫描电镜成像方面的技术协助，塔夫茨大学组织工程资源中心（TERC）在材料开发方面的技术支持，以及康奈尔纳米尺度科学与技术中心（CNF）在硅晶圆制造方面的协助。
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