吸血鬼式分离细胞外液 秀丽隐杆线虫

摘要

模式生物 C. elegans 利用假体腔液作为被动循环系统。此前尚无法对此液体进行直接检测。本文介绍一种直接检测细胞外空间的新技术，并以RNAi反应中的系统性沉默信号作为原理验证示例。

摘要

模式生物秀丽隐杆线虫（C. elegans）因其世代周期短、易于培养且体型微小，已成为研究众多生物学问题的重要遗传学模型。然而，其微小体型也限制了某些在其他模式系统中常用的技术手段的应用。例如，哺乳动物中的输血技术以及植物中的嫁接技术，均可用于研究循环系统的组成与信号传递。直到最近，线虫的循环系统——假体腔液——仍无法被直接检测。为了探究细胞间信号传递及循环系统组成，C. elegans 研究人员传统上依赖遗传分析、细胞/组织特异性挽救实验以及嵌合体分析。这些技术虽可间接推断细胞间的相互作用，但在细胞外分子的鉴定与表征方面并非普遍适用。本文介绍一种新近开发的技术，可直接提取并检测 C. elegans 的假体腔液。该技术首先通过遗传或物理手段增加细胞外液体积，随后采用一种类似“吸血”的逆向显微注射技术，利用具备精细压力调控功能的显微注射装置从线虫体内回收液体。在分离获得细胞外液后，可通过将其转移至其他个体或采用分子生物学方法进行检测。为验证该技术的有效性，本文详细展示了一个具体应用实例：在系统性RNA干扰（RNAi）反应中检测特定的细胞外信号分子——长链双链RNA（long dsRNA）。尽管系统性RNAi的表征仅作为原理验证示例，但我们认为该技术可广泛适用于探究循环系统组成与信号传递的多种科学问题。

方案

1. 材料准备

进行吸血鬼反向显微注射所需的材料与用于制备转基因C. elegans品系的标准显微注射技术所需材料相似¹。尽管某些试剂（例如实验用培养板）可在实验转移当天制备，但许多材料必须在8天内协调准备（参见表1中的时间安排）。因此，使用该技术时，必须提前周密规划（所需试剂和设备见表2）。

注射垫：

1. 在 H₂O 中配制 2% 琼脂糖溶液，加热至完全溶解。将溶液分装至 1.5 mL 微量离心管中，每管 1 mL，4 °C 保存。
2. 将 22 × 50 mm 盖玻片平铺于实验台面，使其边缘略微伸出实验台边缘，以便快速取用。
3. 用图钉在微量离心管盖上扎一个小孔，以利于排气。将该管放入盛有约 5 mL 水的 15 mL 烧杯中，微波加热至琼脂糖完全融化（约 35 秒）。
4. 使用巴斯德吸管和吸球吸取一滴融化的琼脂糖（约 35 μL），滴加于一张盖玻片上，立即以 90° 角将另一张盖玻片覆盖于液滴之上。对其他多张盖玻片重复此操作。
5. 待琼脂糖完全凝固后，取下盖玻片，将凝胶垫置于空气中彻底干燥过夜（若需加快干燥，可将载片置于 50–80 °C 烤箱中 15–30 分钟）。
6. 制备好的凝胶垫可....

讨论

本文介绍了一种新颖的方法，可实现对模式生物 C. elegans 的细胞外液进行分离与表征。该技术首先通过遗传或物理手段操控供体蠕虫，以增加其细胞外液的总体积。随后采用改良的显微注射技术分离细胞外液。在进行显微注射时，将蠕虫固定在干燥的琼脂糖垫上以保持其在操作过程中的稳定。蠕虫通过干燥垫的脱水作用产生的静水压力实现物理固定。这带来了一定挑战，因为一旦蠕虫被固定，其体内可用的细胞外水分便开始从供体动物中流失，因此必须迅速操作。对部分实验人员而言，可将蠕虫悬浮于注射垫上的矿物油中，但避免其直接接触垫面，可能更为有利。在将注射垫置于显微镜下并对齐蠕虫与注射针后，需等待蠕虫自行接触垫面并完成“自我固定”。此外，尽管在常规显微注射过程中可直接将蠕虫物理放置于琼脂糖垫上，但我们发现，施加的物理固定力会显著加速供体蠕虫的脱水过程。最佳操作方式是将供体蠕虫在矿物油中拾取，并将挑虫针的尖端靠近垫面，使蠕虫自行爬离挑虫针完成转移。

除了操作迅速外，还必须规范地进行 vampiric 分离技术，以避免感染。将通常无害的细菌引入角质层内会导致持续且致命的感染。正确的操作技术可完全避免.......