小鼠内耳是一种由外胚层生发层（placode）衍生而来的感觉器官，其发育程序在胚胎发育期间逐步展开。我们定义了一种 在子宫内 基因转移技术，包括三个步骤：小鼠腹部剖腹术、经子宫显微注射和 体内 电穿孔。我们使用数字视频显微镜来演示关键的实验胚胎学技术。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
哺乳动物内耳具有6个不同的感觉上皮：半规管壶腹中的3个壶腹嵴；椭圆囊和球囊中的位觉斑；以及盘绕的耳蜗中的柯蒂氏器。壶腹嵴和位觉斑含有前庭毛细胞，可将机械刺激转换为神经信号，以实现平衡觉这一特殊感觉功能，而柯蒂氏器中的听觉毛细胞则是听觉的主要感受器。 1细胞命运在这些感觉上皮中的特化以及半规管和耳蜗的形态发生过程发生在小鼠妊娠的第二周，并在出生前基本完成。 2,3. 通过在不同胚胎期或出生后阶段获取转基因小鼠胚胎，以研究小鼠内耳的发育过程，从而揭示细胞和（或）形态学表型的分子基础，此类研究已成常规 4,5我们假设将基因转移至发育中的小鼠内耳 在子宫内 在功能获得和功能缺失研究背景下，该方法代表了传统小鼠转基因技术的一种补充手段，可用于探究哺乳动物内耳发育的遗传机制6.
本文所展示的小鼠内耳发育过程中进行基因异位表达研究的实验范式可分为三个基本步骤：1）腹侧剖腹术；2）经子宫显微注射；以及3）体内电穿孔。腹侧剖腹术是一种小鼠存活手术技术，可将子宫外置，从而获得对植入胚胎的实验操作通路7。经子宫显微注射是指利用斜面玻璃毛细管微量移液器，将表达质粒注入耳泡或听囊腔内。体内电穿孔则是施加方波直流脉冲，促使表达质粒进入前体细胞8-10。
我们此前已描述过这种基于电穿孔的基因转移技术，并对实验方案的每一步提供了详细说明11小鼠实验胚胎学技术仅通过文字和静态图像学习可能较为困难。在本研究中，我们展示了基因转移操作的三个步骤。尤为重要的是，我们采用数字视频显微技术，精确演示以下操作：1）识别胚胎方位 在子宫内；2）调整胚胎方向，以便将注射靶向耳囊；3）在胚胎发育第11.5天和12.5天时，将混合示踪染料的DNA溶液微量注射至耳囊；4）对注射后的耳囊进行电穿孔；5）在出生时标记经电穿孔处理的胚胎，以便进行出生后的筛选。我们提供了成功转染内耳的代表性实例；给出了耳囊注射错位常见原因的图解指南；讨论了如何避免常见的方法学错误；并提出了撰写相关实验方案的指导建议 在子宫内 基因转移动物护理方案
方案
1. 腹部正中开腹术
- 通过腹腔注射戊巴比妥钠麻醉液（每克体重 7.5 μL）对胚胎处于胚胎第 11.5 天（E11.5；检测到阴道栓的当天中午为胚胎发育第 0.5 天）的孕鼠进行麻醉。工作麻醉液配制：180 μL 的 50 mg/mL 戊巴比妥钠溶液；100 μL 无水乙醇；320 μL 的 65 mg/mL 硫酸镁水溶液（调节子宫张力）；以及 400 μL 丙二醇（可与水相和有机组分混溶的溶剂）。
- 通过施加有害刺激测试评估麻醉是否完全：挤压足掌、夹捏尾巴，以及触碰面颊和触须时的眨眼反应。将无菌眼用软膏涂抹于角膜上。
- 使用剪刀和精细刀片（Oster #40 刀头）剃除从耻骨联合至肋骨区域的腹部毛发。依次使用 70% 乙醇、10% 聚维酮碘（Betadine）和 70% 乙醇对腹部进行消毒。将小鼠腹部朝下置于无菌手术巾上，然后放置于加热垫或温控板（37 °C）上 2-5 分钟。
- 使用圆头剪刀沿腹中线切开腹部皮肤，切口长度为 10-14 mm。辨认腹壁腹中线上无血管的白色结缔组织带——linea alba。用圆头剪刀切开linea alba，并将切口延长至 10-14 mm。立即用预热（37 °C）的乳酸林格液冲洗腹腔。
- 使用环形镊子将子宫的两个角轻轻拉出体外，注意避免对植入部位施加过大压力。用预热的乳酸林格液冲洗暴露在外的子宫角。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
将基因转移至发育中的小鼠内耳 小鼠内耳在植入后发育的第一周内由耳基板发育而来12,13在胚胎第9.5天（E9.5），该原基已内陷并转变为一个充满液体的囊泡，称为耳囊。2耳囊中的耳源性前体细胞会分化为成熟内耳中的感觉细胞和非感觉细胞，以及支配前庭和听觉感觉上皮中机械敏感性毛细胞的神经元。至胚胎晚期，内耳膜迷路复杂的三维形态结构已基本形成。3,12增益与缺失功能实验通常通过小鼠转基因技术来实现，以深入了解发育过程中细胞命运决定和模式形成等遗传调控机制。小鼠内耳发育过程中的动态遗传操作 在子宫内 代表了一种与小鼠转基因技术相辅相成的方法，该方法将基因转移技术与小鼠实验胚胎学相结合6,11.
病毒介导和电穿孔介导的基因转移技术已用于调控发育中内耳的基因表达6,11,14,15腺相关病毒（AAV）载体可感染耳源性前体细胞，这些前体细胞可分化为感觉性与非感觉性细胞类型，并已被用于探究小鼠毛细胞中钙依赖性胞吐作用的分子基础1.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢Humana Press授权我们发表最初出现在参考文献11第130页的显微注射移液管制备示意图；感谢俄勒冈健康与科学大学（OHSU）教育传播部的Larry Dlugas和Steven Wong提供视频拍摄；感谢Larry Dlugas进行视频设计与剪辑；感谢Trion/Envirco高级设计师Adam M. O'Quinn为我们设计定制的水平层流罩，以及Les Goldsmith提供技术示意图；感谢OHSU比较医学部的Victor Monterroso（MV，MS，PhD）和Tom Chatkupt（DVM）在动物护理方案、外科手术技术及预防性镇痛方案方面提供的指导；感谢Marcel Perret-Gentil（DVM，MS）分享其关于兽医缝合技术的手册资料；感谢Edward Porsov（MS）设计用于视频显微镜的Adobe Premiere Pro计算机工作站；并感谢LNS字幕公司（俄勒冈州波特兰市）的Leah White和Jonas Hinckley。本研究得到了国家耳聋及其他沟通障碍研究所资助项目的资助：DC R01 008595 和 DC R01 008595-04S2（授予JB），以及P30 DC005983（俄勒冈听力研究中心核心资助，Peter Gillespie为首席研究员）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微型灭菌盒 | Roboz外科器械公司 | RS-9900a | 8×8.5×1.25 英寸 |
| 球头剪刀 | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| 环形钳 | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8 mm 内径/6 mm 外径 |
| Adson 组织镊 | 精细科学工具 | 11027-12 | |
| 持针器 | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| 过敏原注射器托盘 | BD 生物科学 | 305536 | |
| 6-0 缝合线 | Syneture | GL-889 | 0.7 号胃肠缝合线 |
| 乳酸林格液’s 注射剂 USP | Baxter Internationl Inc. | 2B2323 | |
| 快绿 | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | 哈佛仪器 | 30-0053 | |
| 戊巴比妥钠溶液 | OVATION Pharmaceuticals | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO₄·7H₂O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| 丙二醇 | Fisher Scientific | P355-1 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023-500 | |
| 美洛昔康 | Boehringer Ingelheim | NADA 141-219 | |
| 微移液管拉制仪 | Sutter Instrument Co. | P-97 | FB255B 盒式灯丝；请参考 Sutter 仪器公司的移液器制作手册 |
| 显微技术–电极斜面修整器 | Sutter Instrument Co. | BV-10 | 用于大口径移液管的104C斜面磨盘；请咨询所有者’斜面理论手册 |
| 微量移液器架 | Warner Instruments | MP-S15T | 适用于1.5 mm外径移液管及Picospritzer管路用雌性压力接口。 |
| 镊子式电极 | Protech International, Inc. | CUY650P5 | 5 mm 外径 |
| 方波电穿孔仪 | Protech International, Inc. | CUY21EDIT | 建议使用脚踏板 |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | 建议使用脚踏板 |
| 手动控制显微操作器 | 哈佛仪器公司 | 640056 | |
| 水平层流洁净工作台 | Envirco | 对 LF 630-10554 进行定制修改。通风柜示意图详见补充信息。 | |
| Leica 体视荧光解剖显微镜，配备 Lumencor SOLA 光源引擎 | 巴特尔斯与斯托特以及Lumencor | MZ10F 配备 Lumencor SOLA 光源引擎 | 建议使用脚踏板来调节 MZ10F 的焦距并触发 SOLA 光源引擎 |
| Alexa Fluor 594 葡聚糖 | Invitrogen | D22913 | 10 mg/ml，水溶液 |
| Alexa Fluor 488 葡聚糖 | Invitrogen | D22910 | 10 mg/ml，水溶液 |
| Enviro-dri | 谢泼德特种纸业 | www.ssponline.com |
参考文献
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
