方法文章

将基因转移至发育中的小鼠内耳 体内 电穿孔

DOI：

10.3791/3653

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2012年6月30日

 ,  , 
1Oregon Hearing Research Center, Oregon Health & Science University

本文内容

摘要

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小鼠内耳是一种由外胚层基板发育而来的感觉器官，其发育程序在胚胎发育期间逐步展开。我们定义了一种 在子宫内 基因转移技术，包括三个步骤：小鼠腹部剖腹术、经子宫显微注射和 体内 电穿孔。我们使用数字视频显微镜来演示关键的实验胚胎学技术。

摘要

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哺乳动物的内耳具有6个不同的感觉上皮：位于半规管壶腹内的3个壶腹嵴；位于椭圆囊和球囊内的位觉斑；以及位于盘绕的耳蜗内的柯蒂氏器。壶腹嵴和位觉斑中含有前庭毛细胞，可将机械刺激转换为神经信号，以实现平衡觉这一特殊感觉功能；而柯蒂氏器中的听觉毛细胞则是听觉的主要感受器。 1细胞命运在这些感觉上皮中的特化以及半规管和耳蜗的形态发生过程发生在小鼠妊娠的第二周，并在出生前基本完成。 2,3小鼠内耳的发育研究通常通过在不同的胚胎期或出生后阶段获取转基因胚胎，以深入了解细胞和/或形态学表型的分子基础。 4,5我们假设将基因转移至发育中的小鼠内耳 在子宫内 在功能获得和功能缺失研究背景下，该方法代表了传统小鼠转基因技术的一种补充手段，可用于探究哺乳动物内耳发育的遗传机制6.

本文所展示的小鼠内耳发育过程中进行基因异位表达研究的实验范式可分为三个基本步骤：1）腹侧剖腹术；2）经子宫显微注射；以及3）体内电穿孔。腹侧剖腹术是一种小鼠存活手术技术，可将子宫外置，从而获得对植入胚胎的实验操作通路7。经子宫显微注射是指利用斜面玻璃毛细管微量移液器，将表达质粒注入耳泡或听囊的腔内。体内电穿孔则是施加方波直流脉冲，促使表达质粒进入前体细胞8-10。

我们此前已描述过这种基于电穿孔的基因转移技术，并对实验方案的每一步提供了详细的说明11。小鼠实验胚胎学技术仅通过文字和静态图像难以掌握。在本研究中，我们展示了基因转移操作的三个关键步骤。尤为重要的是，我们采用数字视频显微技术，精确演示了以下操作：1）在体内识别胚胎的方向；2）重新调整胚胎方向，以便将注射靶向耳囊；3）在胚胎发育第11.5天和12.5天时，将混合示踪染料的DNA溶液微量注射至耳囊；4）对注射后的耳囊进行电穿孔；5）对电穿孔的胚胎进行标记，以便在出生后筛选。我们提供了成功转染内耳的代表性实例；给出了耳囊注射错位最常见原因的图解指南；讨论了如何避免常见的方法学错误；并提出了撰写在体基因转移动物护理方案的指导原则。

方案

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1. 腹部正中开腹术

  1. 通过腹腔注射戊巴比妥钠麻醉液（每克体重 7.5 μL）对胚胎处于胚胎第 11.5 天（E11.5；检测到阴道栓的当天中午为胚胎发育第 0.5 天）的孕鼠进行麻醉。工作麻醉液配制：180 μL 的 50 mg/mL 戊巴比妥钠溶液；100 μL 无水乙醇；320 μL 的 65 mg/mL 硫酸镁水溶液（调节子宫张力）；以及 400 μL 丙二醇（可与水相和有机组分混溶的溶剂）。
  2. 通过施加有害刺激测试评估麻醉是否完全：挤压足掌、夹捏尾巴，以及触碰面颊和触须时的眨眼反应。在角膜上涂抹无菌眼用软膏。
  3. 使用剪刀和精细刀片（Oster #40 刀头）将腹部毛发从耻骨上区剃至肋骨区域。依次用 70% 乙醇、10% 聚维酮碘（贝塔碘）和 70% 乙醇对腹部进行消毒。将小鼠腹部朝下置于无菌手术巾上，然后放在加热垫或温控板（37 °C）上预热 2–5 分钟。
  4. 使用圆头剪刀沿腹侧正中线切开腹部皮肤，切口长度为 10–14 mm。辨认腹壁腹侧正中线上无血管的白色结缔组织带——白线（linea alba）。用圆头剪刀切开白线（linea alba），并将切口延长至 10–14 mm。立即用预热至 37 °C 的乳酸林格氏液冲洗腹腔。
  5. 使用环形镊子将子宫的两个角轻轻拉出体外，注意避免对植入部位施加过大压力。用预热的乳酸林格氏液冲洗暴露在外的子宫角。
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讨论

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将基因转移至发育中的小鼠内耳 小鼠内耳在植入后发育的第一周内由耳基板发育而来12,13至胚胎第9.5天（E9.5），该原基已内陷并转变为一个充满液体的囊泡，称为耳囊。2耳囊中的耳源性前体细胞会发育为成熟内耳中的感觉细胞和非感觉细胞，以及支配前庭和听觉感觉上皮中机械敏感性毛细胞的神经元。至胚胎晚期，内耳膜迷路复杂的三维形态已基本形成。3,12增益与缺失功能实验通常通过小鼠转基因技术来实现，以深入了解发育过程中细胞命运决定和模式形成等遗传调控机制。小鼠内耳发育过程中的动态遗传操作 在子宫内 代表了一种与小鼠转基因技术相辅相成的方法，该方法将基因转移技术与小鼠实验胚胎学相结合6,11.

病毒介导与电穿孔介导的基因转移技术已用于调控发育中内耳的基因表达6,11,14,15腺相关病毒（AAV）载体可感染听觉前体细胞，这些前体细胞可分化为感觉细胞和非感觉细胞类型，并已被用于研究小鼠毛细胞中钙依赖性胞吐作用的分子基础16

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披露

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未声明任何利益冲突。

致谢

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感谢Humana Press授权我们发表最初出现在参考文献11第130页的显微注射移液管制备示意图；感谢OHSU教育传播部的Larry Dlugas和Steven Wong提供视频拍摄；感谢Larry Dlugas进行视频设计与剪辑；感谢Trion/Envirco高级设计师Adam M. O'Quinn为我们设计定制的水平层流罩，以及Les Goldsmith提供技术示意图；感谢OHSU比较医学部的Victor Monterroso（MV，MS，PhD）和Tom Chatkupt（DVM）在动物护理方案、外科手术技术及预防性镇痛方案方面提供的指导；感谢Marcel Perret-Gentil（DVM，MS）分享其关于兽医缝合技术的手册资料；感谢Edward Porsov（MS）设计我们的Adobe Premiere Pro视频显微镜计算机工作站；并感谢LNS字幕公司（俄勒冈州波特兰市）的Leah White和Jonas Hinckley。本研究得到了国家耳聋及其他沟通障碍研究所资助项目的资助：DC R01 008595和DC R01 008595-04S2（授予JB）以及P30 DC005983（俄勒冈听力研究中心核心资助，Peter Gillespie为首席研究员）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Micro Sterilizing Case Roboz Surgical Instruments Co.RS-9900a8X8.5X1.25 inches
Ball-tipped scissorsFine Science Tools14109-09
Ring forceps Fine Science Tools11106-094.8mm ID/6mm OD
Adson Tissue ForcepsFine Science Tools11027-12
Needle driverFine Science Tools12502-12
Allergy Syringe TrayBD Biosciences305536
Suture 6-0SynetureGL-8890.7 metric gastrointestinal suture
Lactated Ringer’s Injection USPBaxter Internationl Inc.2B2323
Fast greenSigma-AldrichF7258
Borosilicate glass capillaryHarvard Apparatus30-0053
Nembutal Sodium SolutionOVATION PharmaceuticalsNDC 67386-501-52
MgSO4.7H2OFisher ScientificM63-500
Propylene glycolFisher ScientificP355-1
EthanolSigma-AldrichE7023-500
MeloxicamBoehringer IngeheimNADA 141-219
Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments
Micr–lectrode BevelerSutter Instrument Co.BV-10104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory
Micropipette holderWarner InstrumentsMP-S15TFor 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing.
Tweezers-style electrodeProtech International, Inc.CUY650P55 mm outer diameter
Square Wave ElectroporatorProtech International, Inc.CUY21EDITFootpedal recommended
PICOSPRITZER IIIParker Hannifin Corporation051-0500-900Footpedal recommended
Manual Control MicromanipulatorHarvard Apparatus640056
Horizontal laminar flow clean benchEnvircoCustom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic.
Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engineBartels and Stout and LumencorMZ10F with Lumencor SOLA light engineFootpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended
Alexa Fluor 594 DextranInvitrogenD2291310mg/ml, aqueous
Alexa Fluor 488 DextranInvitrogenD2291010mg/ml, aqueous
Enviro-driShepherd Specialty Paperswww.ssponline.com

参考文献

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  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
  3. ....

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