使用干扰素-γ酶联免疫斑点试验表征人乳头瘤病毒新型T细胞表位

摘要

对引起局部感染的病原体（如人乳头瘤病毒）的T细胞表位进行表征具有挑战性，原因是循环中的T细胞数量有限。本文描述了一种方法，该方法从极少量细胞开始，分离并表征稀有的T细胞。

摘要

已开发出一种实验方案，用于克服分离和表征针对引起局部感染病原体（如人乳头瘤病毒（HPV））的稀有T细胞所面临的困难。该方案包括：确定来自受试者体内HPV蛋白中包含T细胞表位的区域，根据干扰素-γ（IFN-γ）的分泌情况筛选出肽特异性T细胞，并培养和表征T细胞克隆（图1）。受试者1是一名近期经活检确诊为高级别鳞状上皮内病变，并在采集T细胞当天接受了环形电切术治疗的患者¹。通过使用重叠合成肽进行干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫斑点（ELISPOT）检测，鉴定出人乳头瘤病毒16型（HPV 16）E6和E7蛋白中包含T细胞表位的区域（图2）。该检测结果不仅用于确定含有T细胞表位的区域，还用于估算表位特异性T细胞的数量，并利用市售磁珠（CD8 T细胞分离试剂盒，Miltenyi Biotec，Auburn CA）根据IFN-γ的分泌情况分离这些细胞。将筛选出的IFN-γ分泌型T细胞进行稀释后，单个接种于含有经辐照的饲养细胞混合物的培养体系中，以支持每个孔中单个T细胞的生长。随后使用IFN-γ ELISPOT检测对这些T细胞克隆进行筛选，检测时加入覆盖已鉴定区域的肽段以及自体EB病毒转化的B淋巴母细胞样细胞系（LCLs，制备方法参见Walls和Crawford的描述）²，以最大限度减少所需T细胞克隆的数量。与ELISPOT检测中通常使用的每孔1×10⁵个细胞相比^1,3，本实验仅使用1,000个T细胞克隆细胞与1×10⁵个自体LCLs共培养，显著减少了所需T细胞克隆的数量。自体LCLs不仅能够向T细胞克隆呈递肽抗原，还能维持孔内较高的细胞密度，从而促进表位特异性T细胞克隆分泌IFN-γ，确保IFN-γ ELISPOT检测的成功进行。同样，利用IFN-γ ELISPOT检测进一步确定了CD8 T细胞表位（HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY）的最小及最优氨基酸序列及其HLA I类限制性分子（B58）。此外，还使用表达HPV 16 E6或E7蛋白的痘苗病毒感染的自体LCLs进行IFN-γ ELISPOT检测，结果显示该E6 T细胞表位可在细胞内源性加工处理。实验还证实了该T细胞表位对其他高危型HPV同源表位的交叉识别能力。该方法也可用于描述CD4 T细胞表位⁴。

方案

通过使用从受试者1建立的CD8 T细胞系进行IFN-γ ELISPOT实验，确定HPV 16 E6 46-70区域含有T细胞表位¹（图2），并且在启动本方案之前，已根据IFN-γ的分泌情况筛选出表位特异性的T细胞（图1）。

1. 表位特异性T细胞的有限稀释

1. 使用含1%混合人血清的完全Yssel培养基，将经照射（4,000 rad）的同种异体外周血单个核细胞（PBMCs）以5 × 10⁵ 个细胞/ml、经照射（5,000 rad）的同种异体LCLs以5 × 10⁴ 个细胞/ml，以及植物血凝素（PHA）以0.1 μg/ml的浓度混合，制备饲养细胞混合物。整个实验过程中，细胞操作均需在无菌条件下进行。
2. 用上述饲养细胞混合物对分离得到的表位特异性T细胞（图3）进行连续稀释，直至浓度达到0.5个细胞/100 μl或5个细胞/1 ml。总共使用约3 × 10³ 个表位特异性T细胞。
3. 使用多通道移液器，将稀释后的表位特异性T细胞以100 μl/孔的体积加入总计30至60块96孔圆底培养板中。
4. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。
5. 第5天，向每孔加入100 μl含....

讨论

传统上，免疫学家通过在体外（in vitro）刺激感兴趣的T细胞，并进行极限稀释实验以分离出表位特异性的T细胞克隆，从而鉴定新的T细胞表位。随后使用铬释放实验对T细胞克隆进行表征^8,9。然而，许多尝试均未成功，原因可能是T细胞频率过低而无法分离，或可用于完成表征的T细胞克隆数量不足。本文所述方法通过以下方式克服了这些限制：（1）评估是否存在足够数量的感兴趣T细胞；（2）基于干扰素-γ（IFN-γ）的分泌情况富集目标T细胞，提高其频率；（3）采用ELISPOT实验，将自体淋巴母细胞样细胞系（LCLs）与T细胞克隆共同接种，从而仅需少量T细胞克隆细胞即可完成分析。图2展示了一个ELISPOT实验的示例，该实验不仅用于确定潜在T细胞表位所在的区域，还可用于评估表位特异性T细胞的频率。通过从目标区域的斑点形成单位数中减去无肽阴性对照的斑点形成单位数，即可估算出表位特异性T细胞的数量。将该频率乘以仍可用于分析的细胞数，即可得到表位特异性T细胞的估计总数。根据我们的经验，若该数值≥2,500个细胞，则值得继续后续实验。随后可使用市售的磁分离试剂盒，基于IFN-γ的分泌情况分离.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD8 T细胞分离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-094-156
植物血凝素	Remel, Thermo Fisher Scientific	R-30852801	2mg/瓶
Yssel’s 培养基	Gemini Bio Products	400-102	含1%混合人血清
96孔圆底培养板	BD Biosciences	08-772-17
重组人IL-2	R&D Systems	202-IL-050	50μg
24孔培养板	Corning	07-200-84
磷酸盐缓冲液	Cellgro	MT-21-031-CV
抗IFN-γ单克隆抗体（D1K）	Mabtech	3420-3-1000
生物素标记的抗IFN-γ单克隆抗体（7B-6）	Mabtech	3420-6-1000
多孔HA ELISPOT板	EMD Millipore	MAHA S45 10
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650	100 ml 瓶装
混合人血清	Atlanta Biologicals	S40510H	需热灭活
RPMI 1640培养基	Cellgro	MT-10-040-CV
吐温-20	Sigma-Aldrich	P2287-100ml
Vectastain Elite ABC试剂盒	Vector Laboratories	NC9313719
稳定型二氨基联苯胺	Open Biosystems	MBI 1241
AID EliSpot Reader Classic	Autoimmun Diagnostika GmbH	ELR06