感觉传入神经纤维在啮齿类动物脊髓中的刻板投射为研究轴突分支提供了一个易于接触的实验系统，可通过单根轴突的示踪来实现。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍一种利用脂溶性示踪剂高氯酸1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青（DiI）通过弥散染色标记少量背根神经节（DRG）神经元在胚胎脊髓中轴突轨迹的技术1。通过比较野生型小鼠与基因突变小鼠品系中轴突通路的差异，可检验候选蛋白在调控轴突分支中的功能作用，而轴突分支是神经系统神经连接形成的关键机制。轴突分支使单个神经元能够与多个靶点建立连接，从而为信息的并行处理提供结构基础。轴突生长过程中在中间靶区形成的分支可与终末分支区分开来。此外，根据分支是否由生长锥活动（分裂或延迟分支）产生，或由轴突主干侧向出芽形成侧支（称为节间分支）2，可将轴突分支的不同模式进行分类（图1）。
背根神经节（DRG）神经元的中枢投射为研究两种类型的轴突分支提供了有用的实验系统：在胚胎第10至13天（E10–E13）期间，当它们的传入轴突到达脊髓的背根进入区（DREZ）时，会表现出典型的T形或Y形分叉模式。随后，两条子代轴突分别沿脊髓背外侧边缘向头侧或尾侧延伸，经过一段等待期后，侧支才从这些主干轴突上萌发，进而穿透灰质（间歇性分支），并投射到脊髓特定板层中的中继神经元，在那里进一步形成分支（终末分支）3。DiI示踪技术揭示了在脊髓背根进入区存在正在分裂过程中的生长锥，提示轴突分叉可能是由生长锥自身分裂所致4（图2），但其他机制也已被讨论5。
本视频首先演示如何解剖 E12.5 小鼠的脊髓，保留背根神经节（DRG）附着。标本固定后，使用从毛细管拉制的玻璃针将少量 DiI 染料施加至 DRG。经过孵育步骤后，将标记的脊髓以倒置的“摊开书本”制备方式装片，以便通过荧光显微镜分析单个轴突。
方案
1. 解剖步骤
注意：小鼠的实验使用应遵循官方批准的实验动物护理与使用指南。
- 准备前，设置好解剖显微镜，并摆放解剖所需手术器械，包括大、小剪刀、大齿镊、弯头镊以及四套Dumont No.5解剖镊（其中两把为内表面抛光尖端）（具体试剂与设备详见试剂与设备表）。在100 mm Sylgard包被的培养皿中放置一张滤纸。在12孔板的各孔、100 mm培养皿及12 ml离心管中倒入冰冷的PBS，并置于冰上。在另一块12孔板的每孔中加入2 ml固定液（含4%多聚甲醛的PBS，pH 7.4），并置于冰上。
- 麻醉后，在E12.5时期处死配准妊娠母鼠（检测到阴道栓记为E0.5），将小鼠仰卧置于三层纸巾上，并用70%乙醇浸润腹部区域。
- 打开腹腔和盆腔，分离双侧子宫角，并将其转移至盛有冰冻PBS的100 mm培养皿之一中。
- 在显微镜下，用小型直剪沿子宫壁纵向剪开，将每个羊膜囊从胎盘上剪下。
- 将羊膜囊从每个胚胎上剥离，并剪断脐带。
- 使用小剪刀将胚胎头部剪下，若需进行基因分型，可将头部或其部分保留用于基因组DNA提取。随后，将躯干转移至盛有冷PBS的12孔板对应孔中。
- 用数滴PBS润湿Sylgard培养皿中的滤纸，将胚胎躯干背侧朝上放置于滤纸上。为增强稳定性，将尾部和四肢从身体向外伸展拉直。
- 在解剖显微镜下（放大倍数约16倍），用两对尖头精细镊子小心夹住胚胎脊髓上方的皮肤，轻轻撕开。从躯干中部开始，先向尾部方向操作，再回到中部，继续向前端方向撕开。
- 操作过程中，不时用两到三滴PBS润湿胚胎，防止其干燥。
- 为防止取出脊髓时背根神经节（DRG）被撕脱，在操作时应使用内表面抛光尖端的精细镊子，以水平滑动的方式将DRG及脊髓从周围的软骨性椎体结构上分离。从胚胎右侧中部开始，先向尾端推进，再向头端推进。完成后，在另一侧重复此操作。注意避免撕裂相连的DRG。
- 为完全分离已松解的脊髓，用精细镊子夹住其颈段，向尾端方向一次性完整拉出。
- 将带有附着DRG的分离脊髓浸入盛有固定液的12孔板孔中，并继续处理其余胚胎的脊髓。
- 将脊髓在冰上固定至少2小时。
2. DRG神经元的DiI标记
- 对于每根需要标记的脊髓，使用微量移液器拉制仪制备两根玻璃针。我们使用Sutter型号P-97电极拉制仪（程序设置：1. HEAT=625, VEL= 35, TIME=175；2. HEAT=600, VEL= 25, TIME=175；3. HEAT=630, VEL= 30, TIME=150）。
- 在显微镜控制下，将每根玻璃针的尖端浸入5%（w/v）的DiI乙醇溶液中3至5次。乙醇挥发后会在针尖形成一层薄薄的DiI晶体。
- 在放大倍数约为40倍的解剖显微镜下操作，将脊髓腹侧朝上放置于载玻片上。使用弹簧剪刀沿中线切开腹侧的底板，全程切开脊髓，以便后续以倒置展开书页模式安装样本（见C部分）。
- 将脊髓背侧朝上置于载玻片上。在显微镜观察下，手动将覆盖有DiI的玻璃针尖对准脊髓一侧，小心地刺入每一第二个背根神经节（DRG）。穿刺后应几乎看不到DiI残留痕迹，以确保仅少量神经元被标记。使用第二根针处理脊髓的另一侧。仅刺入每隔一个的DRG可避免邻近DRG标记轴突投射重叠，从而简化单根轴突的分辨。
- 将脊髓放回固定缓冲液中，在室温下避光孵育至少6小时，或在4 °C下过夜，使染料有足够时间沿轴突在质膜内扩散。若需分析轴突侧支向脊髓内的生长情况，可延长孵育时间（最长可达4 °C下两天）。
3. 封片与显微分析
- 染料扩散后，将一根脊髓背侧朝下置于载玻片上的 PBS 液滴中。注意确保附着的背根神经节（DRG）正确地朝向两侧，不相互交错。用镊子吸去多余液体，并将脊髓展平成倒置的“摊开书本”状。
- 用 PBS 将标本封片于显微镜载玻片上。
- 为避免非特异性背景荧光增强，标记的轴突投射的荧光显微分析应在封片当天完成。在此期间，将载玻片置于 4 °C 黑暗环境中保存。
4. 代表性结果：
小鼠脊髓接收来自8对颈段、13对胸段、5对腰段和4对骶段背根神经节（DRG）的传入投射，总计60个脊神经节。经过一定训练后，可在五分钟内从胚胎中分离出大部分背根神经节仍附着的脊髓。该操作适用于分离E11.5至E13.5阶段小鼠胚胎的带有背根神经节的脊髓，但以E12.5阶段获得的结果最佳。本文所述标记方法的典型结果见图3。通过对整个脊髓长度上的背根神经节进行标记，可用于量化不同椎体水平处的轴突分支行为（图4）。
图1. 描述轴突分支两种主要模式的示意图。（A）由生长锥活动介导的分支，可导致分叉——如图所示——以及复杂的终末树状结构，或（B）在轴突主干上形成的侧支（节间分支）。后一种模式是投射性皮层和丘脑皮层轴突占主导的分支类型6,7。
图2. 背根神经节（DRG）神经元向胚胎脊髓的传入投射表现出两种轴突分支类型：轴突首先在背根进入区（DREZ）通过分叉（1）进行分支，随后其子代分支经过一段等待期后通过侧支形成（间插分支）产生新的侧支（2）。
图3. 胚胎小鼠背根神经节（DRG）神经元单根轴突轨迹的可视化。（A）来自E12.5小鼠胚胎的附有背根神经节的脊髓标本。（比例尺，1 mm）。（B-D）显示野生型小鼠背根神经节经DiI标记后的背侧视图，放大倍数依次增加。在（B）中，每隔一个背根神经节被DiI标记。荧光图像已翻转，尾侧位于左侧；在（C）和（D）中，外侧位于底部。（C）仅少量轴突被标记，高倍镜下可见脊髓背根进入区（DREZ）存在T型分支。（比例尺：250 μm（B）、100 μm（C）和50 μm（D））。
图4. E13.5时期野生型和C型利钠肽（CNP）缺陷型小鼠中T形分支、单一头端或尾端转弯的数量统计。每种基因型在不同躯干水平的计数单轴突数量以括号表示。C型或R型转弯——分别仅向尾端或头端方向生长。
图 5. cGMP信号通路触发脊髓背根进入区（DREZ）处的感觉轴突分支。（A）由配体CNP、受体鸟苷酸环化酶Npr2和丝氨酸/苏氨酸激酶cGKIα组成的cGMP信号通路在胚胎背根神经节（DRG）神经元中的示意图。CNP刺激下，Npr2催化GTP生成cGMP。（B）野生型和CNP缺陷型小鼠中DRG神经元单根轴突的DiI示踪结果。（比例尺，25 μm。）
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讨论
两种轴突分支形成方式的刻板投射模式，结合使用固定组织进行DiI标记的简便制备方法，使得附有背根神经节（DRG）的胚胎脊髓成为研究轴突分支的理想模型。利用包被玻璃针施加微量DiI，与背根神经节的大规模标记相比，可实现对少量背根神经节神经元的可视化，从而能够分析单个轴突及其分支模式。通过电泳法注射脂溶性示踪剂可进一步优化该方法，从而进一步减少被标记神经元的数量8。然而，这种方法将更加耗时。
在胚胎脊髓整体标本中，对单根轴突轨迹进行DiI标记，有助于鉴定出一条cGMP信号级联通路——该通路由配体CNP、其受体Npr2以及cGMP依赖性激酶cGKIα组成，调控背根神经节（DRG）神经元在背根进入区（DREZ）处的一种轴突分支形式，即轴突分叉4,5,9-12。与野生型相比，cGMP信号通路突变体中DRG神经元的轴突仅向一个方向转向，而不在DREZ处发生分叉（图5）。这些研究还发现，cGMP信号通路突变体中侧支形成未受影响，表明在DRG神经元中观察到的第二种分支形成方式受到不同的调控机制4。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢柏林马克斯·德尔布吕克中心的 Alistair Garratt 博士提供的有益评论。本工作由德国研究基金会（DFG）合作研究中心（SFB665）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 体视显微镜 Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| 多聚甲醛 | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| 标准手术剪刀 | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| 带齿标准镊子 | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| 超细虹膜剪刀 | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| 弯头镊子 | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont 5号精细尖头镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont 5号镜面抛光镊子 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| 滤纸 | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| 100 mm 培养皿 | Greiner Bio-One | 663102 | |
| 12 ml 聚丙烯管 | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12孔细胞培养板 | BD Biosciences | 35-3043 | |
| 乙醇 | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基-吲哚羰花青高氯酸盐) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| SuperFrost Plus 显微镜载玻片 | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| 玻璃盖玻片 | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
参考文献
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
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- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
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