DiI标记背根神经节神经元以研究小鼠胚胎脊髓全组织制备中的轴突分支

摘要

感觉传入神经纤维在啮齿类动物脊髓中的刻板投射为研究轴突分支提供了一个易于接触的实验系统，可通过单根轴突的示踪来实现。

摘要

本文介绍一种利用脂溶性示踪剂高氯酸1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青（DiI）通过弥散染色标记少量背根神经节（DRG）神经元在胚胎脊髓中轴突轨迹的技术¹。通过比较野生型小鼠与基因突变小鼠品系中轴突通路的差异，可检验候选蛋白在调控轴突分支中的功能作用，而轴突分支是神经系统神经连接形成的关键机制。轴突分支使单个神经元能够与多个靶点建立连接，从而为信息的并行处理提供结构基础。轴突生长过程中在中间靶区形成的分支可与终末分支区分开来。此外，根据分支是否由生长锥活动（分裂或延迟分支）产生，或由轴突主干侧向出芽形成侧支（称为节间分支）²，可将轴突分支的不同模式进行分类（图1）。

背根神经节（DRG）神经元的中枢投射为研究两种类型的轴突分支提供了有用的实验系统：在胚胎第10至13天（E10–E13）期间，当它们的传入轴突到达脊髓的背根进入区（DREZ）时，会表现出典型的T形或Y形分叉模式。随后，两条子代轴突分别沿脊髓背外侧边缘向头侧或尾侧延伸，经过一段等待期后，侧支才从这些主干轴突上萌发，进而穿透灰质（间歇性分支），并投射到脊髓特定板层中的中继神经元，在那里进一步形成分支（终末分支）³。DiI示踪技术揭示了在脊髓背根进入区存在正在分裂过程中的生长锥，提示轴突分叉可能是由生长锥自身分裂所致⁴（图2），但其他机制也已被讨论⁵。

本视频首先演示如何解剖 E12.5 小鼠的脊髓，保留背根神经节（DRG）附着。标本固定后，使用从毛细管拉制的玻璃针将少量 DiI 染料施加至 DRG。经过孵育步骤后，将标记的脊髓以倒置的“摊开书本”制备方式装片，以便通过荧光显微镜分析单个轴突。

方案

1. 解剖步骤

注意：小鼠的实验使用应遵循官方批准的实验动物护理与使用指南。

1. 准备前，设置好解剖显微镜，并摆放解剖所需手术器械，包括大、小剪刀、大齿镊、弯头镊以及四套Dumont No.5解剖镊（其中两把为内表面抛光尖端）（具体试剂与设备详见试剂与设备表）。在100 mm Sylgard包被的培养皿中放置一张滤纸。在12孔板的各孔、100 mm培养皿及12 ml离心管中倒入冰冷的PBS，并置于冰上。在另一块12孔板的每孔中加入2 ml固定液（含4%多聚甲醛的PBS，pH 7.4），并置于冰上。
2. 麻醉后，在E12.5时期处死配准妊娠母鼠（检测到阴道栓记为E0.5），将小鼠仰卧置于三层纸巾上，并用70%乙醇浸润腹部区域。
3. 打开腹腔和盆腔，分离双侧子宫角，并将其转移至盛有冰冻PBS的100 mm培养皿之一中。
4. 在显微镜下，用小型直剪沿子宫壁纵向剪开，将每个羊膜囊从胎盘上剪下。
5. 将羊膜囊从每个胚胎上剥离，并剪断脐带。
6. 使用小剪刀将胚胎头部剪下，若需进行基因分型，可将头部或其部分保留用于基因组DNA提取。随后，将躯干转移至盛有冷PBS的12孔板对应孔中。
7. 用数滴PBS润湿Sylgard培养皿中的滤纸，将胚胎躯干背侧朝上放置于滤纸上。为增强稳定性，将尾部和四肢从身体向外伸展拉直。
8. 在解剖显微镜下（放大倍数....

讨论

两种轴突分支形成方式的刻板投射模式，结合使用固定组织进行DiI标记的简便制备方法，使得附有背根神经节（DRG）的胚胎脊髓成为研究轴突分支的理想模型。利用包被玻璃针施加微量DiI，与背根神经节的大规模标记相比，可实现对少量背根神经节神经元的可视化，从而能够分析单个轴突及其分支模式。通过电泳法注射脂溶性示踪剂可进一步优化该方法，从而进一步减少被标记神经元的数量⁸。然而，这种方法将更加耗时。

在胚胎脊髓整体标本中，对单根轴突轨迹进行DiI标记，有助于鉴定出一条cGMP信号级联通路——该通路由配体CNP、其受体Npr2以及cGMP依赖性激酶cGKIα组成，调控背根神经节（DRG）神经元在背根进入区（DREZ）处的一种轴突分支形式，即轴突分叉^4,5,9-12。与野生型相比，cGMP信号通路突变体中DRG神经元的轴突仅向一个方向转向，而不在DREZ处发生分叉（图5）。这些研究还发现，cGMP信号通路突变体中侧支形成未受影响，表明在DRG神经元中观察到的第二种分支形成方式受到不同的调控机制⁴。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
体视显微镜 Stemi DRC	Carl Zeiss, Inc.
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Biochrom AG	L182-50
多聚甲醛	Merck & Co., Inc.	8.18715.1000
标准手术剪刀	Fine Science Tools	14001-13
带齿标准镊子	Fine Science Tools	11021-14
超细虹膜剪刀	Fine Science Tools	14088-10
弯头镊子	Fine Science Tools	11003-13
Dumont 5号精细尖头镊子	Fine Science Tools	11254-20
Dumont 5号镜面抛光镊子	Fine Science Tools	11252-23
Vannas-Tübingen 弹簧剪刀	Fine Science Tools	15008-08
滤纸	Fisher Scientific	FB59041
Sylgard 184	World Precision Instruments, Inc.	SYLG184
100 mm 培养皿	Greiner Bio-One	663102
12 ml 聚丙烯管	Carl Roth GmbH	ECO3.1
12孔细胞培养板	BD Biosciences	35-3043
乙醇	Merck & Co., Inc.	1.00983.2500
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 P-97	Sutter Instrument Co.
硼硅酸盐玻璃毛细管	Harvard Apparatus	30-0066
DiI (1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基-吲哚羰花青高氯酸盐)	Sigma-Aldrich	468495
SuperFrost Plus 显微镜载玻片	Carl Roth GmbH	H867.1
玻璃盖玻片	Carl Roth GmbH	1870.2