炎症性肠病的实验模型使我们能够研究与发病机制相关的复杂先天性和适应性免疫反应。通过组织学评分、促炎细胞因子的定量分析以及髓过氧化物酶活性的检测，可以开始评估炎症性肠病中所见的这些免疫反应。
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摘要
摘要
炎症性肠病（IBD）涵盖一系列肠道病理，其中最常见的是溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）。当UC和CD累及结肠时，可产生相似的症状谱，包括腹泻、直肠出血、腹痛和体重减轻。1 尽管IBD的发病机制尚不明确，但它被认为是一种涉及遗传和环境因素的多因素疾病。2
存在多种多样的结肠炎动物模型，其表现出与炎症性肠病（IBD）相似的若干特征。结肠炎的动物模型包括在特定品系动物中自发产生的模型，以及需要给予特定浓度结肠炎诱导化学物质（如葡聚糖硫酸钠（DSS））的模型。化学诱导的肠道炎症模型是目前最常用且描述最详尽的IBD模型。通过饮水给予DSS可依据给药方案的不同诱导出急性或慢性结肠炎3。给予DSS的动物会出现体重减轻以及粪便稀软或腹泻的表现，有时伴有直肠出血的证据4,5。本文中，我们描述了在给予DSS后，用于表征结肠炎发展及伴随炎症反应的方法。这些方法包括对苏木精/伊红染色的结肠组织切片进行组织学分析、促炎性细胞因子的测定，以及髓过氧化物酶（MPO）活性的检测，后者可作为炎症的替代性标志物6。
疾病状态下炎症反应的程度可通过临床症状的存在与否，或黏膜组织组织学的改变来评估。结肠组织的组织学损伤通过评分系统进行评估，该系统考虑隐窝结构的丧失、炎性细胞浸润、肌层增厚、杯状细胞减少以及隐窝脓肿等因素。7 定量方面，可采用常规ELISA方法检测具有急性炎症特性的促炎细胞因子水平，如白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α。此外，可通过比色法测定髓过氧化物酶（MPO）活性，并将其作为炎症的指标。8
在实验性结肠炎中，疾病严重程度通常与髓过氧化物酶（MPO）活性升高及促炎性细胞因子水平增加相关。结肠炎的严重程度及与炎症相关的组织损伤可通过观察粪便性状和出血情况来评估，此外还可通过苏木精/伊红染色的结肠组织切片进行组织病理学分析。结肠组织片段可用于测定MPO活性和细胞因子的产生。综合上述指标，可对实验性结肠炎动物模型中的肠道炎症反应进行评估。
方案
1. DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型
- 将葡聚糖硫酸钠（DSS）加入经高压灭菌的饮水中，配制成所需终浓度（1–5%，w/v）。例如，配制5% DSS溶液时，将25 g DSS粉末溶于500 mL高压灭菌水中。该储备液可在室温下保存最多一周，或置于4°C保存至使用前。
- 在生物安全柜中，将DSS储备液分装至50 mL Falcon离心管中（每笼小鼠需1管），并保留剩余储备液以备后续补充。
- 将每只小鼠笼中的饮用水更换为含DSS的溶液（置于50 mL Falcon管中）（更换持续时间取决于所采用的DSS处理方案。例如，在使用6–8周龄雄性C57BL/6小鼠的实验中，我们连续给予5% DSS溶液共5天）。在此期间，小鼠不得接触任何其他水源。对照组小鼠给予不含DSS的高压灭菌饮用水。
- 每日称量小鼠体重，并记录每只小鼠每日摄入的DSS量。在记录DSS消耗量后，将每管补充至50 mL。此操作用于估算实验期间每笼每只小鼠对DSS溶液的大致摄取体积。在我们的研究中，采用5% DSS溶液连续处理5天的雄性C57BL/6小鼠模型。使用该特定DSS处理方案时，最早在第3天即可观察到显著的体重下降、粪便性状改变及粪便带血迹象。在DSS处理期间，小鼠通常表现出明显体重减轻（第5天时约为初始体重的5–10%），若体重下降超过初始体重的20%，并伴有脱水和腹泻，则表明动物已达到或接近实验终点。若在5天5% DSS处理后恢复给予正常饮水，小鼠可在7天内恢复。所有实验均须经机构动物伦理委员会批准，并严格遵循批准的动物使用方案（AUP）。
- 在实验过程中，可通过疾病活动指数（DAI）评分评估结肠炎的临床进展。DAI为体重下降（相对于初始体重）、粪便性状和出血情况三项评分的总和。评分标准如下：体重下降：0分（无下降）、1分（1–5%）、2分（5–10%）、3分（10–20%）、4分（>20%）；粪便性状：0分（正常）、2分（稀便）、4分（腹泻）；出血情况：0分（无出血）、1分（隐血阳性）、2分（隐血阳性且肉眼可见粪粒带血）、4分（明显出血，肛门周围有血）。DAI可在DSS处理期间每日评分。
- 在预定时间点，称量小鼠体重后实施安乐死。小鼠可通过吸入异氟烷麻醉后行颈椎脱位法处死，或其他经机构动物设施批准的方法实施安乐死。
2. 收集结肠组织样本
- 将动物腹侧朝上暴露，并用70%乙醇溶液润湿腹部区域。此时，参考表1，记录每只动物是否存在直肠出血（肛门开口处有血液）或直肠脱垂的迹象。
- 使用标准解剖剪沿腹中线切开腹部。
- 定位结肠，并尽可能靠近直肠交界处横切，以游离远端结肠。
- 小心缓慢地将整个结肠拉出，同时将其从周围肠系膜中分离。
- 在结肠盲肠交界处横切，以游离结肠近端。可通过连接3 mL或5 mL注射器的灌胃针向结肠内注入无菌PBS冲洗，或用一对弯镊/钳子轻轻挤压，以去除粪便。使用完整结肠评估损伤情况（见第3.1节）。
- 用于组织学分析及其他检测的组织取样，可通过切割0.5 cm至1.0 cm长的结肠片段完成，并注明取样部位（即近端、中段或远端）。
- 用于检测的组织样本可分别放入1.5 mL离心管中，液氮速冻后于-70°C保存至使用。
3. 结肠炎严重程度的评估
- 由无偏倚的观察者根据先前发表的评分系统（表1）在实验终点评估宏观或疾病严重程度评分。9 可使用一对镊子按压粪便以评估粪便性状。为确定粪便中出血的评分，需注意粪便颜色（例如黑色粪便与浅棕色粪便），并进一步通过隐血试验（Hemoccult test）进行验证。根据评分系统，对各项指标分别进行评分。每只动物的最终宏观评分为各项单独评分之和。
- 为评估结肠炎严重程度的组织学损伤，取一小段结肠组织（0.5 cm），置于组织包埋盒中，并浸入缓冲的10%甲醛溶液中固定。制备5 μm厚的石蜡包埋横切面切片，并按标准操作程序采用苏木精/伊红（H&E）染色。结肠组织样本可取自结肠近端、中段或远端部分。
- H&E染色的结肠组织切片由盲法观察者根据先前发表的评分系统进行评分，评估以下指标：隐窝结构（正常，0分；隐窝严重扭曲并伴有整个隐窝缺失，3分）、炎症细胞浸润程度（正常，0分；密集炎症浸润，3分）、肌层增厚（隐窝基底部位于黏膜肌层，0分；明显肌层增厚，3分）、杯状细胞减少（无减少，0分；存在减少，1分）以及隐窝脓肿（无，0分；存在，1分）。7 组织学损伤评分为各项单独评分之和。需注意的是，与人类溃疡性结肠炎不同，该动物模型通常不出现隐窝脓肿，且此类病变罕见；显微镜下溃疡亦较少见。若对多个结肠节段进行了染色，应比较相似节段间的组织学评分，以确定各区域的最终评分（例如近端结肠的组织学评分与远端结肠的组织学评分）。
4. 准备检测用试剂的储备溶液
- 通过将溶液B（K2HPO4，8.7 g 磷酸氢二钾溶于1 L dH2O中）加入溶液A（KH2PO4，6.8 g 磷酸二氢钾溶于1 L dH2O中），调节至pH为6.0，制备50 mM磷酸钾缓冲液。剩余溶液可储存于冰箱（2–8°C）以备后续使用。
- 将5 g十六烷基三甲基溴化铵（HTAB）加入1 L磷酸钾缓冲液（50 mM，pH=6.0）中，制备十六烷基三甲基溴化铵（HTAB）缓冲液。轻轻加热溶解后，储存于2–8°C备用。使用前如需可加热重新溶解。
- 为进行蛋白质分析的组织匀浆，配制裂解缓冲液：将10 mL 1 M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl，pH=8.0）、6 mL 5 M氯化钠和2 mL Triton X-100加入182 mL无菌蒸馏水中。Triton X-100在室温下黏度较高，使用前应轻微加热。配制好的裂解缓冲液可于-20°C保存至使用。
5. 检测用样品制备
- MPO 分析的样品制备。
- 从 -70°C 取出样品并置于冰上。使用弯头镊子去除任何可见的粪便或脂肪后，记录每个样品的重量，并将其放入 2 mL Eppendorf Safe-Lock 微量离心管（或任何可用于均质器的管子）中。样品应始终保存在冰上。需要注意的是，每个生物学重复应使用相似的结肠片段（例如仅远端部分或仅近端部分）。
- 向每个样品管中加入均质珠。
- 根据组织重量加入适量的 HTAB 缓冲液。如果组织重量小于 25 mg，按 12.5 mg/mL 的比例加入缓冲液；如果组织重量在 25–50 mg 之间，按 25 mg/mL 的比例加入；如果组织重量大于 50 mg，则按 50 mg/mL 的比例加入缓冲液。
- 使用组织均质器在 30 Hz 下均质 4 分钟。若组织未完全均质，可重复此步骤。
- 取出均质珠，将溶液在 13400 × g、4°C 条件下离心 6 分钟。
- 收集上清液，弃去沉淀。上清液可于 -70°C 保存至使用前。
- 细胞因子分析的样品制备。
- 重复步骤 5.1.1 至 5.1.2。
- 向 10 mL 制备好的裂解缓冲液中加入 50 μl 蛋白酶抑制剂混合物（PIC）。
- 无论样品重量如何，向每个样品中加入 1 mL PIC 与裂解缓冲液的混合溶液。
- 在 30 Hz 下均质 5 分钟。若组织未完全均质，可重复此步骤。
- 取出均质珠，将溶液在 3300 × g 条件下离心 5 分钟。
- 收集上清液，弃去沉淀。上清液可于 -70°C 保存至使用前。
6. 炎症标志物的定量分析
- MPO 活性检测
- 将16.7 mg邻二甲氧基联苯胺二盐酸盐（o-dianisidine dihydrochloride）与90 mL去离子水（dH₂O）混合，配制邻二甲氧基联苯胺溶液；2O 和 10 mL 磷酸钾缓冲液。该溶液应每次检测前新鲜配制。
- 添加 7 μL 将组织匀浆液（按第5.1节制备）每份三孔加入96孔板中。
- 添加 50 μL 稀释的H2O2 (4 μL 30% H2O2 稀释于 96 μL 的 dH2O）加入到邻二甲氧基联苯胺混合物中。
- 使用多通道移液器加入 200 μL 含H的邻联二茴香胺混合物2O2 向每个孔中加入。
- 使用分光光度计在 450 nm 处测定吸光度。每隔 30 秒读取一次读数，共测定三次。
- 计算MPO活性。MPO活性以每毫克组织中MPO的单位数（U）表示，其中1单位MPO定义为降解所需酶量 1 μmoL H的2O2 每分钟室温下。考虑到一单位（U）MPO= 1 μmoL H的2O2 分离并 1 μmoL H的2O2 吸光度变化为 1.13 x 10-2 nm/min，每个样品中MPO的单位确定为吸光度变化[ΔA(t2- t1)]/Δmin × (1.13 × 10-2）。为获得每毫克组织的单位数，需使用组织与缓冲液体积比。例如，若使用的组织与缓冲液比例为 50 mg/mL，则在 7 μL 匀浆液中含组织0.35 mg。因此，为获得每毫克组织的单位数，需将MPO的单位除以0.35。以下提供一个使用吸光度值（nm）的示例计算（假设样品已设三个重复孔）：
| 样品 | 0 秒时 | 30 秒时 | 60 秒时 | ||||||
| A | 1 | 2 | 3 | 1' | 2' | 3' | 1" | 2'' | 3" |
| 0.048 | 0.048 | 0.051 | 0.061 | 0.061 | 0.065 | 0.074 | 0.073 | 0.078 | |
- 0 秒时的平均值 = (0.048 + 0.048 + 0.051)/3 = 0.049 nm
- 30 秒时的平均值 = 0.0623 nm
- 60 秒时的平均值 = 0.075 nm
- 从 0 到 30 秒吸光度变化（ΔA）/mg 组织（假设组织与缓冲液比例为 50 mg/mL）= [(0.0623 - 0.049)/(1.13 × 10-2)]/0.35 = 3.363
- 从 30 到 60 秒吸光度变化（ΔA）/mg 组织 = 3.211
- *MPO 活性（U/mg 组织）= ΔA(0-30) 与 ΔA(30-60) 的平均值 = 3.287
- 通过ELISA定量促炎性细胞因子
- 使用市售的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Quantikine Murine；R&D Systems）检测细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平。
- 每个ELISA的吸光度值均通过Bradford蛋白测定法对相应样品进行归一化处理，并以每毫克蛋白的皮克（pg/mg蛋白）表示。
7. 代表性结果
给予适当剂量的DSS可诱导小鼠急性结肠炎。在DSS处理期间，可通过疾病活动指数（DAI）评估疾病的临床进展。经DSS处理的小鼠将出现显著的体重下降（相较于初始体重）、稀便及粪便出血。图1）。处死后对结肠进行检查，根据结肠长度缩短、结肠出血、粪便出血、粪便性状松散程度以及与仅给予水的对照组相比出现的直肠出血征象，对结肠炎严重程度进行宏观评分。图2 & 表1). 结肠组织样本的横切面经 H 染色&E组经DSS处理的结肠组织相较于经水处理的对照组将具有更高的组织学评分（图3）。为了进一步表征DSS处理小鼠的炎症程度，可从匀浆化的结肠组织样本中检测髓过氧化物酶（MPO）活性。与对照组相比，DSS处理组结肠的MPO活性更高（图4此外，这与促炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平的升高相关（图5）。
图 1。 雄性 C57BL/6 小鼠在饮水中给予 5% DSS，持续 5 天。每天评估每只动物的 DAI 评分，并计算每组每日的平均值（均值 ± 标准误，n=4 只小鼠/组）。
图 2。 C57BL/6小鼠在饮水中给予5% DSS，持续5天。对照组小鼠饮用不含DSS的水。在DSS诱导结肠炎后的第5天，由不知分组情况的研究人员盲法评估宏观损伤评分/疾病严重程度评分。接受DSS处理的小鼠其分离结肠表现出更高的宏观损伤评分（直肠出血、直肠脱垂、腹泻、结肠出血），表明疾病严重程度更高（均值 ± 标准误，n=4只小鼠/组）。
图3. 为诱导结肠炎，向C57BL/6小鼠的饮水中添加5% DSS溶液。对照组小鼠饮用不含DSS的水。（A）在DSS处理后第5天收集结肠组织切片，经H&E染色后由观察者盲法评估组织学评分。（B）与（C）对照组相比，DSS处理组样本显示出更严重的组织学损伤（包括更多的细胞浸润、更显著的杯状细胞减少以及更严重的隐窝结构扭曲/损伤）（均值 ± 标准误，n=4只小鼠/组）。在（B）和（C）中，星号（*）表示杯状细胞减少及隐窝结构扭曲的区域；井号（#）表示细胞浸润区域。
图 4. 所有小鼠在给予 DSS 后第 5 天处死，收集结肠组织样本以评估 MPO 活性。与对照组相比，DSS 诱导结肠炎的严重程度与更高的 MPO 活性水平相关（均值 ± 标准误，n=4 只小鼠/组）。
图5. 除了MPO水平升高外，DSS诱导的结肠炎严重程度还与促炎性细胞因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）水平的升高相关（均值 ± 标准误，n=4只小鼠/组）。
| 评分 | 直肠出血 | 直肠脱垂 | 粪便性状 | 血液 |
| 0 | 无 | 无 | 正常 | 正常 |
| 1 | 红色 | 脱垂迹象 | 软 | 红色 |
| 2 | 深红色 | 明显脱垂 | 极软 | 深红色 |
| 3 | 大量出血 | 广泛脱垂 | 腹泻 | 黑色 |
表1. 宏观/疾病严重程度评分
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讨论
DSS结肠炎是一种广泛使用的化学诱导性肠道炎症模型。在该模型中，小鼠饮用添加DSS的水，DSS被认为对肠道上皮细胞具有毒性，并可破坏黏膜屏障的完整性10。给予DSS可诱发急性结肠炎，其特征包括稀便、粪便出血以及粒细胞浸润10。在DSS给药期间，结肠炎通常伴随明显的体重减轻和粪便中带血，可通过粪便隐血试验进行评估5.10,11。在采集结肠组织样本后，可通过大体解剖观察结肠并结合使用既往建立的评分系统对苏木精-伊红（H&E）染色的结肠横切片进行组织学分析，以评估结肠炎的严重程度9。
在遵循本实验方案时，需要注意的是，DSS诱导的结肠炎严重程度具有物种和品系特异性12。此外，不同动物设施及饲养房间之间肠道微生物群的差异可能影响DSS给药后的实验结果13,14。因此，在初次使用DSS时，可能需要进行预实验以优化DSS处理的剂量和持续时间。若未能优化这些变量，可能导致动物死亡率过高或几乎不出现结肠炎症状。一旦条件得到优化，该模型可作为高度可重复的结肠炎...
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致谢
本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大克罗恩病与结肠炎基金会（CCFC）的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Eppendorf Safe-Lock 微量离心管（2 mL） | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| Biotek EL808 吸光度酶标仪 | BioTek | EL808 | |
| 葡聚糖硫酸钠盐试剂级（分子量 36,000–50,000 Da） | MP Biomedicals | 160110 | |
| Gen5（软件） | BioTek | 版本 1.10.8 | |
| 十六烷基三甲基溴化铵（HTAB） | Sigma-Aldrich | H5882-100G | |
| 过氧化氢，30 wt.% 水溶液 | Sigma-Aldrich | 216763 | 储存于 2–8°C |
| 96 孔平底微量检测板 | Sarstedt Ltd | 82.1581 | 仅限一次性使用 |
| 邻联甲苯胺（o-Dianisidine） | Sigma-Aldrich | D-3252 | 避光保存。储存于 2–8°C |
| 磷酸氢二钾 | Caledon | 6620-1 | |
| 磷酸二氢钾 | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 | 储存于 -20°C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tissue Lyser II 用碳化钨珠 | Qiagen | 69997 |
参考文献
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