研究DSS诱导的IBD模型中的肠道炎症

摘要

炎症性肠病的实验模型使我们能够研究与发病机制相关的复杂先天性和适应性免疫反应。通过组织学评分、促炎细胞因子的定量分析以及髓过氧化物酶活性的检测，可以开始评估炎症性肠病中所见的这些免疫反应。

摘要

炎症性肠病（IBD）涵盖一系列肠道病理，其中最常见的是溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）。当UC和CD累及结肠时，可产生相似的症状谱，包括腹泻、直肠出血、腹痛和体重减轻。¹ 尽管IBD的发病机制尚不明确，但它被认为是一种涉及遗传和环境因素的多因素疾病。²

存在多种多样的结肠炎动物模型，其表现出与炎症性肠病（IBD）相似的若干特征。结肠炎的动物模型包括在特定品系动物中自发产生的模型，以及需要给予特定浓度结肠炎诱导化学物质（如葡聚糖硫酸钠（DSS））的模型。化学诱导的肠道炎症模型是目前最常用且描述最详尽的IBD模型。通过饮水给予DSS可依据给药方案的不同诱导出急性或慢性结肠炎³。给予DSS的动物会出现体重减轻以及粪便稀软或腹泻的表现，有时伴有直肠出血的证据^4,5。本文中，我们描述了在给予DSS后，用于表征结肠炎发展及伴随炎症反应的方法。这些方法包括对苏木精/伊红染色的结肠组织切片进行组织学分析、促炎性细胞因子的测定，以及髓过氧化物酶（MPO）活性的检测，后者可作为炎症的替代性标志物⁶。

疾病状态下炎症反应的程度可通过临床症状的存在与否，或黏膜组织组织学的改变来评估。结肠组织的组织学损伤通过评分系统进行评估，该系统考虑隐窝结构的丧失、炎性细胞浸润、肌层增厚、杯状细胞减少以及隐窝脓肿等因素。⁷ 定量方面，可采用常规ELISA方法检测具有急性炎症特性的促炎细胞因子水平，如白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α。此外，可通过比色法测定髓过氧化物酶（MPO）活性，并将其作为炎症的指标。⁸

在实验性结肠炎中，疾病严重程度通常与髓过氧化物酶（MPO）活性升高及促炎性细胞因子水平增加相关。结肠炎的严重程度及与炎症相关的组织损伤可通过观察粪便性状和出血情况来评估，此外还可通过苏木精/伊红染色的结肠组织切片进行组织病理学分析。结肠组织片段可用于测定MPO活性和细胞因子的产生。综合上述指标，可对实验性结肠炎动物模型中的肠道炎症反应进行评估。

方案

1. DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型

1. 将葡聚糖硫酸钠（DSS）加入经高压灭菌的饮水中，配制成所需终浓度（1–5%，w/v）。例如，配制5% DSS溶液时，将25 g DSS粉末溶于500 mL高压灭菌水中。该储备液可在室温下保存最多一周，或置于4°C保存至使用前。
2. 在生物安全柜中，将DSS储备液分装至50 mL Falcon离心管中（每笼小鼠需1管），并保留剩余储备液以备后续补充。
3. 将每只小鼠笼中的饮用水更换为含DSS的溶液（置于50 mL Falcon管中）（更换持续时间取决于所采用的DSS处理方案。例如，在使用6–8周龄雄性C57BL/6小鼠的实验中，我们连续给予5% DSS溶液共5天）。在此期间，小鼠不得接触任何其他水源。对照组小鼠给予不含DSS的高压灭菌饮用水。
4. 每日称量小鼠体重，并记录每只小鼠每日摄入的DSS量。在记录DSS消耗量后，将每管补充至50 mL。此操作用于估算实验期间每笼每只小鼠对DSS溶液的大致摄取体积。在我们的研究中，采用5% DSS溶液连续处理5天的雄性C57BL/6小鼠模型。使用该特定DSS处理方案时，最早在第3天即可观察到显著的体重下降、粪便性状改变及粪便带血迹象。在DSS处理期间，小鼠通常表现出明显体重减轻（第5天时约为初始体重的5–10%），若体重下降超过初始体重的20%，并伴有脱水和腹泻，则表明动物已达到或接近实验终点。若在5天5% DSS处理后恢复给予正常饮水，小鼠可在7天内恢复。所有实验均须经机构动物伦理委....

讨论

DSS结肠炎是一种广泛使用的化学诱导性肠道炎症模型。在该模型中，小鼠饮用添加DSS的水，DSS被认为对肠道上皮细胞具有毒性，并可破坏黏膜屏障的完整性¹⁰。给予DSS可诱发急性结肠炎，其特征包括稀便、粪便出血以及粒细胞浸润¹⁰。在DSS给药期间，结肠炎通常伴随明显的体重减轻和粪便中带血，可通过粪便隐血试验进行评估^5.10,11。在采集结肠组织样本后，可通过大体解剖观察结肠并结合使用既往建立的评分系统对苏木精-伊红（H&E）染色的结肠横切片进行组织学分析，以评估结肠炎的严重程度⁹。

在遵循本实验方案时，需要注意的是，DSS诱导的结肠炎严重程度具有物种和品系特异性¹²。此外，不同动物设施及饲养房间之间肠道微生物群的差异可能影响DSS给药后的实验结果^13,14。因此，在初次使用DSS时，可能需要进行预实验以优化DSS处理的剂量和持续时间。若未能优化这些变量，可能导致动物死亡率过高或几乎不出现结肠炎症状。一旦条件得到优化，该模型可作为高度可重复的结肠炎.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Eppendorf Safe-Lock 微量离心管（2 mL）	Eppendorf	0030 120.094
Biotek EL808 吸光度酶标仪	BioTek	EL808
葡聚糖硫酸钠盐试剂级（分子量 36,000–50,000 Da）	MP Biomedicals	160110
Gen5（软件）	BioTek	版本 1.10.8
十六烷基三甲基溴化铵（HTAB）	Sigma-Aldrich	H5882-100G
过氧化氢，30 wt.% 水溶液	Sigma-Aldrich	216763	储存于 2–8°C
96 孔平底微量检测板	Sarstedt Ltd	82.1581	仅限一次性使用
邻联甲苯胺（o-Dianisidine）	Sigma-Aldrich	D-3252	避光保存。储存于 2–8°C
磷酸氢二钾	Caledon	6620-1
磷酸二氢钾	EMD Millipore	PX1565-1
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8340	储存于 -20°C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tissue Lyser II 用碳化钨珠	Qiagen	69997