通过比较Cr51释放实验与xCELLigence系统确定人HER2/neu特异性CD8 T细胞的最佳细胞毒活性

摘要

铬释放试验是一种检测细胞毒性T细胞活性的常用方法，但存在若干局限性。本文利用抗原特异性的CD8 T细胞和人乳腺癌肿瘤细胞系SKBR3，考察了一种基于阻抗的方法在检测细胞杀伤能力方面的可行性。

摘要

细胞毒性CD8 T细胞是T细胞的一个亚群，能够诱导被感染或恶性宿主细胞的死亡¹这些细胞表达一种特化的受体，称为T细胞受体（TCR），能够识别与HLA I类分子结合的特异性抗原肽²通过HLA I类分子识别被感染细胞或肿瘤细胞，可导致颗粒酶和穿孔素等溶细胞分子的产生，进而引起靶细胞死亡。尽管使用ELIspot或流式细胞术等方法检测抗原特异性CD8 T细胞频率具有重要意义，但通过细胞毒性实验评估CD8 T细胞应答的强度也同样具有价值。³评估细胞毒功能最常用的检测方法是铬释放试验（CRA），该方法被视为标准检测手段。 ⁴CRA 存在若干局限性，包括细胞暴露于伽马辐射、缺乏可重复性以及需要大量细胞。在过去十年中，人们逐渐关注采用新策略以克服这些局限性。较新的方法包括检测caspase释放的方法 ⁴，BLT酯酶活性 ⁵ CD107的表面表达 ⁶基于阻抗的检测方法在本研究中利用罗氏xCelligence系统，探讨其作为传统细胞毒性T细胞反应（CRA）检测替代方案的潜力。当贴壁肿瘤细胞结合至电极板时，会产生对电流的阻抗或阻力；肿瘤细胞在被杀伤后发生脱落，导致电学阻抗降低，这一变化可由xCelligence系统实时测量。将基于阻抗的方法用于评估细胞介导杀伤的可行性，依赖于以下观察结果：T细胞通常不易紧密黏附于大多数表面，且对阻抗信号影响甚微，因而显著降低了T细胞对检测信号直接干扰的可能。结果表明，相较于标准CRA，基于阻抗的检测方法在检测抗原特异性细胞毒性CD8 T细胞水平变化时具有更高的灵敏度。基于上述结果，基于阻抗的检测技术可能成为CRA或其他旨在评估细胞毒性CD8 T细胞功能的方法的良好替代选择。 关键词：阻抗检测，xCelligence系统，细胞毒性CD8 T细胞，细胞介导杀伤，肿瘤细胞，电学阻抗，CRA

方案

1. 短期人源抗原特异性CD8 T细胞系的制备⁷

1. 使用Ficoll-paque plus从正常健康HLA-A2阳性供体的血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
2. 将PBMCs以2 × 10⁶ 个细胞/ml的浓度加入6孔板中，每孔2 ml。
3. 直接向孔中加入HLA-A2结合的HER-2/neu p369-377肽段（氨基酸序列KIFGSLAFL）或HLA-A2结合的流感病毒p58-66肽段（GILGFVFTL），终浓度为10 μg/ml，并将培养板置于37 °C、含5% CO₂的培养箱中孵育。
4. 为促进T细胞的活化与扩增，每隔2天向每孔加入250 μl新鲜培养基，其中添加人重组IL-2（储存液：50 单位/μl），使培养基中IL-2的终浓度达到50 单位/ml。
5. 在首次肽段刺激后一周，用经照射的自体PBMCs（以步骤1.3中使用的相同肽段在10 μg/ml浓度下脉冲致敏2小时）以2 × 10⁶ 个细胞/ml的浓度重新刺激培养细胞，并以每孔1 ml的体积加入培养体系中。
6. 按照步骤1.4所述方法，每隔2天向现有培养体系中添加人重组IL-2和新鲜培养基。
7. 在第二次肽段刺激后一周，按照步骤1.5所述方法，使用肽段和经照射的自体PBMCs对细胞进行再次刺激。
8. 最早在最后一次再刺激后第六天开始使用细胞。

2. 乳腺癌细胞的制备

1. 将xCelligence阻抗测量仪（xCelligence站）置于含5% CO₂的37 °C培养箱中。
2. 使用0.25%胰蛋白酶消化并离心（1,000 rpm，5分钟）收集处于75%融合状态的人肿瘤细胞（SKBR3、BT20、MCF7或HCC1419）。
3. 用血细胞计数板计数肿瘤细胞，并将其重悬于RPMI肿瘤细胞培养基中（添加10%胎牛血清（FBS）和500单位/毫升IFN-γ），调整细胞浓度为7.5 × 10³个肿瘤细胞/100 μl。
4. 通过设置xCelligence软件的布局页面确定孔板布局，并在时间表页面设定程序，在40小时内每5分钟采集一次阻抗读数。在前18小时内，xCelligence系统仅对肿瘤细胞进行阻抗测量。
5. 向xCelligence E-板中每孔加入100 μl RPMI肿瘤细胞培养基，并在无细胞条件下进行背景阻抗读数。
6. 将肿瘤细胞以每孔100 μl的体积加入E-板中，并将E-板放入xCelligence测量仪内。
7. 点击xCelligence软件上的“开始”按钮，启动对肿瘤细胞的阻抗读数采集，此时细胞立即开始贴附于E-板表面。

3. 肿瘤细胞与CD8 T细胞的共培养

1. 当肿瘤细胞已贴壁并增殖至每孔 1.5 × 10⁴ 个肿瘤细胞（接种后约 18 小时），通过轻柔刮取和振荡收集第 1 节中制备的 T 细胞
2. 以 1,000 rpm 离心 5 分钟，使用血细胞计数板计数 T 细胞，并将其重悬于含 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基中，按不同比例稀释，起始比例为每 1 个肿瘤细胞对应 40 个 T 细胞，随后进行 2 倍梯度稀释，直至达到每 1 个肿瘤细胞对应 1.25 个 T 细胞的比例。例如，每孔含有 1.5 × 10⁴ 个肿瘤细胞，为实现 1:40 的比例，需向每孔加入 6 × 10⁵ 个 T 细胞，并将 T 细胞进行 2 倍梯度稀释，直至达到每孔 1.5 × 10⁴ 个肿瘤细胞与 1.875 × 10⁴ 个 T 细胞的比例（1:1.25）
3. 暂停 xCelligence 仪器运行，取出 E-板
4. 用移液器吸除各孔中的培养基，每孔加入 200 μl 单独的培养基或相应比例的 T 细胞悬液
5. 将 E-板放回 xCelligence 仪器中，继续运行软件程序，使在加入 T 细胞后的约 20 小时内，每 5 分钟采集一次阻抗读数
6. 在实验结束时对结果进行归一化处理

4. 铬释放实验（CRA）⁷

1. 使用 ⁵¹Cr 及 ⁵¹Cr 标记的靶细胞时，应遵循机构的辐射安全操作规程。始终使用适当的屏蔽措施以减少辐射暴露。
2. 将肿瘤细胞以每毫升 1 × 10⁶ 个肿瘤细胞的密度与 10 μl/ml 新鲜的 ⁵¹Cr（0.005 Ci/ml）共同孵育 2 小时进行脉冲标记。
3. 用含 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基 10 ml 洗涤肿瘤细胞，1,000 rpm 离心 5 分钟。将肿瘤细胞以每孔 1 × 10⁵ 个细胞、体积 100 μl 的条件加入 96 孔圆底培养板中。
4. 以不同比例加入 T 细胞，起始比例为 1 个肿瘤细胞对应 40 个 T 细胞，随后进行 2 倍系列稀释，直至达到 1 个肿瘤细胞对应 1.25 个 T 细胞的比例。例如，每孔含有 1 × 10⁵ 个肿瘤细胞。为实现 1:40 的比例，每孔加入 4 × 10⁶ 个 T 细胞，并对 T 细胞进行 2 倍梯度稀释，直至每孔达到 1 × 10⁵ 个肿瘤细胞与 1.25 × 10⁵ 个 T 细胞的比例（即 1:1.25）。
5. 向培养板中加入自发释放对照组和最大释放对照组。为计算肿瘤细胞中 ⁵¹Cr 的自发释放量，设置六个对照孔，每孔含 100 μl 中 1 × 10⁵ 个肿瘤细胞，并加入 100 μl 含 10% FBS 的 RPMI 培养基。为计算 ⁵¹Cr 的最大释放量，设置另外六个对照孔，每孔含 100 μl 中 1 × 10⁵ 个肿瘤细胞，并加入 100 μl 含 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液，以完全裂解所有细胞。
6. 将培养板在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5 小时。
7. 孵育结束后，从每孔中吸取 50 μl 上清液，转移至 Luma 检测板中。
8. 将 Luma 板过夜干燥，随后使用伽马计数器测定每分钟计数（CPM）。

5. 裂解百分比计算

1. 阻抗检测法：在不同时间点获取阻抗读数，以细胞指数（CI）表示，并使用以下公式计算裂解百分比：(仅肿瘤细胞的CI - （肿瘤细胞 + T细胞的CI）) / 仅肿瘤细胞的CI × 100。
2. 细胞释放法（CRA）：使用以下公式计算裂解百分比：(实验组CPM - 自发释放组CPM) / (最大释放组CPM - 自发释放组CPM) × 100。

6. 代表性结果

单独的T细胞不会增加阻抗

通常情况下，T细胞不会黏附于大多数固体表面，且其活化和增殖不需要依赖黏附作用。因此，推测T细胞不应在xCelligence E-板上产生明显的阻抗信号。为验证这一点，实验在孔中分别接种了SKBR3乳腺癌细胞或 freshly purified human CD8 T细胞。在40小时期间内持续监测阻抗变化，图1A展示了一个代表性结果，表明T细胞本身几乎不产生阻抗信号。相反，有观点认为T细胞可能会轻微降低背景阻抗。尽管如此，共培养实验显示，在阻抗测量开始18小时后加入T细胞会导致阻抗信号出现短暂干扰（图1B）。其他研究发现，此类干扰部分源于操作过程中的处理因素，因为若确保含T细胞的溶液温度与培养箱内部温度一致，信号的下降程度可明显减轻。

T细胞介导的阻抗降低呈剂量依赖性。

利用基于阻抗的检测方法比较样本中细胞毒性T细胞活性的有效性，取决于能够区分不同浓度的抗原特异性T细胞。为验证该方法是否可行，将SKBR3细胞与不同浓度的来源于HER-2/neu p369特异性T细胞系的T细胞共培养。如图2A所示，阻抗的降低程度依赖于T细胞的剂量。图2B显示，在T细胞浓度范围内，10小时时的细胞指数符合简单的二阶多项式关系。因此，xCelligence系统可通过细胞指数的下降，实时监测CD8 T细胞介导的SKBR3肿瘤细胞的死亡过程。

基于阻抗的检测法可检测抗原特异性T细胞

为了确定HER-2/neu p369特异性T细胞对SKBR3细胞（一种HER-2/neu和HLA-A2阳性的乳腺癌肿瘤细胞系）的阻抗降低是否具有抗原特异性，另设实验孔，将SKBR3细胞与来自流感病毒（FLU）特异性T细胞系的T细胞共同孵育。FLU特异性T细胞作为非特异性对照，其虽为HLA-A2阳性，但无法识别HER-2/neu抗原。如图3所示，HER-2/neu p369特异性T细胞与FLU特异性T细胞之间的裂解活性存在显著差异（p<0.0001）。在某些情况下，非肿瘤特异性T细胞（例如FLU特异性T细胞或经抗CD3/抗CD28刺激的T细胞）表现出较低水平的裂解活性（图3A-B）。T细胞可通过两种方式介导杀伤：一种是非特异性的Fas:Fas配体相互作用，另一种是抗原特异性的颗粒酶和穿孔素释放。为进一步验证HER-2/neu特异性T细胞以抗原特异性方式杀伤靶细胞的假设，我们加入了抗Fas配体的阻断抗体。如图3B所示，该抗体并未降低HER-2/neu p369特异性T细胞的裂解活性。然而，该抗体能够抑制Fas与Fas配体之间的相互作用，这一点已在经抗CD3/CD28磁珠非特异性激活的T细胞中得到证实。这些结果提示，当将肿瘤特异性T细胞与非肿瘤特异性T细胞进行比较时，可能需要采用Fas配体阻断策略，以将非TCR介导的相互作用降至最低。此外，当使用短期培养的T细胞系时，其中仅有一部分T细胞对用于体外（ex vivo）扩增的抗原具有特异性，此时可能发生由MHC不匹配介导的T细胞激活，从而导致非特异性裂解。在此情况下，添加阻断无关HLA分子的抗体可能是必要的。为了确定p369特异性T细胞是否以HLA I类分子依赖的方式杀伤肿瘤细胞，在共培养体系中分别加入抗HLA I类分子抗体或同型对照抗体。如图3C所示，加入抗HLA I类分子抗体后，p369特异性T细胞的裂解作用受到抑制，表明其杀伤效应受到HLA I类分子限制。最后，由于本检测方法的建立主要使用SKBR3细胞，因此有必要验证其他表达HLA-A2和HER-2/neu的贴壁肿瘤细胞是否也能被p369特异性T细胞杀伤。因此，将T细胞以1:5的比例加入表达HLA-A2和HER-2/neu的肿瘤细胞SKBR3、MCF-7和HCC1419中。HLA-A2阴性的肿瘤细胞系BT20作为阴性对照。如图3D所示，除BT20外，所有其他肿瘤细胞均表现出阻抗下降，表明其被有效裂解。因此，该方法适用于多种贴壁肿瘤靶细胞的检测。

基于阻抗的检测法在检测细胞毒性T细胞活性方面比标准的铬释放检测法更敏感

铬（⁵¹Cr释放试验（CRA）长期以来一直是监测CD8 T细胞反应的金标准，该试验通过测量细胞溶解活性来评估免疫应答。在此试验中，靶细胞（如肿瘤细胞）被标记上 ⁵¹Cr。在大多数情况下，健康的靶细胞在检测过程中能够保留大部分放射性标记。将CD8 T细胞以通常不同的浓度加入靶细胞中，通过检测靶细胞释放的放射性标记物来判断其杀伤情况。 ⁵¹Cr进入培养基。除了使用具有危害性的辐射外，CRA的另外两个主要问题是灵敏度不足，以及通常需要大量CD8 T细胞，从而限制了其应用。为了确定基于阻抗的检测方法是否比CRA更灵敏，我们制备了针对HER-2/neu p369特异性的T细胞 体外 并以不同量分别加入含有未标记肿瘤细胞的E-板或标准聚丙烯板中 ⁵¹Cr标记的靶细胞。在加入T细胞5小时后，测量阻抗或游离铬含量。 图4一个代表性示例表明，阻抗检测法优于铬释放法。

基于阻抗的检测方法在同一批次内的变异通常低于20%。

由于该检测方法的广泛应用在很大程度上取决于其可重复性和变异程度，因此对其批内变异进行了考察（图5）。两条特异性针对p369的T细胞系分别独立建立，间隔30天，并以肿瘤细胞与T细胞的不同比例设置三个复孔进行检测。图5中的插图显示，这两条T细胞系在裂解SKBR3细胞方面基本相当。在每种细胞比例下计算变异系数（CV）的百分比并作图。如图5所示，在1:40至1:5的比例范围内，%变异系数低于15%。然而，在1:2.5和1:1.25的比例下，变异系数较高或不可预测。由于存在较大的生物学变异，使用原代T细胞系无法测定批间变异。

图1. 添加T细胞后需对阻抗信号进行归一化处理。图A： 显示肿瘤细胞（红线）而非T细胞（蓝线）产生阻抗信号。图中展示了单独培养的肿瘤细胞或T细胞在40小时内的阻抗变化曲线。另一项独立实验也获得了相似结果。请注意，约20小时处的信号波动代表向不含肿瘤细胞的孔中添加T细胞的时间点。图B： 显示在将T细胞加入肿瘤细胞后，阻抗测量信号出现短暂干扰，因此需要在添加T细胞后的某个时间点进行归一化处理（见图中标记的归一化时间点）。曲线数据来自重复实验的两个数据点。单独肿瘤细胞的曲线以红色表示；其余曲线代表肿瘤细胞与HER-2/neu p369特异性T细胞共培养的结果（蓝色：T细胞与肿瘤细胞比例为1.25:1；绿色：T细胞与肿瘤细胞比例为40:1）。每条曲线均基于每5分钟采集一次的重复数据点计算得出。结果为3次独立实验的代表性数据。 点击此处查看高清大图。

图2. T细胞介导的阻抗降低呈剂量依赖性。图A： 显示单独培养的SKBR3肿瘤细胞或与不同浓度的肿瘤特异性T细胞共培养时的阻抗变化曲线。每条曲线基于培养期间每5分钟采集的三个重复数据点计算得出。结果代表3次独立实验。图B： 显示在10小时时所有T细胞/肿瘤细胞浓度下的细胞指数。虚线表示仅肿瘤细胞的细胞指数。每个符号代表三个重复测定的平均值（±标准误）。结果代表3次独立实验。 点击此处查看大图。

图3. 基于阻抗的检测方法可检测抗原特异性细胞毒性T细胞反应。图A 显示HER-2/neu p369特异性T细胞（红色）或FLU特异性T细胞（蓝色）在共培养后5、10和15小时对SKBR3细胞的裂解水平。每个数据点为三次重复测量的平均值（±标准误）。结果代表3次独立实验。图B 显示p369特异性T细胞或非特异性活化的T细胞对SKBR3细胞的裂解，表明抗原特异性裂解并非由Fas-Fas配体相互作用引起。黑色柱代表共培养体系中添加了Fas配体抗体的条件。每根柱为T细胞加入后5小时三次重复的平均裂解率（±标准误）。结果代表3次独立实验。图C 显示p369特异性T细胞在加入T细胞10小时后对SKBR3细胞的裂解依赖于HLA-I类分子。共培养过程中加入了HLA-I类分子阻断抗体或同型对照抗体。每根柱为三次重复的平均裂解率（±标准误）。该实验重复两次，结果相似。图D 显示p369特异性T细胞在加入T细胞10小时后对多种HLA-A2阳性且表达HER-2/neu的肿瘤细胞系的裂解百分比。BT20是一种HLA-A2阴性的乳腺癌细胞系，作为阴性对照。每个点代表一次独立实验，由三次重复测定计算得出。 点击此处查看高清大图。

图4. 基于阻抗的检测方法在检测肿瘤抗原特异性T细胞方面比铬释放法更敏感。 图中显示了使用阻抗法和铬释放法在肿瘤细胞与T细胞共孵育5小时后，不同浓度的p369特异性T细胞诱导SKBR3细胞裂解的百分比。每个数据点代表三个重复样本的平均值（±标准误）。结果代表三次独立实验的典型数据。

图5. 基于阻抗的T细胞细胞毒性检测的批内变异系数（%CV）。 图中显示了在不同浓度抗原特异性T细胞作用下，裂解SKBR3细胞的批内变异系数（%CV）的平均值（±标准差）。每个符号代表三个重复样本的均值。图中所示数字为平均%CV值。插图显示在不同浓度p369-377特异性T细胞作用下，SKBR3细胞裂解率的平均值（±标准误，n=3）。图中展示了使用来自两个不同供体的T细胞分别独立建立的两条p369特异性T细胞系。

讨论

CD8 T细胞在适应性免疫应答中具有重要作用，能够直接杀伤被感染的细胞或恶性细胞⁴. 尽管有多种方法可用于检测抗原特异性CD8 T细胞数量（如ELIspot、四聚体、流式细胞术），但通常更有助于了解这些细胞是否具有功能性的细胞毒性³评估细胞毒功能最广为人知的检测方法是细胞毒性释放试验（CRA），该方法被视为金标准检测。⁴CRA 的主要局限性包括：（1）需要使用放射性物质，（2）灵敏度不足，（3）无法提供机制性信息，（4）需要大量细胞，以及（5）操作繁琐。因此，在过去十年中，人们逐渐关注采用新策略以尽量减少这些局限性。较新的方法包括检测caspase释放的方法⁴，BLT酯酶活性5，以及CD107的表面表达⁶本文稿表明，在罗氏xCelligence系统上进行的基于阻抗的检测方法也可作为克隆形成分析法（CRA）的一种替代方案。采用基于阻抗方法的可行性依据在于：T细胞对表面黏附性较弱，对阻抗信号影响甚微，因而基本无需担忧T细胞对检测结果产生直接干扰。使用阻抗检测系统所需的劳动量预计将显著减少，主要原因是无需处理放射性物质所带来的监管问题。基于阻抗检测系统的唯一明显缺点是需投入50,000至60,000美元购买xCelligence设备。然而，该设备无需配备放射性计数仪，且功能更加多样，除可用于检测T细胞杀伤活性外，还可用于评估药物对细胞的效应以及细胞迁移等。 ⁸.

如图2所示，肿瘤细胞阻抗的降低呈剂量依赖性，且其变化曲线符合简单的二次函数关系，斜率较为陡峭，这表明该检测方法可用于有限稀释分析（LDAs），以估算细胞毒性细胞的频率⁹。基于阻抗的方法的一个优势在于，其所需的T细胞和肿瘤细胞数量少于传统铬释放法（CRA），从而使有限稀释分析更具可行性。例如，在CRA中，当效靶比为1:40时，每孔需接种1 × 10⁵个肿瘤细胞，相应地每孔需要4 × 10⁶个T细胞。而在基于阻抗的检测中，每孔仅需1.5 × 10⁴个肿瘤细胞，相应消耗的T细胞总数仅为每孔6 × 10⁵个。因此，基于阻抗的检测方法可减少85%的T细胞和肿瘤细胞使用量。这种显著减少提示，基于阻抗的系统可能适用于人体临床试验中的免疫学监测，尤其是在采血量有限的情况下。此外，CRA仅能提供单一时间点的数据，而基于阻抗的检测可连续采集实时数据，使研究者能够在同一次实验中比较多个裂解时间点，且无需额外耗费大量人力和细胞。频率计算结果还可与其他不依赖功能检测的方法（如四聚体分析）相结合，用于确定功能性细胞毒性T细胞与总抗原特异性CD8 T细胞之间的比例¹⁰。基于阻抗方法最吸引人的特点之一是，与其他大多数检测方法不同，它能够实时监测细胞毒性效应，从而更便于利用抑制剂或抗体研究细胞间的相互作用。另一个优势是，该方法可能适用于那些难以标记的肿瘤细胞。最后，由于未被杀伤的肿瘤细胞未被标记且保持无菌状态，因此可进一步收获并用于对T细胞抵抗性细胞的研究。

总之，尽管两种系统均可提供特定T细胞介导的肿瘤杀伤数据，但基于阻抗的检测方法比CRA更敏感，并且提供了更灵活的实验平台。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03	用于从血液中分离外周血单个核细胞（PBMCs）
RPMI 1640	Cellgro	10-040-CV	细胞培养基
FBS	德文郡科学公司	FB5001-H	细胞培养基
人 IL-2	eBioscience	14-8029-81	用于刺激T细胞生长
人干扰素γ	细胞科学	CR2026	用于刺激肿瘤细胞中MHC的表达
HER-2/neu p369-377 肽	梅奥诊所多肽合成中心	氨基酸序列 KIFGSLAFL	与 HLA-A2 结合
流感病毒p58-66肽	梅奥诊所多肽合成中心	氨基酸序列 GILGFVFTL	与 HLA-A2 结合
人CD3/CD28 Dynabeads	Invitrogen	111-61D	用于非特异性T细胞激活与扩增
铬-51	MP Biomedicals	62015	CRA标记试剂
E-板	罗氏集团	05469830001	用于 xCelligence 阻抗仪
Luma 96 孔板	PerkinElmer, Inc.	6005630	用于在 Top Count NXT 中测量放射性活性。
xCelligence RTCA DP 站	罗氏应用科学	RTCA DP	阻抗单位
Top 计数 NXT	PerkinElmer, Inc.	C990601	闪烁 && 发光计数器
Fas配体 抗体	BD 生物科学	556372	用于阻断 Fas-Fas 配体 相互作用
HLA-A2 BB7.2 抗体	BD 生物科学	551230	用于阻断 HLA I 类分子
小鼠 IgG2b， κ	BD 生物科学	555740	HLA I类分子同型对照
SKBR3 肿瘤细胞系	ATCC	HTB-30	腺癌
MCF7 肿瘤细胞系	ATCC	HTB-22	腺癌
HCC1419 肿瘤细胞系	ATCC	CRL-2326	原位导管癌
BT20 肿瘤细胞系	ATCC	HTB-19	癌