通过表面等离子共振检测毒素向宿主细胞胞质的转位

摘要

在本报告中，我们描述了如何利用表面等离子共振技术检测毒素进入宿主细胞胞质的过程。这种高灵敏度的方法可提供关于胞质内毒素含量的定量数据，并可应用于多种毒素的研究。

摘要

AB 毒素由具有酶活性的 A 亚基和负责细胞结合的 B 亚基组成¹。这些毒素被分泌到细胞外环境中，但其作用靶点位于真核细胞的胞质溶胶内。某些 AB 毒素通过囊泡载体从细胞表面转运至内质网（ER），然后进入胞质溶胶^2-4。在内质网中，催化性的 A 链从毒素其余部分解离，并经由一种蛋白质转运通道进入胞质溶胶以作用于其靶标⁵。由于毒素向内质网的转运过程效率极低，转位至胞质溶胶的 A 链难以被检测到：大多数内吞的毒素被定向转运至溶酶体进行降解，仅有少量结合于细胞表面的毒素能够到达高尔基体和内质网^6-12。

为了监测毒素从内质网向培养细胞胞质溶胶的转位过程，我们将亚细胞分级分离方案与高灵敏度的表面等离子体共振（SPR）检测方法相结合^13-15。用皂苷选择性地通透化毒素处理细胞的质膜，从而收集胞质溶胶组分，随后将其流经涂有抗毒素A链抗体的SPR传感器。该抗体包被的传感器可捕获并检测皮克每毫升（pg/mL）量级的胞质毒素。利用该方案，可追踪毒素进入胞质溶胶的动力学过程，并表征对转位事件的抑制效应。通过已知浓度A链标准品在传感器上流经后生成的标准曲线，还可计算胞质溶胶中毒素的浓度。本方法是一种快速、灵敏且定量的检测系统，无需对目标毒素进行放射性标记或其他修饰。

方案

1. 原生质体的制备

1. 向一个微量离心管中加入 500 μL 的 100% 乙醇，并将其置于 80 °C 的加热块中孵育 10 分钟。
2. 将 2.5 mg 的皂苷溶于 250 μL 预热的乙醇中，配制成 1% 的皂苷储备液。
3. 为配制 0.04% 的皂苷工作液，取 40 μL 皂苷储备液加入 960 μL 的 HCN 缓冲液（50 mM Hepes pH 7.5、150 mM NaCl、2 mM CaCl₂、10 mM N-乙基马来酰亚胺和蛋白酶抑制剂混合物）中。

2. 细胞中毒与通透化

我们的易位检测方法可应用于多种毒素和细胞系。以下我们提供了霍乱毒素（CT）检测的详细方案。图1给出了该操作流程的概览。

1. 将HeLa细胞接种于6孔板中，每孔加入1 mL添加了10%胎牛血清和抗生素-抗真菌剂的DMEM培养基，于37 °C过夜培养后使每孔细胞数量达到1×10⁶个。为获得足量的胞质毒素以实现可重复检测，每种实验条件需设置三个复孔。
2. 过夜培养后，弃去原培养基，每孔加入含100 ng/mL神经节苷脂GM1的1 mL DMEM培养基。此举可增加霍乱毒素（CT）的结合位点，因为CT的受体GM1会嵌入暴露于GM1溶液中的细胞质膜内。
3. 在37 °C孵育1小时后，移除含GM1的培养基，用DMEM洗涤细胞两次，然后将细胞置于含1 μg/mL CT的1 mL DMEM中，在4 °C孵育30分钟。
4. 移除含毒素的培养基，用DMEM洗涤细胞两次，随后将细胞在37 °C下用1 mL DMEM继续培养至所需的时间点。
5. 每个追踪时间点结束时，用PBS洗涤细胞，每孔加入250 μL含0.5 mM EDTA的PBS溶液。室温静置10分钟后，使用P1000移液器剧烈吹打使细胞脱离孔板。收集完一个孔的细胞后，将其与同条件下的第二孔和第三孔细胞合并。也可使用细胞刮刀收集细胞。
6. 将三个重复孔的细胞悬液（总体积750 μL）合并至同一微量离心管中，在台式微量离心机中以5,000 × g离心5分钟。所有实验条件下应获得大小相近的细胞沉淀。
7. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 μL的0.04%皂苷工作液中，冰上放置10分钟。
8. 将经皂苷透化的细胞在台式微量离心机中以16,000 × g离心10分钟。将含有胞质成分的上清液转移至新的微量离心管中，保留含有细胞器的沉淀部分。

3. 样品制备

1. 含细胞质的上清组分用 HCN 缓冲液稀释至终体积为 1 mL。样品体积至少需达到 1 mL，以确保进样前将 500 μL 样品环中的空气完全排出。
2. 含细胞器的沉淀组分在含有 1% Triton X-100 的 1 mL HCN 缓冲液中重悬。添加去垢剂是释放膜包被毒素库所必需的。
3. 在 HCN 缓冲液中配制浓度分别为 100、10、1 和 0.1 ng/mL 的毒素标准品。
4. 为验证分步分离过程的可靠性，平行制备细胞质组分和细胞器组分用于对照实验。按照第 2 节所述方法获得的组分分别用 20 μL 4x 上样缓冲液（细胞质组分）或 120 μL 1x 上样缓冲液（细胞器组分）重悬。各组分取等体积进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过 Western 印迹分析检测，以证明细胞质蛋白分布于上清组分中，而可溶性、定位于内质网的蛋白则分布于沉淀组分中^16-19。

4. SPR 芯片制备

1. Reichert SR7000 SPR 折光仪用于 SPR 实验。
2. 将带有自组装单分子层的镀金玻璃片放入 SPR 仪器中。为激活传感器片，以 41 μL/min 的流速在玻璃片上灌注 0.4 M EDC 与 0.1 M NHS 按 1:1 (v:v) 混合的溶液，持续 10 分钟。后续所有灌注步骤均使用相同的流速。
3. 使用含 0.05% Tween 20 的 PBS（PBST）洗涤 5 分钟，以去除 EDC:NHS 激活缓冲液。此时，由于 EDC:NHS 溶液去除了保护基团，芯片表面已形成具有反应活性的酰胺锚定基团。
4. 将抗 CTA 抗体以 1:20,000 的稀释比例溶于 20 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5.5）中，灌注至已激活的传感器片上，持续 15 分钟。由于 pH 变化，折射率单位（RIU）会首先出现短暂下降，随后随着抗体被传感器片上的酰胺反应性锚定基团捕获，RIU 将逐渐上升。
5. 用 PBST 洗涤 5 分钟，去除传感器片上未结合的抗体。被捕获抗体所产生的 RIU 信号将趋于平稳并稳定下来，形成新的基线信号。
6. 以 1 M 乙醇胺（pH 8.5）溶液灌注传感器片 5 分钟，以封闭并失活传感器片上残留的未反应锚定基团。

5. 样品的 SPR 分析

1. 为建立基线读数，用 PBST 对抗体包被的传感器灌注 5 分钟。
2. 将实验样品或毒素标准品溶液灌注过传感器，持续 300 秒。随后从缓冲液中去除配体，并用 PBST 继续灌注传感器 200 秒。
3. 每次灌注后，使用 pH 5.0 的 PBST 对传感器进行 100 秒的清洗，以去除传感器上结合的毒素。此步骤可使信号恢复至初始基线水平，从而允许在同一传感器上处理下一个样品。
4. 在加载新样品前，推动少量空气通过样品环路，以排出前一样品残留的液体。根据 5.2–5.4 节所述步骤，我们已在同一张芯片上连续运行多达 12 个样品，且基线信号未出现明显衰减。
5. 数据分析使用 Scrubber 2 软件完成，图形制作则采用 Igor 软件。

6. 代表性结果

百日咳毒素（PT）是一种AB型毒素，可从细胞表面转运至内质网，随后其A亚基（PTS1）进入细胞质^{3, 12}。如图2所示，我们基于表面等离子共振（SPR）的转位检测方法能够检测到中毒CHO细胞细胞质中的PTS1。未中毒细胞的细胞质部分未产生任何信号，这证实抗-PTS1抗体不会与宿主细胞质中的组分发生交叉反应。在存在布雷菲德菌素A（BfA）的情况下中毒的细胞，其细胞质组分也未能产生阳性信号。BfA可阻止毒素向内质网转位位点的运输^{6-8, 12, 20-25}，从而抑制A亚基向细胞质的递送。每次运行结束后，结合的毒素会从传感器芯片表面被剥离。这使得多个样品可在同一传感器芯片上进行检测，从而实现了不同实验条件下所得结果的直接比较。

CT 是另一种 AB 型、可进入内质网的毒素⁴。在图 3A 中，可在 CT 处理的 HeLa 细胞的胞质组分中检测到 CTA1。这表明我们的方法适用于多种细胞类型，并可用于任何已有抗 A 链抗体的毒素。当将 CT 处理细胞的胞质组分流经涂覆有抗 CTB 抗体的 SPR 传感器时，未检测到信号（图 3B），从而证明只有 CTA1 亚基而非负责细胞结合的 CTB 五聚体进入胞质。图 3C 显示，与较弱的胞质组分信号相比，细胞器组分的信号超出量程。这与已知的 CT 向内质网转位位点转运效率较低的现象一致^6,7，后者进而限制了能够到达胞质的毒素量。此外，细胞器组分中既包含完整的 CT 全毒素，也包含定位于内质网的 CTA1，因此细胞器组分的 SPR 信号因全毒素相关 CTB 五聚体的额外质量而被放大。因此，将细胞器组分与胞质组分的数据绘制在同一张传感图上并不合理。

我们的检测方法可以监测易位至细胞质的毒素随时间推移的累积情况（图4）。细胞在4 °C下暴露于霍乱毒素（CT），该温度允许毒素结合到质膜上，但阻止与细胞结合的毒素发生内化。在去除未结合的毒素后，将细胞升温至37 °C。在此温度下，毒素可转运至内质网，同时A亚基可易位至细胞质。升温至37 °C后15分钟内，未检测到细胞质中的毒素，这反映了以下过程所需的滞后时间：（i）全毒素向内质网的运输；（ii）内质网中A/B亚基的解离；以及（iii）A链向细胞质的输出。在37 °C孵育30分钟后，检测到少量细胞质毒素，而在45分钟和60分钟的追踪间隔后，检测到的细胞质毒素量逐步增加。在5小时的追踪间隔后，检测到更高水平的细胞质毒素¹⁷，从而证明与细胞结合的毒素持续且长期地递送至宿主细胞质中。

我们的检测方法还可检测毒素向细胞质转位的抑制作用（图5）。用10%二甲基亚砜（DMSO）处理的细胞中，细胞质内的CTA1水平较低，而对照组未处理细胞中则较高；DMSO是一种化学伴侣分子，可防止分离的CTA1亚基发生热变性（T. Banerjee 和 K. Teter，未发表观察结果）。毒素A链的去折叠是其转位至细胞质的先决条件^16-18，因此DMSO诱导的CTA1稳定性阻碍了其从内质网向细胞质的转移。

表面等离子共振（SPR）实验测得的结合速率常数（k_a）与灌注缓冲液中配体的浓度成正比^{14, 15, 26}。因此，可以通过绘制毒素标准品的k_a值随毒素浓度变化的曲线图来确定细胞质中毒素的浓度。该方法被用于定量分析图5中所示的DMSO对毒素转位的抑制作用：利用已知浓度毒素生成的标准曲线，计算得出未处理细胞的细胞质CTA1浓度为0.3 ng/mL，DMSO处理细胞的细胞质CTA1浓度为0.1 ng/mL（图6）。因此，DMSO对CTA1去折叠的抑制导致CTA1从内质网向细胞质的转位减少了3倍。

图 1. 实验流程概述。（A）细胞在 4 °C 条件下与 AB 毒素共同孵育，该温度允许毒素结合细胞表面，但阻止其内吞作用。毒素的 A 亚基和 B 亚基分别以红色和蓝色圆圈表示。（B）去除未结合的毒素后，将细胞升温至 37 °C，以促进全毒素的内吞作用及其逆行转运至内质网（ER）。全毒素在内质网中解离，释放出的 A 链可通过内质网膜上的蛋白质传导通道进入细胞质。（C）用皂苷（digitonin）处理细胞，以选择性地通透细胞膜。（D）通过离心将细胞分为细胞质和细胞器两个组分。细胞质内容物经由皂苷形成的孔隙被挤出，存在于上清液中；完整且有膜包被的细胞器则存在于沉淀组分中。（E）为检测已转位至宿主细胞质中的毒素 A 链，将上清液组分流经表面等离子共振（SPR）传感器，该传感器表面包被有抗 A 链抗体。

图 2. 检测PTS1向宿主细胞胞质中的转位。CHO细胞在4 °C下用1 μg/mL的PT脉冲标记30分钟。随后，细胞在37 °C下于不含毒素且未添加任何成分的培养基中继续培养3小时（中毒状态），或在含5 μg BfA/mL的培养基中培养（+BfA中毒状态）。通过皂苷（digitonin）对质膜进行透化处理，将细胞提取物分为细胞器组分和胞质组分。使用涂覆有抗-PTS1抗体的SPR传感器检测未经处理或经BfA处理细胞中的胞质PTS1。将PTS1标准品流经传感器作为阳性对照，而未中毒细胞的胞质组分则作为阴性对照流经传感器芯片。每次运行结束后，从传感器芯片上清除已结合的样品。

图3. 检测CTA1向宿主细胞质的转位。HeLa细胞在4 °C下用1 μg/mL的CT脉冲标记，随后在不含毒素且未添加其他成分（中毒）或含5 μg BfA/mL（+BfA中毒）的培养基中于37 °C继续培养2小时。使用皂苷（digitonin）透化细胞膜，将细胞裂解物分离为细胞器组分和细胞质组分。（A）将细胞质组分流经包被有抗-CTA抗体的SPR传感器。以已知量的CTA作为阳性对照，未中毒细胞的细胞质作为阴性对照。（B）将未添加BfA条件下中毒细胞的细胞质组分流经包被有抗-CTB抗体的SPR传感器。纯化的CTB五聚体作为阳性对照流经芯片。（C）细胞器组分在流经包被有抗-CTA抗体的SPR传感器前，用1% Triton X-100溶解。为便于比较，来自同一细胞裂解物的细胞质组分（终体积1 mL）以及CTA标准品也同时流经传感器。所有图谱中，每次运行结束后均将结合的样品从传感器上剥离。

图 4. CTA1进入细胞质的动力学。HeLa细胞在4 °C下用1 μg/mL的CT脉冲标记后，在无毒素培养基中于37 °C分别追逐15、30、45或60分钟。为检测已转位的毒素群体，将经皂苷（digitonin）透化的细胞的细胞质组分流经包被有抗CTA抗体的SPR传感器。同时，也将CTA标准品流经该传感器。每次运行结束后，从传感器芯片上清除已结合的样品。

图5. DMSO对CTA1转位的抑制作用。在4 °C条件下，用1 μg/mL的CT对HeLa细胞进行脉冲标记，随后在37 °C无毒素培养基中孵育2小时，培养基中不添加任何成分（中毒状态）或添加10% DMSO（+DMSO中毒状态）。为检测已转位的毒素，将经皂苷（digitonin）透化的细胞胞质组分流经涂覆抗CTA抗体的SPR传感器。将CTA标准品（100、10、1和0.1 ng/mL）流经传感器作为阳性对照；出于比例显示需要，仅展示1和0.1 ng/mL的标准品曲线。未中毒细胞的胞质组分作为阴性对照。每次运行结束后，从传感器芯片上清除已结合的样品。

图 6. 胞质 CTA1 的定量计算。k_a 值来自图 5 中的 CTA 标准品，将其对毒素浓度作图。所得标准曲线用于根据图 5 中实验样品的 k_a 值，确定未经处理和经 DMSO 处理细胞中胞质 CTA1 的浓度。毒素标准品以实心圆圈表示；未处理的胞质提取物以空心方块表示；DMSO 处理的胞质提取物以空心圆圈表示。数据展示两次独立实验的平均值 ± 范围。

讨论

与现有方法的比较

基于 SPR 的转位检测方法是一种快速、灵敏且定量的检测毒素进入宿主细胞胞质的方法。该技术无需对毒素进行放射性标记或其他修饰，且适用于任何可获得抗毒素 A 链抗体的毒素。目前监测毒素进入胞质的方法依赖于亚细胞分级分离方案，将细胞裂解物分离为胞质和膜组分^{11, 23, 27, 28}。这些方法采用 Western 印迹或放射性标记来检测胞质中的毒素。前者最多仅为半定量，且灵敏度相对较低。即使是放射性标记方法，由于到达胞质的毒素水平极低，也可能需要数周时间才能获得结果。虽然使用放射性标记毒素的定量分析可确定进入胞质的细胞相关毒素的相对百分比，但该方法无法直接确定胞质中毒素分子的确切数量。因此，将 SPR 检测毒素的灵敏度与放射性标记检测进行比较存在困难，因为 SPR 可以计算胞质毒素的数量，而放射性标记则不能。

其他易位检测方法绕过了上游的毒素运输步骤，利用基于质粒的表达系统或体外转录/翻译系统，直接将毒素A链递送至内质网^29-38。对于这两种方法，N端信号序列均可引导A...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
乙醇	Acros Organics	61509-0010
DMEM	Invitrogen	11995065
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550
神经节苷脂 GM1	Sigma-Aldrich	G7641
CTA	Sigma-Aldrich	C2398
PTS1	List	182
NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）	Pierce, Thermo Scientific	24500
EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22981
乙醇胺	Sigma-Aldrich	E0135
PBST	Medicago	09-8903-100
抗CTA抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-80747
抗CTB抗体	Calbiochem	227040
抗PTS1抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-57639
折光仪	Reichert	SR7000, SR7000DC
SPR传感器芯片	Reichert	13206060
注射泵	Cole-Parmer	780200C