位点特异性细菌染色体工程：φC31 整合酶介导的盒式交换（IMCE）

摘要

本文介绍了一种将目标外源DNA快速高效地整合到预制受体菌株（称为着陆垫菌株）中的方法。该方法通过接合及ΦC31整合酶的表达，实现DNA表达盒在特定工程化着陆垫位点上的定点整合。

摘要

细菌染色体可用于稳定维持长达兆碱基范围的外源DNA¹染色体整合可避免质粒复制、质粒稳定性、质粒不相容性以及质粒拷贝数变异等问题。该方法利用位点特异性整合酶 链霉菌属 噬菌体（Φ）C31^2,3ΦC31 整合酶催化两个特定 DNA 位点之间的直接重组： attB 和 attP （分别为34和39 bp）⁴该重组是稳定的，不会发生回复突变。⁵一个由壮观霉素抗性基因组成的“着陆平台”（LP）序列， aadA (SpR）以及 大肠杆菌 β-葡萄糖醛酸酶基因（uidA两侧由 attP 位点已整合到染色体中 Sinorhizobium meliloti，Ochrobactrum anthropi 和 Agrobacterium tumefaciens 在基因间区域 ampC 位点，以及 tetA 位点，分别。 S. meliloti 在本方案中使用了包含可移动供体质粒的载体。 attB 侧翼位点，位于一个填充型红色荧光蛋白（rfp 基因和抗生素抗性基因也已被构建。在此示例中，使用的是庆大霉素抗性质粒 pJH110。 rfp 基因⁶ 可使用所需的结构进行替换 Sph我与 PstI. 或者，可使用两侧带有合成结构的构建体 attB 位点可亚克隆至可移动载体（如pK19mob）中⁷ΦC31整合酶基因（克隆自pHS62）的表达⁸由 lac 启动子，位于可接合的广宿主范围质粒pRK7813上⁹.

采用四亲本杂交方法将供体质粒导入LP菌株，从而用供体质粒替换LP序列中的标记基因。这些细胞即为转整合子。转整合子的形成效率通常为0.5%。通过抗生素敏感性检测或利用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸（X-gluc）进行蓝白斑筛选，通常可在前500至1,000个菌落中鉴定出转整合子。本实验方案包含创建和分离转整合子的杂交与筛选步骤。

方案

1. 培养物的制备

1. 制备无菌液体培养基：TY¹⁰（5 g/l 胰蛋白胨，3 g/l 酵母提取物，0.44 g/l 氯化钙二水合物），以及 LB¹¹（10 g/l 胰蛋白胨，5 g/l 酵母提取物，5 g/l 氯化钠，pH 7）。
2. 从单菌落接种：将 SmUW227（S. meliloti LP 菌株：构建方法将在别处描述，菌株构建细节可应要求提供）接种至 5 ml 含 50 μg/ml 螺旋霉素的 TY 培养基中；将以下菌株接种至 5 ml LB 液体培养基中，并添加指定抗生素：含 pJC2（整合酶表达质粒）的 E. coli DH5α¹²，添加 10 μg/ml 四环素；E. coli MT616¹³（辅助菌株），添加 10 μg/ml 氯霉素；含 pJH110（供体质粒）的 E. coli DH5α，添加 5 μg/ml 庆大霉素。
3. 将 E. coli 菌株在 37 °C 下振荡培养过夜。将 S. meliloti 菌株在 30 °C 下振荡培养两天。使用较大接种量（饱和培养物按 1:500 转接）也可在过夜培养中获得 S. meliloti 培养物。

2. 培养物制备与混合

讨论

IMCE 技术可将单个两侧带有 attB 的 DNA 破碎片段高效整合到已构建菌株的 LP 位点。一旦目标构建体被克隆至 rfp 的位置以形成供体片段，该技术便无需后续的 DNA 纯化与转化步骤，因而具有很高的稳健性。必须设置适当的生长对照，以确保抗生素抗性的确源于顺式整合子的形成，而非其他因素。

IMCE 以大约 0.5% 的效率产生跨整合子。相比之下，通过同源重组发生的双交换频率约为 10^-6。通过 λ-red¹⁶ 进行的重组工程是另一种基于噬菌体的系统，需要特定的同源序列，且在 E. coli¹⁷ 以外的生物中效果差异较大。另一种选择 Tn7 位点特异性重组需要 attTn7 位点¹⁸，而这些位点在 γ-变形菌以外的生物中极为罕见。ΦC31 整合酶已在多种不同宿主中表现出高效的活性^4,19。尽管使用 ΦC31 整合酶需要预先对宿主进行改造，但其应用不受特定门类的限制。IMCE 具有效率高和模块化的优势，因为任何供体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
链霉素	BioShop Canada	STP101
壮观霉素	BioShop Canada	SPE201
庆大霉素	BioShop Canada	GTA202
氯霉素	BioShop Canada	CLR201
四环素	BioShop Canada	TET701
卡那霉素	BioShop Canada	KAN201
细菌学级琼脂	BioShop Canada	AGR001
胰蛋白胨	BioShop Canada	TRP402
酵母提取物	BioShop Canada	YEX401
氯化钠	BioShop Canada	SOD001
氯化钙	BioShop Canada	CCL444
X-gluc	Gold Biotechnology	G1281C1
E. coli MT616 菌株	可应要求提供		亦在本实验室以外使用
E. coli pJC2 菌株	本实验室自备
E. coli pJH110 菌株	本实验室自备
SmUW227 菌株	本实验室自备