本文介绍了一种将目标外源DNA快速高效地整合到预制受体菌株（称为着陆垫菌株）中的方法。该方法通过接合及ΦC31整合酶的表达，实现DNA表达盒在特定工程化着陆垫位点上的定点整合。
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摘要
摘要
细菌染色体可用于稳定维持长达兆碱基范围的外源DNA1染色体整合可避免质粒复制、质粒稳定性、质粒不相容性以及质粒拷贝数变异等问题。该方法利用位点特异性整合酶 链霉菌属 噬菌体（Φ）C312,3ΦC31 整合酶催化两个特定 DNA 位点之间的直接重组： attB 和 attP （分别为34和39 bp）4该重组是稳定的，不会发生回复突变。5一个由壮观霉素抗性基因组成的“着陆平台”（LP）序列， aadA (SpR）以及 大肠杆菌 β-葡萄糖醛酸酶基因（uidA两侧由 attP 位点已整合到染色体中 Sinorhizobium meliloti，Ochrobactrum anthropi 和 Agrobacterium tumefaciens 在基因间区域 ampC 位点，以及 tetA 位点，分别。 S. meliloti 在本方案中使用了包含可移动供体质粒的载体。 attB 侧翼位点，位于一个填充型红色荧光蛋白（rfp 基因和抗生素抗性基因也已被构建。在此示例中，使用的是庆大霉素抗性质粒 pJH110。 rfp 基因6 可使用所需的结构进行替换 Sph我与 PstI. 或者，可使用两侧带有合成结构的构建体 attB 位点可亚克隆至可移动载体（如pK19mob）中7ΦC31整合酶基因（克隆自pHS62）的表达8由 lac 启动子，位于可接合的广宿主范围质粒pRK7813上9.
采用四亲本杂交方法将供体质粒导入LP菌株，从而用供体质粒替换LP序列中的标记基因。这些细胞即为转整合子。转整合子的形成效率通常为0.5%。通过抗生素敏感性检测或利用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸（X-gluc）进行蓝白斑筛选，通常可在前500至1,000个菌落中鉴定出转整合子。本实验方案包含创建和分离转整合子的杂交与筛选步骤。
方案
1. 培养物的制备
- 制备无菌液体培养基：TY10（每升含 5 克胰蛋白胨、3 克酵母提取物、0.44 克二水合氯化钙），以及 LB11（每升含 10 克胰蛋白胨、5 克酵母提取物、5 克氯化钠，pH 7）。
- 从单菌落接种：将 SmUW227（S. meliloti LP 菌株：构建方法将在别处描述，构建细节可应要求提供）接种至 5 ml 含 50 μg/ml 链霉素的 TY 培养基中；将以下菌株分别接种至 5 ml LB 液体培养基中，并添加相应抗生素：含 pJC2（整合酶表达质粒）的 E. coli DH5α12，添加 10 μg/ml 四环素；E. coli MT61613（辅助菌株），添加 10 μg/ml 氯霉素；含 pJH110（供体质粒盒）的 E. coli DH5α，添加 5 μg/ml 庆大霉素。
- 将 E. coli 菌株在 37 °C 条件下振荡培养过夜。将 S. meliloti 菌株在 30 °C 条件下振荡培养两天。若使用较大接种量（饱和培养物按 1:500 比例转接），也可在过夜培养中获得 S. meliloti 培养物。
2. 培养物的制备与混合
- 每种菌株取1.5 ml培养物，于17,000 × g离心30秒收集菌体沉淀，用1 ml无菌0.85% NaCl重悬，洗涤一次；重复该步骤一次。
- 将菌体沉淀重悬于100 μl无菌0.85% NaCl中。
- 将每种菌株洗涤后的培养物各取10 μl，分别点样于普通TY琼脂平板上。这些点样位置为对照点。
- 除携带pJC2的E. coli DH5α12外，将其他各菌株40 μl加入无菌离心管中，混匀，取120 μl该混合液点样于普通TY琼脂平板上。此点样位置为无整合酶阴性对照。
- 将每种菌株各取40 μl加入无菌离心管中，混匀，取160 μl该混合液点样于普通TY琼脂平板上。此点样位置为IMCE接合点样位点。
- 将点样后的平板置于超净工作台中晾干。
- 密封平板，于30 °C过夜培养。
3. 转整合子的分离
- 将对照菌株和IMCE菌株划线接种至添加了200 μg/ml链霉素（SmUW227基于Rm1021构建，后者携带赋予高水平链霉素抗性的突变14）和30 μg/ml庆大霉素的TY琼脂平板上。
- 为计算IMCE效率，将约四分之一的IMCE接合斑块重悬于500 μl无菌0.85% NaCl溶液中。进行10倍系列稀释至10-7。取10-2至10-5稀释液涂布于添加200 μg/ml链霉素和30 μg/ml庆大霉素的TY琼脂平板，用于筛选转整合子。取10-3至10-7稀释液涂布于添加200 μg/ml链霉素的TY琼脂平板，用于筛选转整合子及潜在受体菌，即总受体菌数。
- 为分离无标记转整合子，将约四分之一的IMCE接合斑块重悬于500 μl无菌0.85% NaCl溶液中。进行10倍系列稀释至10-6。取10-4至10-6稀释液涂布于四块添加200 μg/ml链霉素和200 μg/ml X-gluc的TY琼脂平板。
- 将平板在30 °C下培养3天。
- 在绿光（525 nm）照射下并通过红色滤光片（>610 nm）观察RFP转整合子15。
- 以转整合子菌落形成单位（CFU）与总受体菌CFU之比计算IMCE效率百分比。约一半的转整合子会发生真正的盒式交换，表现为白色菌落且对壮观霉素敏感。
- 为筛选无标记转整合子（当供体质粒不含Gmr，如pJH110时），挑选白色菌落（延长培养时间，在室温下额外培养1–2天，可增强X-gluc对菌落的显色区分效果，这在S. meliloti SmUW227中是必要的），并通过在不含抗生素的TY琼脂平板和含100 μg/ml壮观霉素的TY琼脂平板上进行抗性检测，确认该菌落对壮观霉素敏感。
4. 代表性结果
在添加链霉素和庆大霉素的TY培养基上培养三天后，对照组划线区域应无任何生长。IMCE划线区域应在第一道划线上呈现融合生长，第二道划线上出现大量菌落，如图2所示。转座整合效率（以转座整合子占总受体菌的比例表示）应在0.5%左右。约一半的转座整合子对壮观霉素敏感且菌落呈白色，表明其已发生真正的盒式交换。含有来自pJH110质粒的测试用rfp供体盒的转座整合子，在绿色光（525 nm）照射下并通过红色滤光片（>610 nm）观察时，应显示出可辨别的RFP荧光15。
图1. 接合混合物示意图：在pRK600表达的转移基因辅助下，所有质粒在细胞间随机转移。该转移导致混合物中产生转整合子，即LP菌株获得了进行IMCE所必需的两种质粒——整合酶（int）辅助质粒pJC2和供体质粒pJH110。通过ΦC31整合酶的作用，非复制型供体质粒（pJH110）上的供体盒与染色体上LP盒的标记发生交换，结果导致LP标记（Spr 和 uidA）丢失，而供体盒（rfp 和 Gmr）则保留在最终形成的转整合子中。
图 2. A：非选择性 TY 平板上的接合斑点平板，显示琼脂表面干燥的细胞混合物。B：在链霉素-庆大霉素-X-半乳糖平板上划线的接合斑点，从左上角顺时针依次为：无整合酶对照、IMCE 插入 S. meliloti、含 pJC2 质粒的 E. coli DH5α 对照、含 pJH110 质粒的 E. coli DH5a 对照、E. coli MT616 对照，以及 S. meliloti UW227 对照。C：接合斑点重悬液 10-2 稀释后涂布于 TY 链霉素-X-半乳糖琼脂平板。D：接合斑点重悬液 10-2 稀释后涂布于 TY 链霉素-庆大霉素-X-半乳糖琼脂平板（蓝色菌落为单个重组子，白色菌落发生了真正的盒式交换）。E：接合斑点重悬液 10-2 稀释后涂布于 TY 链霉素-X-半乳糖琼脂平板，显示无荧光。F：接合斑点重悬液 10-2 稀释后涂布于 TY 链霉素-庆大霉素-X-半乳糖琼脂平板，显示两种水平的荧光（较亮的菌落对应蓝色菌落，rfp 表达更高，推测是由于载体序列中启动子的通读所致；而发生真正盒式交换的菌落仅保留 RFP 及其紧邻的启动子，载体中的 lac 启动子缺失，因此无通读现象）。
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讨论
IMCE 技术可将单个两侧带有 attB 的 DNA 破碎片段高效整合到已构建菌株的 LP 位点。一旦目标构建体被克隆至 rfp 的位置以形成供体片段，该技术便无需后续的 DNA 纯化与转化步骤，因而具有很高的稳健性。必须设置适当的生长对照，以确保抗生素抗性的确源于顺式整合子的形成，而非其他因素。
IMCE 以大约 0.5% 的效率产生跨整合子。相比之下，通过同源重组发生的双交换频率约为 10-6。通过 λ-red16 进行的重组工程是另一种基于噬菌体的系统，需要特定的同源序列，且在 E. coli17 以外的生物中效果差异较大。另一种选择 Tn7 位点特异性重组需要 attTn7 位点18，而这些位点在 γ-变形菌以外的生物中极为罕见。ΦC31 整合酶已在多种不同宿主中表现出高效的活性4,19。尽管使用 ΦC31 整合酶需要预先对宿主进行改造，但其应用不受特定门类的限制。IMCE 具有效率高和模块化的优势，因为任何供体...
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致谢
感谢 Margaret C.M. Smith 慷慨提供整合酶克隆
资金支持来自：
Genome Canada/Genome Prairie
NSERC 发现项目和战略性项目资助
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 链霉素 | BioShop Canada | STP101 | |
| 壮观霉素 | BioShop Canada | SPE201 | |
| 庆大霉素 | BioShop Canada | GTA202 | |
| 氯霉素 | BioShop Canada | CLR201 | |
| 四环素 | BioShop Canada | TET701 | |
| 卡那霉素 | BioShop Canada | KAN201 | |
| 细菌学级琼脂 | BioShop Canada | AGR001 | |
| 胰蛋白胨 | BioShop Canada | TRP402 | |
| 酵母提取物 | BioShop Canada | YEX401 | |
| 氯化钠 | BioShop Canada | SOD001 | |
| 氯化钙 | BioShop Canada | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology | G1281C1 | |
| E. coli MT616 菌株 | 可应要求提供 | 亦在本实验室以外使用 | |
| E. coli pJC2 菌株 | 本实验室自备 | ||
| E. coli pJH110 菌株 | 本实验室自备 | ||
| SmUW227 菌株 | 本实验室自备 |
参考文献
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