位点特异性细菌染色体工程：φC31 整合酶介导的盒式交换（IMCE）

摘要

本文介绍了一种将目标外源DNA快速高效地整合到预制受体菌株（称为着陆垫菌株）中的方法。该方法通过接合及ΦC31整合酶的表达，实现DNA表达盒在特定工程化着陆垫位点上的定点整合。

摘要

细菌染色体可用于稳定维持长达兆碱基范围的外源DNA¹染色体整合可避免质粒复制、质粒稳定性、质粒不相容性以及质粒拷贝数变异等问题。该方法利用位点特异性整合酶 链霉菌属 噬菌体（Φ）C31^2,3ΦC31 整合酶催化两个特定 DNA 位点之间的直接重组： attB 和 attP （分别为34和39 bp）⁴该重组是稳定的，不会发生回复突变。⁵一个由壮观霉素抗性基因组成的“着陆平台”（LP）序列， aadA (SpR）以及 大肠杆菌 β-葡萄糖醛酸酶基因（uidA两侧由 attP 位点已整合到染色体中 Sinorhizobium meliloti，Ochrobactrum anthropi 和 Agrobacterium tumefaciens 在基因间区域 ampC 位点，以及 tetA 位点，分别。 S. meliloti 在本方案中使用了包含可移动供体质粒的载体。 attB 侧翼位点，位于一个填充型红色荧光蛋白（rfp 基因和抗生素抗性基因也已被构建。在此示例中，使用的是庆大霉素抗性质粒 pJH110。 rfp 基因⁶ 可使用所需的结构进行替换 Sph我与 PstI. 或者，可使用两侧带有合成结构的构建体 attB 位点可亚克隆至可移动载体（如pK19mob）中⁷ΦC31整合酶基因（克隆自pHS62）的表达⁸由 lac 启动子，位于可接合的广宿主范围质粒pRK7813上⁹.

采用四亲本杂交方法将供体质粒导入LP菌株，从而用供体质粒替换LP序列中的标记基因。这些细胞即为转整合子。转整合子的形成效率通常为0.5%。通过抗生素敏感性检测或利用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸（X-gluc）进行蓝白斑筛选，通常可在前500至1,000个菌落中鉴定出转整合子。本实验方案包含创建和分离转整合子的杂交与筛选步骤。

方案

1. 培养物的制备

1. 制备无菌液体培养基：TY¹⁰（5 g/l 胰蛋白胨，3 g/l 酵母提取物，0.44 g/l 氯化钙二水合物），以及 LB¹¹（10 g/l 胰蛋白胨，5 g/l 酵母提取物，5 g/l 氯化钠，pH 7）。
2. 从单菌落接种：将 SmUW227（S. meliloti LP 菌株：构建方法将在别处描述，菌株构建细节可应要求提供）接种至 5 ml 含 50 μg/ml 螺旋霉素的 TY 培养基中；将以下菌株接种至 5 ml LB 液体培养基中，并添加指定抗生素：含 pJC2（整合酶表达质粒）的 E. coli DH5α¹²，添加 10 μg/ml 四环素；E. coli MT616¹³（辅助菌株），添加 10 μg/ml 氯霉素；含 pJH110（供体质粒）的 E. coli DH5α，添加 5 μg/ml 庆大霉素。
3. 将 E. coli 菌株在 37 °C 下振荡培养过夜。将 S. meliloti 菌株在 30 °C 下振荡培养两天。使用较大接种量（饱和培养物按 1:500 转接）也可在过夜培养中获得 S. meliloti 培养物。

2. 培养物制备与混合

1. 取每种菌株的1.5 ml培养物，于17,000 × g离心30秒收集菌体沉淀，用1 ml无菌0.85% NaCl重悬，洗涤一次；重复此步骤一次。
2. 将菌体沉淀重悬于100 μl无菌0.85% NaCl中。
3. 分别取每种菌株洗涤后的培养物10 μl，点样于普通TY琼脂平板上。这些点样位置为对照点。
4. 取除携带pJC2的E. coli DH5α¹²以外的每种菌株各40 μl，加入无菌离心管中，混匀，然后取120 μl该混合液点样于普通TY琼脂平板上。此点样位置为无整合酶阴性对照。
5. 取每种菌株各40 μl，加入无菌离心管中，混匀，然后取160 μl该混合液点样于普通TY琼脂平板上。此点样位置为IMCE接合转移点样。
6. 将点样后的平板置于超净工作台中晾干。
7. 密封平板，于30 °C过夜培养。

3. 转整合子的分离

1. 将对照菌株和IMCE菌株划线接种于添加了200的TY琼脂平板上 μg/ml 链霉素（SmUW227 基于 Rm1021，后者携带一个导致对链霉素高水平抗性的突变）¹⁴）和30 μg/ml 庆大霉素
2. 为计算 IMCE 效率，重悬约 ¼ 500 中 IMCE 交配斑点的 μl 无菌 0.85% NaCl。进行10倍系列稀释至10^-7. 梯度稀释平板 10^-2 通过 10^-5 在添加了200的TY琼脂平板上 μg/ml 链霉素和 30 μg/ml 庆大霉素，用于筛选转整合子。平板稀释 10^-3 通过 10^-7 在添加了200的TY琼脂平板上 μg/ml 链霉素，用于筛选转整合子及潜在受体菌，即总受体菌。
3. 为分离无标记的转整合子，将约四分之一的IMCE接合菌落重悬于500 μl 无菌 0.85% NaCl。进行10倍系列稀释至10^-6. 10倍稀释平板^-4 至10^-6 在四个添加了200的TY琼脂平板上 μg/ml 链霉素和 200 μg/ml X-葡糖醛酸
4. 30℃下孵育培养板 °37°C 培养 3 天。
5. 在绿光（525 nm）下并通过红色滤光片观察RFP反式整合子>610 nm ¹⁵.
6. 计算IMCE效率的百分比，即转座整合子的菌落形成单位（CFU）占总受体菌CFU的比例。约有一半的转座整合子会发生真正的盒式交换，表现为白色且对链霉素敏感。
7. 为筛选无标记的转座整合子（即供体质粒不含Gm）^r 如pJH110中所示）筛选白色菌落（延长培养时间，室温下额外培养1-2天，可增强X-gluc对菌落的显色区分效果，此步骤是必要的） S. meliloti SmUW227），通过在不含抗生素的TY琼脂平板和含有100的TY琼脂平板上进行筛选，确认菌落的壮观霉素敏感性 μg/ml 斯佩丁霉素

4. 代表性结果

在添加链霉素和庆大霉素的TY培养基上培养三天后，对照组划线区域应无任何生长。IMCE划线区域应在第一道划线上呈现融合生长，第二道划线上出现大量菌落，如图2所示。转座整合效率（以转座整合子占总受体菌的比例表示）应在0.5%左右。约一半的转座整合子对壮观霉素敏感且菌落呈白色，表明其已发生真正的盒式交换。含有来自pJH110质粒的测试用rfp供体盒的转座整合子，在绿色光（525 nm）照射下并通过红色滤光片（>610 nm）观察时，应显示出可辨别的RFP荧光¹⁵。

图1. 接合混合物示意图：在pRK600提供的转移基因表达作用下，所有质粒在细胞间随机转移。这种转移导致混合物中产生转整合子，即LP菌株获得了IMCE所需的两种质粒——整合酶（int）辅助质粒pJC2和供体质粒pJH110。通过ΦC31整合酶的作用，非复制型供体质粒（pJH110）上的供体盒与染色体上LP盒的标记基因发生交换，结果导致LP标记基因（Sp^r 和 uidA）丢失，而供体盒（rfp 和 Gm^r）则保留在所形成的转整合子中。

图 2. A：非选择性 TY 平板上的交配点平板，显示琼脂表面干燥的细胞混合物。B：在链霉素-庆大霉素-X-半乳糖平板上划线的交配点，从左上角顺时针依次为：无整合酶对照、IMCE 进入 S. meliloti、含 pJC2 质粒的 E. coli DH5α 对照、含 pJH110 质粒的 E. coli DH5a 对照、E. coli MT616 对照，以及 S. meliloti UW227 对照。C：交配点重悬液 10^-2 稀释后涂布于 TY 链霉素-X-半乳糖琼脂平板。D：交配点重悬液 10^-2 稀释后涂布于 TY 链霉素-庆大霉素-X-半乳糖琼脂平板（蓝色菌落为单个重组子，白色菌落发生了真正的盒式交换）。E：交配点重悬液 10^-2 稀释后涂布于 TY 链霉素-X-半乳糖琼脂平板，显示无荧光。F：交配点重悬液 10^-2 稀释后涂布于 TY 链霉素-庆大霉素-X-半乳糖琼脂平板，显示两种荧光水平（较亮的菌落对应于蓝色菌落，rfp 表达更高，推测是由于载体序列中启动子的通读所致；而发生真正盒式交换的菌落仅保留 RFP 及其紧邻的启动子，不含载体中 lac 启动子的通读，因此无此效应）。

讨论

IMCE 技术可将单个两侧带有 attB 的 DNA 破碎片段高效整合到已构建菌株的 LP 位点。一旦目标构建体被克隆至 rfp 的位置以形成供体片段，该技术便无需后续的 DNA 纯化与转化步骤，因而具有很高的稳健性。必须设置适当的生长对照，以确保抗生素抗性的确源于顺式整合子的形成，而非其他因素。

IMCE 以大约 0.5% 的效率产生跨整合子。相比之下，通过同源重组发生的双交换频率约为 10^-6。通过 λ-red¹⁶ 进行的重组工程是另一种基于噬菌体的系统，需要特定的同源序列，且在 E. coli¹⁷ 以外的生物中效果差异较大。另一种选择 Tn7 位点特异性重组需要 attTn7 位点¹⁸，而这些位点在 γ-变形菌以外的生物中极为罕见。ΦC31 整合酶已在多种不同宿主中表现出高效的活性^4,19。尽管使用 ΦC31 整合酶需要预先对宿主进行改造，但其应用不受特定门类的限制。IMCE 具有效率高和模块化的优势，因为任何供体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
链霉素	BioShop Canada	STP101
壮观霉素	BioShop Canada	SPE201
庆大霉素	BioShop Canada	GTA202
氯霉素	BioShop Canada	CLR201
四环素	BioShop Canada	TET701
卡那霉素	BioShop Canada	KAN201
细菌学级琼脂	BioShop Canada	AGR001
胰蛋白胨	BioShop Canada	TRP402
酵母提取物	BioShop Canada	YEX401
氯化钠	BioShop Canada	SOD001
氯化钙	BioShop Canada	CCL444
X-gluc	Gold Biotechnology	G1281C1
E. coli MT616 菌株	可应要求提供		亦在本实验室以外使用
E. coli pJC2 菌株	本实验室自备
E. coli pJH110 菌株	本实验室自备
SmUW227 菌株	本实验室自备