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多重荧光免疫测定检测方法及故障排除

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DOI：

10.3791/3715

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2011年12月12日

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1Research Animal Diagnostic Services (RADS), Charles River

本文内容

摘要

利用Luminex公司的xMAP微球技术，我们开发了用于多种实验动物血清学监测的多重荧光免疫分析法（MFIA）。MFIA是一种悬浮微阵列技术，其中抗原、组织对照或免疫球蛋白被共价连接至带有颜色编码的聚苯乙烯微球上。本文介绍了MFIA检测方法以及若干常见问题的解决方案。

摘要

为确保生物医学研究中所用动物模型的质量，我们已开发出多种诊断检测策略与方法，用于判断动物是否暴露于外源性传染性病原体（病毒、支原体及其他难养微生物）。免疫功能健全动物的感染通常为一过性，但针对感染的血清抗体反应往往可在数天至数周内被检测到，并可持续存在于宿主的整个生命周期。血清学检测是监测实验动物的主要诊断方法。传统上，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）一直是血清学监测的主要筛查手段。ELISA为单重检测，即每个孔仅检测一种微生物抗原-抗体反应。相比之下，多重荧光微球免疫分析法（MFIA）则是一种多重化的检测方法。由于微球具有100种不同的荧光编码，因此可在单个微孔板孔中同时进行多达100种不同的检测。该技术革新显著减少了常规检测所需的血清量、试剂和耗材用量，同时提高了单个检测孔所获取的信息量。此外，我们还可引入多种内部质控微球，以验证样本和系统的适用性，从而确保检测结果的准确性。这些质控包括组织对照微球以及包被了针对检测血清物种的IgG抗体（αIg）的微球组，用于评估样本的适用性。与ELISA和免疫荧光分析（IFA）类似，组织对照用于检测血清免疫球蛋白的非特异性结合。αIg质控（血清质控）可确认样本中已加入血清，并含有足够浓度的免疫球蛋白；而包被了血清物种免疫球蛋白的IgG质控微球（系统适用性质控）则用于验证标记试剂和Luminex检测仪是否正常工作。

方案

1. 多因子免疫分析（MFIA）流程说明（图1）

  1. MFIA 需要 Charles River 提供的包被抗原的聚苯乙烯微球（微珠）、待测血清、标记试剂（BAG、SPE）以及缓冲液（初稀释液、检测缓冲液）。
  2. 试剂按步骤依次加入 96 孔滤板底微量滴定板的孔中。
  3. MFIA 作为一种非均相检测，每步孵育后均需进行滤洗步骤，以去除未结合的血清成分或标记试剂。加入孔中的洗涤液通过滤板底部的过滤作用经负压抽吸去除，而微珠则保留在孔中。
  4. MFIA 检测在室温（27°C±2°C）下进行。
  5. 在待测血清孵育步骤中形成的抗原-抗体复合物，通过与生物素化山羊抗物种抗体偶联物（BAG）孵育，随后加入 R-藻红蛋白标记的链霉亲和素（SPE）进行检测。
  6. 在检测仪中，微珠逐个通过检测器，并暴露于两束激光下。其中一束激光激发微珠内部的染料，以识别其颜色编码，该编码对应特定检测项目；另一束激光则激发在检测过程中捕获的藻红蛋白报告染料。每项检测读取预定数量的微珠，藻红蛋白荧光强度以中位荧光指数（MFI）表示。

    MFIA 检测流程示意图；微珠偶联、血清孵育、链霉亲和素使用、读板装置。
    图 1. MFIA 检测流程。基于 xMAP 技术的 MFIA 是一种悬浮微阵列，利用带有颜色编码的 5.6 微米聚苯乙烯微珠，抗原（或对照）共价连接于微珠表面。由于微珠具有 100 种不同的颜色编码组合，因此可在同一孔内同时进行多达 100 种不同的检测。检测步骤在滤板底微量滴定板中进行，以便通过真空多通道装置对微珠进行洗涤。反应信号由 Luminex xMAP 100 荧光仪读取。藻红蛋白荧光强度以中位荧光指数（MFI）表示。

2. 开始之前请注意以下事项：

  1. MFIA 微球对光敏感
    1. 必须尽量减少直接光照。常规检测过程中正常的光照暴露是可以接受的，但长时间暴露会导致微球发生光漂白，从而使其无法被检测仪读取。
    2. 为确保检测成功，MFIA 微球在使用前必须始终通过涡旋振荡使其充分悬浮，并进行超声处理（10–30 秒）。
    3. 检测仪仅从单个微球获取信号。微球聚集形成的团块可能导致读取时间延长。
  2. 所有孵育步骤中，务必使用板盖覆盖检测板，以避免检测溶液蒸发。
  3. 必需佩戴个人防护装备：在实验室环境中操作时，应始终穿戴实验服、手套和护目用具。

3. 试剂

  1. 表1包含了建立内部MFIA实验室所需的大部分材料。根据您的具体需求，可能还需要其他或额外的物品。请注意，此清单不包括从Charles River购买的试剂（MFIA微球、对照品及辅助试剂）。生物素化偶联物和链霉亲和素标记的藻红蛋白有多个商业来源可供选择。然而，Charles River提供的试剂已经过滴定，可与我们的试剂配合使用，获得最佳的信噪比；因此不建议更换其他供应商或不同批次的试剂。

表1。CR-RADS 使用伯乐（BioRad）的 BioPlex 悬浮阵列读数仪和伯腾（BioTek）的自动微孔板洗板机。其他供应商也提供等效的仪器设备。

项目供应商目录编号
设备  
悬浮阵列读板仪*BioRad171-000205
96孔微孔板洗板机BioTekELX50/8FMW
超声波清洗器/清洗槽Cole PalmerEW0884900
模拟涡旋混合器VWR58816-121
-20°C 冰箱Various 
4°C 冰箱Various 
12通道移液器，20-200μlVWR83009-718
轨道式平板摇床VWR/Lab-Line57019-600
单通道移液器，20-200μl，带吸头VWR83009-732
单通道移液器，2-20μl，带吸头VWR83009-726
单通道移液器，100-1000μl，带吸头VWR83009-736
Vacushield 通风装置VWR55095-006
真空压力泵VWR54908-037
真空系统废液储液瓶VWR80200-640
一次性耗材  
96孔聚苯乙烯板Fisher Scientific14-245-145
MultiScreen HTS-BV 板，1.2μm 滤膜，苯乙烯材质MilliporeMSBV N12 50
15ml 锥形管（聚丙烯）Sarstedt62554.002
50ml 锥形管（聚丙烯）Sarstedt62547.004
血清瓶Sarstedt72694.007
铝箔VWR89079-068
1L 无菌瓶VWR28199-246
0.22μm 瓶顶过滤器VWR28199-307
试剂储液槽（100ml）VWR82026-356
用于分配液体试剂的 5ml、10ml、25ml 移液管VWR 
试剂  
PBS，pH 7.4 1 BSA，粉末（小袋装）SigmaP3813
ProClin 300Sigma/Supelco48912-U
未包被微球Luminex根据类型不同而变化

4. 试剂配制

  1. MFIA 检测过程需要两种缓冲液。初级稀释液可从 Charles River 公司获得，其中含有专有的阻断剂，用于减少非特异性蛋白相互作用。检测洗涤缓冲液需在实验室内使用市售试剂自行配制。
  2. 检测洗涤缓冲液：PBS/1% BSA pH 7.4 可从 Sigma-Aldrich 公司购买粉末形式。
    1. 通过过滤去除颗粒物至关重要，因为这些颗粒物可能导致检测读板仪发生堵塞。应使用 0.2 微米瓶顶滤器将缓冲液过滤至无菌、带标签的容器中。
    2. BAG 和 SPE 需用检测洗涤缓冲液稀释至其 2X 工作浓度。注意：SPE 对光敏感，应避免长时间暴露于光照下。

5. 样品制备

  1. 准备您的检测材料、试剂和一次性耗材。
    1. 多通道和单通道移液器及吸头
    2. 96孔低蛋白结合微孔板（用于血清稀释）和带滤膜底板的微孔板（用于MFIA检测）
    3. 按照您的标准操作程序采集血液样本。将血液样本在室温下放置至少30分钟，使其充分凝固，然后进行离心并分离血清。在取样前，应短暂涡旋混匀未稀释的血清，以确保血清成分均匀。
    4. MFIA检测的最终检测稀释度为1/50。因此，需要先配制2倍浓度（1/25）的待测血清样本。将未稀释的待测血清按1体积血清加入24体积MFIA初稀释液的比例进行稀释。建议将待测血清在96孔微孔板中进行排列，这将显著减少样本转移至检测板所需的时间，且强烈推荐使用此方法。

6. 测试板制备

  1. 需要预先润湿 96 孔检测板，以确保各孔能够均匀、彻底地排空。即使不使用整块板，此步骤也必须在开始时执行，但无需向空孔中添加后续试剂或洗涤缓冲液。
    1. 一些实验室通过密封检测板上未使用的孔来运行少于整板的实验，并计划在以后重复使用这些孔。我们不建议采用这种方法，因为它可能影响检测板的正常过滤功能。
  2. 正确的检测板抽吸操作对 MFIA 检测的成功至关重要。样品孔的排空时间应控制在约 5–10 秒。若抽吸过快，可能导致微球聚集，并在检测结束时造成读数时间延长。
  3. 每次洗涤步骤后，均需用纸巾轻拍检测板底部，以确保液体已完全停止流出。若未进行此操作，可能导致孵育过程中液体试剂通过毛细作用从孔中渗出，进而导致 Goat anti-species 和/或 Species IgG 微球的信号评分不合格。这些微球在每孔加入适量的初代血清和标记试剂后，设计为在预设的 MFI 范围内产生信号。

7. MFIA 微球悬浮液的制备

  1. 实验成功的关键在于使用前必须始终对磁珠进行涡旋振荡和超声处理。检测仪器仅采集单个磁珠的信息，磁珠聚集或结块会导致读数时间延长。
  2. 涡旋振荡储备液中的偶联磁珠悬液（通常为 10 ± 5 秒）
  3. 重新悬浮磁珠，随后在超声水浴中处理 10–20 秒。
  4. 用初稀释液将 20X 储备悬液稀释为 2X 工作磁珠悬液。向已预润湿的检测板各检测孔中加入 50μl 2X 磁珠悬液。

8. 向检测板中加入待测血清和对照血清

  1. 根据预先设计的板图，用移液器将每种2X测试血清和对照血清各50μl加入检测板中。用橡皮筋或铝箔密封板盖，并将检测板置于室温避光条件下，在摇床上孵育60分钟。
    1. 摇床转速应大于400 rpm但小于700 rpm。必须始终保持微珠处于悬浮状态，以使血清抗体能够接触到偶联抗原的所有表面。若未能保持微珠悬浮，将导致IgG微珠对照信号偏低，实验需重复进行。

9. 洗涤检测板

  1. 使用真空 manifold 吸出孔中的内容物。抽吸样本孔中的液体应持续约 5-10 秒。
  2. 每次操作后，用纸巾擦拭检测板底部，以确保液体排净。
  3. 将磁珠重悬于 50μl 的检测洗涤缓冲液中。在检测过程中，必须确保磁珠不干燥。

10. 向检测板中加入BAG和SPE

  1. 向所有含有 MFIA 珠的孔中加入 50μl 的 2X 工作浓度 BAG。用橡皮筋或铝箔将板盖固定。将检测板在室温下避光振荡孵育 30 分钟，振荡条件同上。
    1. 孵育结束后，按照添加血清后的前述方法，用检测洗涤缓冲液洗涤检测板并重悬珠子。
  2. 向所有含有 MFIA 珠的孔中加入 50μl 的 2X 工作浓度 SPE。用橡皮筋或铝箔将板盖固定。将检测板在室温下避光振荡孵育 30 分钟，振荡条件同上。
    1. 孵育结束后，用 125μl 检测洗涤缓冲液洗涤检测板并重悬珠子，并振荡约两分钟以充分重悬珠子，然后将板放入检测仪中。

11. 读取检测板结果

  1. 在重悬微球后10分钟内将检测板放入检测仪中。如果发生断电或其他意外情况，检测板可在室温避光条件下保存最多12小时，待恢复后再进行读数。
    1. 观察第一个样本孔，确认所选微球 panel 与检测孔中的微球图谱匹配。如果在程序显示中发现微球落在其指定的“微球区域”之外，则表明选择了错误的图谱。
    2. 如果微球已充分重悬，它们应能完全填充检测仪软件中指定的“区域”。
    3. 如果微球发生聚集，其填充区域的速度会较慢。此时可将检测板从检测仪中取出，并手动重悬各孔中的微球。使用多通道移液器对每个孔吹打3–4次，以帮助分散微球聚集体。随后将检测板重新放入检测仪中继续读数。

12. 代表性结果

  1. 每项检测读取的微球数量最少，藻红蛋白荧光强度以中位荧光指数（MFI）表示，范围为 0 至 32,667。在比较每孔 25、50 或 100 个微球的计数后，我们未发现统计学差异，因此常规每样本孔每检测因子计数 25 个微球。检查结果报告中的错误，例如微球计数不足或 IgG / 抗 IgG 微球评分不合格。当向各孔中加入适量的初免血清和标记试剂时，这些微球设计为在预设的 MFI 范围内“评分”。出现错误（微球计数偏低）或 IgG 对照微球评分不合格的样本孔应重复检测，以获得有效结果。
  2. 将结果导出至 Excel 工作表。在我们的数据分析中，每项检测被指定为：
    1. 组织对照（TC）检测：对于大多数啮齿类动物 MFIA 检测，组织对照为野生型杆状病毒感染的昆虫细胞提取物。
    2. 检测临界值（Assay Cutoff）：该值为预期的最低荧光信号，针对每项检测进行调整以最大化诊断准确性。对于大多数检测，荧光临界值为 3000。
  3. 每项检测（除组织对照和 IgG 对照检测外）的净中位荧光指数（Net MFI）通过以下公式计算。换句话说，特异性检测信号为总检测 MFI 减去 TC（背景）MFI，然后将该值除以 1000，使 Net MFI 的范围从 0–32,667 简化为 0–32。


    净 MFI = (MFIAntibody Assay - MFITissue Control) / 1000

    Net MFI 和 TC MFI 通过与各抗原特异的检测临界值比较，转换为评分。
    小鼠血清分析结果表格；抗原检测、定量数据、小鼠检测和血清对照。

    图 2. 所有 IgG 对照均合格的测试血清代表性 MFIA 数据。
  4. 12.4 MFIA 结果解读
    1. 仅当系统适用性对照和血清对照（IgG / 抗 IgG 微球）结果符合表 2 所列的可接受标准时，方可对检测板结果进行解读。这两种 IgG 对照微球失败可能提示多种操作错误，例如稀释不当、偶联物或 SPE 体积不足、测试血清稀释错误，或使用了免疫缺陷动物的血清。

表2

检测对照品的可接受标准
对照品可接受结果
评分分类
高浓度免疫血清≥ 4.5阳性
低浓度免疫血清≥ 1.5≥ 临界值
非免疫血清< 2.5≤ 临界值
稀释液< 2.5≤ 临界值
Ig Bead Set*≥ Cutoff/1000通过

*包被有物种特异性抗测试血清免疫球蛋白（Ig）的微球试剂：该样本适用性对照出现失败结果，可能源于样本添加量不足、样本稀释度过高、使用了错误的物种，或采用了免疫缺陷宿主的测试血清。

  1. 如果除高浓度免疫血清外，任何测试板检测对照未通过，则结果不可接受，必须重复实验。低浓度血清对照通过至关重要，因其可证明测试板的检测灵敏度水平。
  2. 山羊抗物种IgG微球评分基于加入检测体系的初代测试血清量。如果该对照微球未通过但物种IgG通过（图3中B1孔），则表明检测孔中已加入足量测试试剂（BAG、SPE），问题与血清相关。若某一孔中测试试剂不足，则IgG和抗IgG对照微球均会失败（图3中E1孔）。

    血清分析结果、抗原-抗体相互作用表、小鼠测试血清及血清对照。
    图3。 典型的MFIA检测结果（失败项以橙色标示）。A1、C1和F1孔显示TC（组织反应性）失败，TC评分以括号表示。B1和E1孔展示了两种类型的IgG内部对照失败：测试抗体不足（B1）或测试试剂不足（E1），分别对应BAG/SPE。
  3. 若测试板检测对照结果满意，则按表3所示对各单项检测评分进行分类。任何临界值或阳性结果均须通过替代检测方法予以确认。

表3

MFIA 评分分类
评分分类
TCNetTC + Net*
≥ 2< 0.5< 2.5阴性 (-)
≥ 0.5≥ 2.5TC 反应 (T)
< 2< 1.5 -
1.5 ≤ X < 2.5 临界值 (B)
≥ 2.5 阳性 (+)

即使TC评分不为零，只要TC评分与净评分之和（即Ag评分）为负值，仍可判定为阴性

讨论

MFIA 检测过程效率高，所需设备更少，样本和试剂用量也比传统的单重检测更小。多重检测系统的功能使用户能够灵活地同时筛查实验啮齿动物中常见病原体的多种毒株或血清型（例如冠状病毒、细小病毒等）。此外，我们还可根据特定研究领域（例如特定病毒家族）设计定制化的微球 panel，并可适用于其他类型生物分子（包括细胞因子及其他生物标志物）的检测。同时，该系统允许我们加入多种内部对照检测，以验证样本和系统的适用性，从而确保结果的准确性。这些对照包括组织对照和包被了针对检测血清物种免疫球蛋白的 IgG 抗体（αIg）的微球组，用于评估样本的适用性。组织对照微球用于检测血清免疫球蛋白的非特异性结合，而 αIg 微球对照则确认血清已加入且含有足够浓度的免疫球蛋白。另一种对照微球包被了血清物种的免疫球蛋白，用于验证标记试剂和检测仪器功能正常。其他市售的多重血清学检测方法（例如 MicroArrays、ImmunoComb）可能无法提供同等水平的结果验证能力。

在重新检测之前，能够缩小可能的检测失败来源，有助于研究人员节省时间和材料。在重复检测失败的样本之前，应确认多重荧光免疫分析（MFIA）中的关键步骤。由于该检测在室温下进行，需确保实验室温度约为27°C±2°C；温度过高可能导致对照和样本的结果低于预期值。洗涤可能是检测中最关键的步骤。确保检测板充分洗涤、拍干并重新悬浮，可消除大多数因微球计数偏低（由微球聚集引起）或试剂添加不足（因试剂通过检测板滤底被吸走）而导致的取样误差。我们通常每项检测（试剂）计数25个微球，发现增加微球计数并不会在统计学上显著改变结果，反而会延长整块板的读取时间。

我们已在多种常用实验动物（小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和兔）中对多重荧光免疫分析法（MFIA）开展了全面的验证研究，通过检测大量已知阳性和阴性血清样本，并比较其ELISA、IFA和MFIA结果，以评估该方法的诊断准确性、重复性和稳健性。MFIA的检测限（即标准免疫血清滴定终点）与相应ELISA相当，在某些情况下甚至优于ELISA。使用SPF啮齿类动物血清测得的诊断特异性超过99%；对已知阳性和已知阴性血清样本进行ELISA与MFIA检测的总体符合率高于95%。综上所述，这些结果证明，多重MFIA是单重ELISA的良好替代方法，适用于其预期用途，即实验动物群体的常规血清学监测。

披露

所有作者均就职于 Charles River RADS，这是一家主要提供动物血清学检测服务和试剂的公司。

致谢

本研究由查尔斯河公司资助。

参考文献

  1. MFIA Rodent Methods Manual [Internet]. , Charles River. Available from: http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf (2011).
  2. Rodent MFIA Validation Summary Report [Internet]. , Charles River. Available from: http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf (2007).
  3. Jacobson, R. H., et al. Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. , Office International des Epizooties (OIE). France. 8-15 (1996).
  4. Wright, P. F. International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 17 (2), Office International des Epizooties (OIE). France. 527-533 (1998).
  5. Pepe, M. S. The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. , Oxford University Press. Oxford, New York. (2003).
  6. Barr, M. C., et al. Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection. J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).

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