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寄生虫诱导的基因驱动型自身免疫性恰加斯心脏病鸡模型

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DOI：

10.3791/3716

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2012年7月29日

 ,  ,  , 
1Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory, University of Brasilia

本文内容

摘要

克氏锥虫在受精卵孵化前接种至卵内，可导致该寄生虫的动基体DNA（kDNA）小环整合到胚胎细胞的基因组中。通过杂交繁殖可观察到突变的垂直传递至后代。kDNA整合至多条染色体的编码区域，导致鸡只因炎症性自身免疫性心脏病而死亡。

摘要

婴儿期和儿童期获得的克氏锥虫急性感染通常无症状，但约有三分之一的慢性感染者在感染后数十年内会发展为恰加斯病。自身免疫和寄生虫持续存在是解释恰加斯病发病机制的两种相互竞争的理论1, 2。为了区分寄生虫持续存在与自身免疫在恰加斯病中的作用，我们将T. cruzi接种于受精鸡蛋的气室中。成熟的鸡免疫系统对T. cruzi具有严密的生物学屏障作用，随着免疫系统在孵化后第一周内发育完成，感染即被清除3。雏鸡出壳时体内无寄生虫，但其基因组中整合了来自寄生虫线粒体动基体DNA（kDNA）的小环分子，并可遗传给后代。通过特异性引物TAIL-PCR、Southern杂交、克隆及测序等方法，已证实kDNA小环整合于鸡基因组中3, 4。kDNA小环的整合会破坏多个开放阅读框，影响转录和免疫系统相关因子、磷酸酶（GTP酶）、腺苷酸环化酶以及与细胞生理、生长和分化相关的磷酸化酶（PKC、NF-κB激活剂、PI-3K）等功能基因3, 5-7，以及其他基因功能。在kDNA整合突变的鸡中，可观察到效应性细胞毒性淋巴细胞攻击靶向心肌纤维导致的严重心肌炎，表现为一种类似于人类恰加斯病的炎症性心肌病。值得注意的是，在成年鸡中若kDNA插入导致1号染色体上的抗肌萎缩蛋白基因（dystrophin gene）断裂，则会出现心力衰竭和骨骼肌无力8。类似的基因型改变与CD45+、CD8γδ+、CD8α淋巴细胞介导的组织破坏相关。因此，这种原虫感染可诱发由基因驱动的自身免疫性疾病。

方案

1. 寄生虫的培养

  1. 在37 °C、5% CO2条件下，将T. cruzi Berenice株及表达β-半乳糖苷酶的Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4株的上鞭毛体形式培养于含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和250 nM L-谷氨酰胺（pH 7.2）的杜尔贝科改良必需培养基中的鼠骨骼肌细胞（L6细胞）中。收集上清液中游离游动的上鞭毛体用于接种鸡胚。
  2. 将Leishmania braziliensis (Lb) LTB300菌株在含20%胎牛血清的DMEM培养基中培养。取处于对数生长期的Lb前鞭毛体形式用于接种鸡胚9。

2. 受精鸡卵中的寄生虫接种

  1. 在X期可孵化鸡胚的气室上方蛋壳上，通过直径为2 mm的孔，接种含有100个T. cruzi上鞭毛体的10 μl培养基悬浮液。致病性寄生虫侵入胚胎细胞并在其中复制的过程见视频S1。对照组如下：a）对照鸡；b）模拟对照组鸡胚，接种10 μl培养基；c）X期可孵化鸡胚，接种含有100个Lb前鞭毛体的10 μl培养基悬浮液。T. cruzi和Lb均属于动基体科。这些原虫分别在宿主细胞的胞质中自由生长，或在寄生泡内生长10。
  2. 用胶带密封孔洞。
  3. 将T. cruzi感染的鸡胚以及模拟接种和未感染的对照样本置于37.5 °C、65%湿度条件下孵育21天。
  4. 孵化出的雏鸡在孵育器中保留24小时，之后在32 °C环境下饲养三周。

3. 获取用于DNA提取的样本

  1. 从以下鸡只中获取外周血单个核细胞：a) 来自接种了T. cruzi的鸡蛋孵化的鸡；b) 对照组；c) 接受10 μl培养基的模拟处理组；d) 来自接种Lb的鸡蛋孵化的鸡。按照标准方案11对鸡的白细胞进行处理以提取DNA。
  2. 同时从接种T. cruzi的鸡蛋孵化的母鸡以及对照组鸡蛋孵化的母鸡所采集的精液和未受精卵母细胞（< 5 mm）中提取DNA3, 4。
  3. 按照其他文献所述方法9，从T. cruzi的上鞭毛体形式以及Lb的前鞭毛体中提取动基体DNA（kDNA）。

4. 使用的引物和探针

用于PCR扩增的引物及热循环条件见表1。

Southern印迹杂交中使用的探针为：

  1. 从 T. cruzi 无鞭毛体形态中纯化的野生型微环（约 1.4 kb）序列；
  2. 通过 NsiI 酶切野生型动基体DNA（kDNA）获得的微环片段（362 bp）；
  3. 利用Tcz1/2引物扩增寄生虫DNA获得的核DNA（nDNA）重复序列（188 bp）。探针从1%琼脂糖凝胶中纯化得到3。
  4. 来自 Lb 前鞭毛体的野生型微环（约 0.820 kb）序列。

5. PCR 分析

  1. 使用感染雏鸡、未感染对照组及模拟感染样本的基因组DNA，针对T. cruzi的核DNA引物Tcz1/212和动基体DNA引物kDNA s35/s3613进行标准PCR扩增。同时，使用从Lb感染卵孵化的鸡所提取的基因组DNA，采用原虫特异性引物Lb3和Lb5（表1）进行PCR扩增。
  2. 配制反应体系：每25 μL终体积中包含100 ng模板DNA、每对引物各0.4 μM、2 U Taq DNA聚合酶、0.2 mM dNTP以及1.5 mM MgCl2。
  3. 设置PCR程序：95 °C预变性5 min，随后进行30个循环（95 °C变性30 sec、68 °C退火30 sec、72 °C延伸1 min），最后72 °C延伸5 min，反应结束后冷藏保存。
  4. 将扩增产物在1.3%琼脂糖凝胶中电泳分离，随后通过碱性转移法将DNA转移至带正电荷的尼龙膜（GE Life Sciences），使用[α-32P] dATP标记的特异性探针进行杂交检测，探针标记采用随机引物标记试剂盒（Invitrogen, Carlsbad, CA）。

6. 基因组Southern印迹

  1. 使用在整合到组织DNA样本中的微环上产生单一切点的 MboI 和/或 EcoRI（Invitrogen）酶。
  2. 消化未感染的对照组鸡以及接种了具有致病性的 T. cruzi 形式的卵孵化出的鸡的DNA。
  3. 将来自 T. cruzi 和鸡测试样本的DNA消化产物在4 °C条件下以50 V电压进行过夜电泳，所用凝胶为0.8%琼脂糖凝胶。
  4. 将分离的DNA条带转移至带正电荷的尼龙膜上。
  5. 用放射性标记的kDNA探针与DNA条带进行杂交。
  6. 用2X SSC和0.1% SDS在65 °C下洗涤膜两次，每次15分钟；再用0.2X SSC和0.1% SDS在65 °C下各洗涤两次，每次15分钟，随后进行不同时间的放射自显影。

7. 靶向引物TAIL-PCR

  1. 通过改良的 TAIL-PCR 技术扩增整合到鸡基因组中的 kDNA 小环，该技术结合了 kDNA 引物与特异性引物组2，进行三轮巢式 PCR 的逐步扩增，如图1所示。
  2. 初级循环：每个反应包含 200 ng 模板 DNA、2.5 mM MgCl2、0.4 μM 的 kDNA 引物（S34 或 S67）、0.2 mM dNTPs 和 2.5 U Taq Platinum（Invitrogen, Carlsbad, CA）。将 kDNA 引物分别与 0.04 μM 的 Gg 引物（Gg1 至 Gg6，表1）组合使用。kDNA 引物的退火温度设置为 57.9 至 60.1 °C，CR-1 引物的退火温度设置为 59.9 至 65.6 °C。注意这些温度高于 TAIL-PCR 中使用的随机简并引物所需的温度（约 45 °C）10。采用先前文献中描述的温度程序和循环参数（MyCycle Thermocycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）3。
  3. 次级循环：将初级循环的 PCR 产物用蒸馏水按 1:40（v/v）稀释。使用 kDNA 引物 S35 及其反义链替代前一轮引物，并与相同的 Gg 引物组合使用。
  4. 三级循环：将次级循环的 PCR 产物用蒸馏水按 1:10（v/v）稀释，并分别将 Gg 引物与 S67 反义链或 S36 组合使用。
  5. 克隆三级 PCR 循环产物：将最后一轮扩增中能与 kDNA 探针杂交的产物直接克隆至 pGEM T easy 载体（Promega, Madison, WI）中。
  6. 通过与 kDNA 探针杂交筛选阳性克隆，并进行测序。
  7. 在验证 tpTAIL-PCR 时，使用 300 pg 来自 T. cruzi 的 kDNA 与 200 ng 从未接触过 kDNA 的对照鸟类 DNA 混合。所用的温度条件和扩增循环参数与检测鸟类 DNA 时相同。

8. 克氏病临床表现

  1. 每日监测从感染 T. cruzi 的鸡蛋孵化出的鸡以及从非感染鸡蛋孵化的健康对照组鸡的生长发育情况，记录死亡率，并每周检查疾病表现。
  2. 检测这些鸡的临床异常（图2），并进行心电图（ECG）记录，以评估电轴、心率和心律失常3。
  3. 每月对kDNA突变鸡和对照组鸡进行增强导联单极心电图记录，包括aVF（左腿）、aVL（左臂）和aVR（右臂）导联，以评估平均电轴左偏，该表现提示心脏扩大3。

9. 病理学与免疫化学分析

  1. 记录kDNA突变鸡自然死亡后的心脏和体重指数（图3），并获取同龄同性别对照组鸡的相应指数。
  2. 取心脏、食管、肠道、骨骼肌、肺、肝脏和肾脏组织切片。
  3. 用pH 7.4的10%中性缓冲福尔马林固定组织，经石蜡包埋后切片，厚度为4 μm，用于苏木精-伊红（HE）染色及组织学分析（图3）。
  4. 收集接种表达β-半乳糖苷酶寄生虫的鸡蛋孵化出的胚胎组织，将其剖分为两半，并进行X-Gal染色9。
  5. 将另一半胚胎组织用pH 7.4的10%福尔马林固定，并按步骤9.3进行后续处理。
  6. 切取4 μm厚的石蜡包埋组织切片，贴附于载玻片上以供显微镜检查。
  7. 将显示X-Gal染色蓝色细胞的切片与人查加斯病抗血清（1:1024稀释）共同孵育，该血清靶向抗T. cruzi抗原。
  8. 用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤切片三次，每次5分钟。
  9. 通过第二次孵育，使用荧光素标记的兔抗人IgG对胚胎组织中的蓝色细胞进行染色。
  10. 用PBS缓冲液（同步骤8）洗涤切片，加盖玻片封片，在波长502 nm、200倍放大倍数的紫外光下观察，蓝色细胞发出绿色荧光，用于共定位胚胎细胞中的T. cruzi。

10. 心脏病变中免疫系统细胞的表型分析

  1. 对来自kDNA阳性及kDNA阴性对照鸡的心脏组织切片中的免疫效应细胞进行表型分析。
  2. 将带有石蜡包埋组织切片的载玻片置于65 °C下30分钟，以熔化石蜡，随后依次在100%至70%二甲苯和无水乙醇中各洗涤4次，每次5分钟，最后在PBS中洗涤5分钟。
  3. 用蒸馏水冲洗载玻片，自然晾干，并使用购自美国阿拉巴马州伯明翰SouthernBiotech公司的特异性单克隆抗体（荧光素或R-藻红蛋白标记的单克隆抗体）进行处理。
    1. 使用小鼠抗鸡Bu-1单克隆抗体AV20（Bu-1a和Bu-1b等位基因，分子量70–75 kDa），识别近交系鸡B细胞抗原上的单态决定簇。
    2. 使用小鼠抗鸡CD45单克隆抗体（Ig同种型IgM1 κ），特异性识别鸡胸腺谱系细胞（分子量190–215 kDa变异型）。
    3. 使用小鼠抗鸡TCRγδ+单克隆抗体（分子量90 kDa异源二聚体），特异性识别胸腺依赖性CD8α+ T细胞。
    4. 使用小鼠抗鸡CD8单克隆抗体，特异性识别鸡α链（分子量34 kDa），用于鉴定胸腺细胞、脾脏、心脏及其他组织中的CD8阳性细胞。
    5. 使用小鼠抗鸡KuL01单克隆抗体，特异性识别吞噬细胞系统中的单核细胞/巨噬细胞。
  4. 加入特异性抗表型抗体后，在湿盒中孵育90分钟，随后用0.1 M PBS（pH 7.4）洗涤载玻片3次，每次5分钟。
  5. 使用缓冲甘油封片，置于荧光显微镜下观察，分别采用发射波长567 nm和502 nm的滤光片，检测红色和绿色荧光标记的细胞（图4）。

11. 数据分析

  1. 使用鸡基因组数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031) 进行 BLASTn 序列分析。
  2. 使用 CLUSTALW 比对以确定 e 值得分。
  3. 采用 GIRI 重复序列屏蔽算法 CENSOR (http://girinst.org/censor/index.php) 定位嵌合序列中不同类别的重复序列。
  4. 使用动质体插入和缺失序列搜索工具（KISS），结合 WU-Blastn 修饰矩阵 3，识别 kDNA 序列中潜在的 gRNA。
  5. 使用 T. cruzi 序列 http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas 在 kDNA-宿主 DNA 嵌合体中搜索 gRNA。 11.6) 分别使用 Student t 检验和 Kolmogorov-Smirnov 检验，检测实验组与对照组之间心电轴偏移程度以及心脏/体重指数差异的显著性，并检测接种 T. cruzi 鸡蛋孵化出的鸡群与对照组鸡群之间死亡率差异的显著性。

12. 代表性结果

将100个具有致病性的T. cruzi前鞭毛体接种到受精鸡胚的气室中，不会显著降低孵化出健康雏鸡的比例。大约60%的鸡胚可成功孵化出健康的雏鸡，其余40%可能出现胚胎液化或在孵化时死亡。存活下来的雏鸡在其基因组中保留有整合的kDNA小环序列。然而，预计部分雏鸡在孵化后的数周内会因心脏肥大和器官衰竭而死亡。其余雏鸡将发育为外表健康的成年鸡。在其生命各个阶段，从其外周血单个核细胞中提取的DNA均可通过PCR扩增出kDNA，但无法扩增出nDNA。通过靶向引物TAIL-PCR 3, 4获得的扩增产物经克隆和测序后显示，kDNA小环主要整合于宏染色体1至5的编码区。那些kDNA整合发生在调控细胞生长与分化、免疫系统调节因子以及DNA修复相关基因中的鸡只，可能产生对自身靶组织的排斥反应（图3）。例如，若鸡只的kDNA插入导致编码连接细胞骨架与细胞膜蛋白的抗肌萎缩蛋白（dystrophin）基因发生断裂（图5），则该鸡只可能发展为自身免疫性炎症性心肌病并导致心功能衰竭。

这些基因组修饰在来自感染 Lb 的卵孵化出的雏鸡中未被观察到。T. cruzi 与 Lb 的动粒DNA（kDNA）小环之间存在差异；T. cruzi 的kDNA小环平均长度为1.4 kb，其结构包含四个可变区（VR），由保守区（CR）间隔，每个保守区均含有CSB1、CSB2和CSB3区域，其中富含CA的弯曲DNA被认为是复制、转录、重组以及侧向DNA转移的特异性起始位点3, 4。相比之下，Lb 的kDNA小环（平均大小为820 bp）包含一个保守区后接一个可变区。该保守区含有保守的CSB1（GGGCGT）和CSB2（CCCCGTTC）序列模块，与T. cruzi小环中的相应序列不同15, 16, 17。考虑到Lb的CSB3（GGGGTTGGTGTA）与T. cruzi的序列具有12个核苷酸的同源性，可以推测Lb的kDNA小环可能整合频率极低，以至于所使用的技术无法检测到，或者可能根本不会整合到鸡的基因组中。

引物靶DNA序列Tm*
S 34T. cruzi kDNA5' ACA CCA ACC CCA ATC GAA CC 3'57.9
S 67T. cruzi kDNA5' GGT TTT GGG AGG GG(G/C) (G/C)(T/G)T C 3'60.1
S 35T. cruzi kDNA5' ATA ATG TAC GGG (T/G)GA GAT GC 3'59.4
S 36T. cruzi kDNA5' GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3'57,9
Lb3Lb kDNA5' GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3'55.9
Lb5Lb kDNA5' CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3'61.4
Gg1Gallus gallus5' AGC TGA TCC TAA AGG CAG AGC 3'60.1
Gg2G. gallus5' CTG AGC CTC TGC TTT GAA A 3' 56.8
Gg3G. gallus5' TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3' 60.1
Gg4G. gallus3' GCT CTG CCT TTA GGA TCA GCT 5' 64.2
Gg5G. gallus3' AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5' 62.3
Gg6G. gallus3' CTG TTA GCA TGA GGC TTC ACA A 5' 60.4

表1. PCR扩增中使用的引物。* Tm = 平均退火温度，单位为°C。

染色体定位、DNA循环方法示意图以及DNA分析的凝胶电泳结果。
图1. 用于检测 Trypanosoma cruzi kDNA 整合至 Gallus gallus 基因组的 tpTAIL-PCR 策略。A) 利用一段嵌合序列，其中包含kDNA小环的保守区（深蓝色）和可变区（浅蓝色）片段，整合于鸡基因组（绿色）4号染色体的位点 NW_001471687.1（AY237306）10，由此设计获得宿主特异性引物组（Gg1 至 Gg6）。B) tpTAIL-PCR 扩增起始于（初级循环）小环特异性引物 S34 或 S67 与鸡特异性引物 Gg1 至 Gg6 的组合退火。稀释后的初级产物作为模板用于次级循环，使用 S35（正/反向）引物与不同 Gg 引物组合进行扩增。在三级循环中，将次级扩增产物进一步稀释后，使用kDNA反向引物 S36 或 S67 与 Gg 引物组合进行扩增。C) 这些扩增产物在1%琼脂糖凝胶中分离并转移至尼龙膜，与特异性kDNA探针杂交。对显示阳性信号的样本进行克隆，以确定整合位点。凝胶上方标明了kDNA与目标 Gg1 至 Gg6 引物的组合。连续PCR反应扩增出目标kDNA-宿主DNA序列，包含kDNA小环（蓝色）和禽类序列（绿色）。（转载自 PLoS 被忽视的热带疾病 3）。请点击此处查看此图的放大版本。

公鸡遗传学、羽毛颜色变异，显示红色与白色公鸡头部对比的示意图。
图 2. 携带T. cruzi线粒体kDNA微小环基因整合的9月龄基因编辑鸡心脏功能受损的临床表现。线粒体kDNA突变导致血液氧合不良的鸡冠呈紫色，而无心脏损伤的对照组9月龄鸡冠呈鲜红色。（改编自PLoS 被忽视的热带病3）

心脏组织比较、组织学分析、心脏大小、显微镜图像、纤维化存在情况
图3. 携带kDNA突变的Gallus gallus的心脏大体及显微病理学表现。A) 一只因心力衰竭死亡的9月龄母鸡出现的心脏肥大。B) 非感染性9月龄母鸡的对照心脏。C) 细胞毒性淋巴细胞对靶向心肌细胞的排斥反应：图中显示免疫淋巴细胞介导的靶细胞溶解形成的最小排斥单位（圆圈所示）。D) 对照心脏的组织学图像（修改自PLoS Neglected Tropical Diseases 3）。

CD45、CD8γδ、CD8α 处理细胞的荧光显微镜图像；细胞标志物分析。
图 4. 显示 图 3 中线粒体 kDNA 突变鸡心脏内浸润的免疫系统细胞的免疫细胞化学分析结果。A) 通过藻红蛋白标记的特异性单克隆抗体鉴定出的心肌病变区域中的 CD45+ 淋巴细胞（箭头所示）。B) 参与心脏严重破坏的 CD8+γδ 免疫淋巴细胞（箭头所示）。C) 在伴有心肌细胞溶解的严重病变中大量存在的 CD8α+ T 细胞。插图为未感染对照组鸡心脏中缺乏免疫系统细胞的图像（改编自 PLoS Neglected Tropical Diseases 3）。

心脏解剖与组织学，显微图像显示组织结构和细胞细节。
图 5. 携带kDNA整合至抗肌萎缩蛋白基因的F2代子代鸡中出现类似恰加斯病的扩张性炎症性心肌病。A) 一只10月龄鸡的心脏扩张，占据大部分胸腔（心脏重量 = 16 g）。B) 深染的圆形单核细胞浸润并破坏kDNA突变母鸡的心肌组织。C) 对照组10月龄鸡的正常心脏大小（重量7 g）。D) 对照组鸡心脏的正常组织学结构。（改编自 PLoS Neglected Tropical Diseases 3）。

组织学分析，显微镜图像，细胞组织结构，10μm比例尺，生物学研究。
图6. kDNA突变鸡与人类恰加斯病的比较病理学。A) kDNA突变鸡中严重的心肌炎和靶向心肌细胞溶解。B) 一例恰加斯心脏病患者中免疫淋巴细胞介导的严重心肌炎和靶细胞溶解。C) kDNA突变鸡中免疫淋巴细胞对心肌细胞的排斥反应。D) 人类恰加斯病中免疫淋巴细胞对心肌细胞的排斥反应。苏木精-伊红染色。（改编自Memórias do Instituto Oswaldo Cruz，里约热内卢14）。

讨论

与易受终生T. cruzi感染的哺乳动物不同，鸡对T. cruzi感染具有抗性。鸡模型系统的主要优势在于可在胚胎免疫系统发育早期即清除感染。因此，鸡体内唯一残留的寄生虫DNA是在多个位点上整合的DNA。

使用适量的毒力型T. cruzi上鞭毛体接种受精卵，是实现kDNA小环整合入鸡胚胎基因组的关键步骤。接种100个上鞭毛体的鸡蛋孵化出活雏鸡的比率，是接种500个寄生虫时的四倍。应注意将含有寄生虫的悬液以10 μL培养基注入鸡蛋的气室中，操作过程中不得有蛋清泄漏。在最佳条件下，细胞内寄生感染在孵育数小时内即发生，寄生虫在宿主细胞内持续增殖约一周；此后感染被先天免疫系统清除。kDNA的整合依赖于活体感染，将裸露的小环DNA直接接种至早期鸡胚蛋中无法实现整合。kDNA阳性胚胎组与对照组均应在37.5 °C、65%湿度的受控环境中培养。雏鸡在33 °C室温下笼养两周。此后，将鸡只饲养于配备过滤空气、正压环境并持续通风的房间内笼中，笼架悬空设置，通道宽度为1.5米，室温保持在22 °C，以保障动物福利条件。成年鸡饲喂标准鸡饲料，并自由饮用流动的饮用水，以实现完全生长和性成熟，并在五个月龄时开始产蛋。在将T. cruzi接种至受精鸡蛋的研究中，维持严格的卫生操作规程对于实验结果的可重复性至关重要。

在鸡模型系统中，T. cruzi 感染会在胚胎发育早期免疫系统形成后被清除。此外，由接种了 T. cruzi 的鸡蛋孵化出的雏鸡不仅无感染，而且在缺乏特异性抗体的情况下，对寄生虫抗原具有耐受性。在kDNA突变的鸡中，可观察到细胞毒性淋巴细胞对靶向心肌细胞的排斥反应（最小排斥单位，图3），这些鸡表现出基因型改变及免疫监视功能的破坏3。基因型改变的T细胞在体内表现出对自身组织的加速排斥。主要病变部位为心脏，这是恰加斯病的典型特征。从生理状态（免疫监视）向病理生理状态的转变，可见于kDNA突变鸡中细胞毒性淋巴细胞的克隆性增殖3。

这种跨物种模型系统表现出由寄生虫诱导的、基因驱动的自身免疫性疾病（图6），其根源在于克氏锥虫（T. cruzi）动基体DNA（kDNA）微环整合所导致的基因组改变。而在接种了Lb的卵孵化出的雏鸡中则未观察到此类基因组改变。

这一现象表明，针对线粒体DNA突变鸡的炎症性自身免疫性心肌病的实验性治疗，可能需要使用药物抑制浸润心肌的特定T细胞表型的骨髓前体细胞，并通过移植组织相容的健康骨髓以防止自身组织被排斥。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

感谢美国加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院免疫学、微生物学与分子生物学系的 Nancy R. Sturm 对稿件的审阅。本研究得到巴西国家研究理事会（CNPq）和巴西联邦区研究发展基金会（FAPDF）的资助。感谢巴西巴西利亚大学的 Alessandro O. Souza、Maria C. Guimaro、Ciro Cordeiro、Ana de Cassia Rosa、Roseneide Alves 和 Rafael Andrade 提供的技术协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Taq DNA 聚合酶 重组Invitrogen11615-010
Platinum Taq DNA 聚合酶Invitrogen10966-030
随机引物 DNA 标记系统Invitrogen18187-013
EcoRI Invitrogen15202-021
MboI Invitrogen15248-016
dNTP 混合物，100 mM 溶液GE Healthcare28-4065-51
Amersham Hybond - N+ -- 货号GE HealthcareRPN303B
质粒小量提取离心柱试剂盒GE Healthcare28-9042-70
NsiI Sigma-AldrichR5884 1KU
鱼精 DNA 钠盐AMRESCO0644-10G
小鼠抗鸡 Bu-1b 抗体SouthernBiotech8370-02
小鼠抗鸡 CD45 抗体SouthernBiotech8270-08
小鼠抗鸡 TCRγδSouthernBiotech8230-08
小鼠抗鸡 CD8αSouthernBiotech9220-02
小鼠抗鸡单核细胞/巨噬细胞抗体SouthernBiotech8420-02
MyCycle 梯度 PCR 仪Bio-Rad580BR 5501

参考文献

  1. Teixeira, A. R. Pathogenesis of chagas' disease: parasite persistence and autoimmunity. CMR. 24, 592-630 (2011).
  2. Teixeira, A. R. Chagas disease. Postg. Med. J. 82, 788-798 (2006).
  3. Teixeira, A. R. Trypanosoma cruzi in the chicken model: Chagas-like heart disease in the absence of parasitism. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e1000(2011).
  4. Hecht, M. M. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 5, e9181(2010).
  5. Xing, Z. Roles of the ERK MAPK in the regulation of proinflammatory and apoptotic responses in chicken macrophages infected with H9N2 avian influenza virus. J. Gen. Virol. 91, 343-351 (2010).
  6. Kim, H. B. NIK and IKKbeta interdependence in NF-kappaB signalling--flux analysis of regulation through metabolites. Biosystems. 99, 140-149 (2010).
  7. Karakhanova, S. ERK/p38 MAP-kinases and PI3K are involved in the differential regulation of B7-H1 expression in DC subsets. Eur. J. Immunol. 40, 254-266 (2010).
  8. Finsterer, J. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
  9. Nitz, N. Heritable integration of kDNA minicircle sequences from Trypanosoma cruzi into the avian genome: insights into human Chagas disease. Cell. 118, 175-186 (2004).
  10. Simpson, L. Kinetoplast DNA in trypanosomid flagellates. Int. Rev. Cytol. 99, 1-19 (1986).
  11. Bonney, K. M. Heat-killed Trypanosoma cruzi induces acute cardiac damage and polyantigenic autoimmunity. PLoS One. 6, e14571(2011).
  12. Moser, D. R. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 27, 1477-1482 (1989).
  13. Sturm, N. R. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas' disease. Mol. Biochem. Parasitol. 33, 205-214 (1989).
  14. Teixeira, A. R. Evolution and pathology in chagas disease--a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 101, 463-491 (2006).
  15. Yurchenko, V. Y. Structure of Leishmania minicircle kinetoplast DNA classes. J. Clin. Microbiol. 37, 1656-1657 (1999).
  16. Simpson, L. The genomic organization of guide RNA genes in kinetoplastid protozoa: several conundrums and their solutions. Mol. Biochem. Parasitol. 86, 133-141 (1997).
  17. Thomas, S. A non-universal transcription factor? The Leishmania tarentolae TATA box-binding protein LtTBP associates with a subset of promoters. Int J. Parasitol. 36, 1217-1226 (2006).

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DNA PCR Southern
寄生虫诱导的基因驱动型自身免疫性恰加斯心脏病鸡模型
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