双光子显微镜技术的最新进展已实现实时观察 在 在动物模型中对活体组织进行原位成像，从而增强我们在生理和病理条件下研究细胞行为的能力。本文概述了对小鼠腘窝淋巴结进行活体成像所需的操作准备。
本文内容
摘要
摘要
淋巴结（LNs）是继发性淋巴器官，分布在全身各处，可捕获外周组织中的外来抗原并将其呈递给适应性免疫系统，从而启动适应性免疫应答。淋巴结位于固有免疫与适应性免疫之间，是研究免疫细胞相互作用的理想部位1,2。淋巴细胞（T细胞、B细胞和NK细胞）、树突状细胞（DCs）以及巨噬细胞构成了淋巴结中主要的骨髓来源细胞成分。这些细胞在淋巴结内具有特定的空间定位，以实现对自身抗原及潜在外来抗原的有效监视3-5。近年来，淋巴细胞如何成功识别其特异性抗原的过程受到广泛关注，该过程涉及多种分子相互作用的整合，包括抗原受体、黏附分子、趋化因子以及纤维网状网络等基质结构2,6-12。
在高分辨率实时荧光活体成像技术出现之前，研究人员依赖静态成像，该方法仅能提供有关形态、位置和组织结构的信息。尽管这些问题对于我们理解免疫细胞行为至关重要，但该技术固有的局限性使其无法分析淋巴细胞的迁移路径以及影响细胞动态行为的微环境线索。近年来，活体双光子激光扫描显微镜（2P-LSM）的发展使研究人员能够观察个体细胞在活体淋巴结（LNs）内的动态运动与相互作用。 原位12-16特别是，我们及其他研究者已将该技术应用于成像腘窝淋巴结内的细胞行为与相互作用，其致密紧凑的结构特点使得能够在包含多种组织亚结构的大范围组织区域内实现多重数据采集。11,17-18需要注意的是，该技术相较于离体组织成像技术具有额外优势，后者需要中断血液和淋巴流动，并最终破坏系统的细胞动态。此外，离体组织在取出后仅能在有限的时间内保持成像所需的活性。通过适当的水合处理及对动物环境条件的监测，该活体成像技术可显著延长成像时间。本文中，我们详细介绍了一种用于进行活体成像的小鼠腘窝淋巴结制备方法。
方案
1. 小鼠固定器组装
- 将一个100毫米玻璃培养皿的盖子覆盖在倒置的100毫米塑料培养皿盖上，使玻璃盖边缘轻微接触塑料皿盖的中心点。以玻璃盖作为模板，在塑料皿盖上描出标记。
- 使用手钻（例如Dremel）切除部分100毫米塑料培养皿盖，制成新月形平台。该新月形塑料盖将用于支撑小鼠的上半身（图1a）。在新月形盖上钻两个孔，用于用金属扎线固定气体麻醉面罩。使用强力胶水或同等强度的粘合剂将塑料盖固定在玻璃培养皿边缘（图1b）。
- 将两个圆顶盖PCR管的管盖（在铰链处截断）相距1厘米粘合在底部培养皿中心，用于固定腘窝皮肤瓣。
2. 小鼠准备
注意： 经过足够的练习后，应能在 20-30 分钟内完成小鼠的准备工作和手术步骤。
- 使用经IACUC批准的程序，将异氟烷（诱导浓度为2%至2.5%，手术/成像期间为1.5%至2%）与1:1的O2：空气混合气体以1 L/min的流速混合，对小鼠进行麻醉。小鼠麻醉后，用胶带将气体面罩固定在其鼻部。通过脚趾和/或尾部夹捏无反应来判断小鼠是否已完全麻醉。可根据需要调整异氟烷浓度，以确保动物充分镇静，呼吸平稳，呼吸频率维持在60–80次/分钟。
- 使用电动剃毛器去除小鼠右侧后肢及腹股沟区域的毛发。
- 刷去松散的毛发，并用棉签在剃毛区域均匀涂抹适量的Nair脱毛乳液。初次涂抹一分钟后，清除Nair，并用湿润的纸巾清洁暴露的皮肤。确保小鼠体表干净且干燥后再进行下一步操作。
- 用剪刀在右侧膝关节处做一个2至3 mm的小切口，以暴露伸肌腱。
- 在小鼠固定装置的中央部位涂抹Vetbond胶水，该位置将用于固定小鼠身体和腿部。小心地将小鼠固定在装置上，使其右侧膝关节朝下，以暴露右侧腘窝。将右侧膝腱用Vetbond固定在两个皮肤瓣固定夹之间，以帮助稳定成像区域。
- 将小鼠的双前肢和左侧后肢拉直，并用胶带固定在装置的上层平台上。
- 使用扎线固定气体面罩的位置。
- 将固定装置置于解剖显微镜下。淋巴结必须保持绝对静止，不受小鼠呼吸运动的影响。因此，在手术过程中必须采取预防措施，以优化腿部的稳定性。确定尾部的位置（通常位于头部上方），使其有助于右侧腿部达到最大稳定性，并用胶带将尾部固定。
3. 手术
- 在解剖显微镜下操作时，使用空间加热器或加热垫维持小鼠体温。为成功成像腘淋巴结（popliteal LN），在整个手术过程中维持适当的体温至关重要，同时需持续向暴露的组织滴加温热的磷酸盐缓冲液（PBS）以保持组织湿润。
- 使用聚维酮碘（Betadine）对皮肤进行消毒。用无菌剪刀在右侧小腿中部沿中线切开皮肤，并垂直向上剪至右侧大腿上部。
- 在垂直切口线顶端做两个横向皮肤切口，以形成两侧的皮瓣。
- 用Vetbond将两侧皮瓣牵拉并固定。在涂抹Vetbond前将皮肤拉紧可进一步增强腿部稳定性；但需确保皮肤张力不会阻断血流（例如血管颜色或直径发生变化）。继续将皮肤其他区域粘贴固定，以确保在暴露淋巴结前腿部稳定。小鼠体型将决定需要固定的额外皮肤量。通常，体型较大的小鼠需要将更多皮肤粘贴在固定装置上。
- 淋巴结应位于腘窝内，处于腘静脉的右侧或左侧，具体位置取决于小鼠在固定装置上的摆放方式。使用显微解剖镊子和钳子小心地将淋巴结从周围的脂肪组织和肌肉中分离。为减少出血和创伤，可采用显微镊子的张开技术来分离组织。在暴露腘淋巴结时，应小心操作，避免损伤传入和传出血管以及传入淋巴管的完整性。
- 为增强组织稳定性，可在湿润的淋巴结上方放置一方形盖玻片，使其刚好轻触淋巴结，同时避免压迫血管。盖玻片可用塑型黏土固定于小鼠两侧。
- 此时可通过静脉注射不同分子量的荧光血管染料（例如TRITC-葡聚糖，最小70kDa），以在成像过程中帮助凸显淋巴结的结构关系及其完整性。
4. 双光子成像采集**
- 当淋巴结充分暴露并达到稳定状态后，立即将整个小鼠固定装置转移至环境显微镜腔室内的显微镜载物台上，该腔室维持在37°C，并配备带有程序化温度反馈控制的加热垫。加入足量的无菌温热（37°C）PBS或HBSS，以完全浸没淋巴结。液体体积需根据小鼠的大小和位置进行调整。或者，可通过连接在蠕动泵上的细玻璃移液管，直接向已解剖的淋巴结持续灌注温热的PBS或HBSS，并将移液管固定在浸没物镜的镜柱上。液体流速应控制在可在物镜与组织之间维持稳定的水柱。
- 使用带反馈探针的加热垫维持PBS或HBSS的温度在37°C。另将一个独立的温度探针置于小鼠固定装置中，以确认PBS的温度保持在36.5至37.5°C范围内。也可使用直肠探针在整个成像过程中持续监测实验小鼠的核心体温。
- 使用落射荧光灯辅助在物镜下定位淋巴结。根据目标细胞相互作用的时间尺度，设置合适的时间间隔采集荧光图像序列（通常每个xyz图像序列之间的间隔为10秒至1分钟）。
- 在成像过程中，应频繁通过肉眼观察或使用动物监测系统检查显微镜腔室内动物的状态。通过脚趾和/或指甲夹捏无反应、且呼吸平稳、呼吸频率维持在每分钟60–80次，判断小鼠是否处于完全麻醉状态。可根据需要调整异氟烷浓度，以确保动物持续处于深度镇静状态。在适当监测和补液条件下，动物可维持成像4–6小时，甚至更长时间。
- 成像实验结束后，按照IACUC批准的安乐死程序，在CO2安乐死舱中对动物实施安乐死。在实施安乐死前，不得让动物从麻醉状态中苏醒。
** 该手术操作可能也适用于除双光子激光扫描显微镜以外的其他类型的活体成像。
5. 代表性结果
在过继转移后，不同类型的循环免疫细胞以不同的速率被募集到淋巴结。对于CD4+和CD8+淋巴细胞而言，这些细胞在静脉转移后数分钟内即开始通过高内皮微静脉（HEV）进入淋巴结，大量细胞在2至4小时后到达腘窝淋巴结6,17-18。而对于B细胞，大量积累通常发生在8至24小时后19。活化的树突状细胞（DCs）应在足垫注射后8至16小时开始出现在引流的腘窝淋巴结中3,11,16-17。图2a显示，即使没有其他标志结构，诸如B细胞滤泡等结构也可通过双光子激光扫描显微镜（2P-LSM）下可见的圆形球状细胞聚集而被清晰识别19。利用内源性荧光报告系统，例如泛素-GFP脾细胞（图2，补充视频1和2），可在非刺激性的生理条件下连续追踪这些淋巴细胞的迁移行为长达数天至一周。借助多通道高灵敏度探测器，可获得包含结构信息以及多种细胞间相互作用动态的多重成像数据集17,19。
当手术操作规范且环境条件得到严格监控时，淋巴细胞应表现出特征性的迁移速度，如图2c、2d及其他文献所示13-14,16。由于淋巴结不同亚区的成像区域可能存在淋巴细胞迁移速度的差异，因此额外的解剖标志（如通过血管染料标记的血管）将有助于评估整体成像质量（即温度控制是否恰当、淋巴结是否受到最小损伤等）3,6,20。
图 1. 小鼠腘窝淋巴结成像用小鼠固定装置的构建。 a) 小鼠固定装置组装示意图；b) 活体小鼠准备的代表性操作；c) 完成组装的小鼠固定装置；d) 手术暴露后腘窝淋巴结的特写图像。
图 2. 转移的GFP+淋巴细胞在腘窝淋巴结中的迁移分析。 （a）来自C57BL/6受体小鼠腘窝淋巴结的双光子激光扫描显微镜（2P-LSM）成像序列的三维快照，该小鼠在成像前1天通过过继转移方式接受了1×107个GFP+淋巴细胞。虚线表示B细胞滤泡的边界；（b）连续成像1小时期间淋巴细胞迁移的轨迹；（c）淋巴细胞总体迁移速度的分布。平均速度 = 10.04 ± 4.26 μm/min（共分析15,125条轨迹）；（d）位于B细胞滤泡内（空心柱状图；平均速度 = 8.79 ± 3.90 μm/min；共分析1,525条轨迹）与T细胞区（实心柱状图；平均速度 = 13.77 ± 5.93 μm/min；共分析1,250条轨迹）的细胞迁移速度分布差异。比例尺 = 50 μm。
补充视频 1。 如图 2 所述，对小鼠腘窝淋巴结进行延时活体双光子激光扫描显微成像。成像前 24 小时，从小鼠泛素-GFP+ 供体中分离出 1×107 个淋巴细胞，并通过静脉过继转移至 C57BL/6 受体小鼠体内。通过固定的 z 轴层扫（5 μm 步长，共 13 步）连续采集一系列 xy 平面（750 μm × 750 μm）荧光图像，生成一个 xyz 三维图像堆栈（750 μm × 750 μm × 65 μm），每 20 秒重复一次，持续 60 分钟，最终形成用于速度分析的 xyzt 四维成像序列（图 2c、2d）。播放速度 = 450×。比例尺 = 50 μm。时间戳 = 分:秒。 点击此处观看补充视频。
补充视频 2. 补充视频 1 中 B 细胞滤泡与 T 细胞区边界处成像序列的放大视图。播放速度 = 450 倍。比例尺 = 25 μm。时间戳 = 分: 秒。 点击此处观看补充视频。
讨论
高分辨率技术的最新进展 原位 成像技术，尤其是双光子激光扫描显微镜（2P-LSM），伴随着人们对动态细胞行为研究日益增长的兴趣 体内对活体小鼠腘窝淋巴结进行4D成像，可在未受干扰的组织微环境中分析免疫细胞的动态行为。利用覆盖整个可见光谱的多探测器双光子激光扫描显微镜（2P-LSM），可同时采集多种细胞群体的成像数据。这一目标如今可通过以下方法实现 体内 细胞特异性荧光报告小鼠（例如 Ubiquitin-eGFP、-RFP 或 -eCFP）与不同荧光标记的细胞群体过继转移相结合，利用有机荧光细胞染料（例如 CFSE、SNARF-1 和 Cell Tracker Orange）研究淋巴结（LN）内的细胞机制与功能。除了直接观察不同标记细胞群体之间的相互作用外，还可利用 commercially available 成像处理软件程序（例如 Imaris, BitPlane Inc.）对多重成像数据集进行进一步分析，以更深入阐明细胞行为与功能。利用这些方法可开展广泛的研究，探索细胞相互作用机制。 体内 和 计算机模拟 技术
本文所述实验方法的主要局限性在于手术操作本身固有的技术复杂性。该技术需要经过严格培训，以熟悉相关解剖结构以及本方案所要求的精确技术步骤和操作技能。其他进一步增加难度的因素包括：在淋巴结探查过程中难以最大限度减少组织损伤、成像期间难以优化组织稳定性，以及在成像实验前和过程中难以避免热损伤和激光对淋巴结的损伤。上述任一因素的干扰均会导致淋巴细胞运动能力低于理想状态，从而影响对成像数据结果的正确解读。
披露
作者无任何事项需要披露。
致谢
本工作获得了以下机构的资助：NCI 1R01CA154656、NIAID 1R21AI092299、癌症研究所、圣·巴尔德里克基金会、达纳基金会、加布里埃尔天使基金会以及现代汽车美国公司“希望之轮”项目。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷，USP | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Nair - 脱毛乳液 | Nair | ||
| PBS，1× | Cellgro | 21-040-CV | |
| 加热垫 | Watlow | ||
| 加热垫控制器 | Watlow | ||
| 空气和O2 | Airgas | ||
| 温度探针 | Harvard Apparatus | ||
| 镊子 Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14101 | |
| 持针钳，Graefe 睫状体，7 cm 弯型 | World Precision Instruments, Inc. | 14141 | |
| 剪刀 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| 100×20 mm 玻璃细胞培养皿盖 | Corning | 70165-102 | |
| 100×20 mm 聚苯乙烯细胞培养皿盖 | Corning | 430167 | |
| 聚维酮碘溶液（10% 聚维酮碘外用溶液） | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 |
参考文献
- Bousso, P. T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies. Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).
- Germain, R. N. Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging. Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).
- Huang, A. Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
- Stefanova, I. Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes. Nature. 420, 429-434 (2002).
- Stefanova, I. On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen. Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).
- Bajenoff, M. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
- Celli, S. Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo. Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).
- Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes. Immunity. 25, 867-869 (2006).
- Worbs, T. CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo. J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).
- Bajenoff, M. byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node. Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).
- Mempel, T. R. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- von Andrian, U. H., Mempel, T. R. Homing and cellular traffic in lymph nodes. Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).
- Castellino, F. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).
- Halin, C. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
- Qi, H. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science. 312, 1672-1676 (2006).
- Germain, R. N. An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging. Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).
重印与许可
标签
