机械感受毛细胞是内耳中的感受器细胞。目前研究最为清楚的 体外 利用成年小鼠椭圆囊的器官培养作为成熟哺乳动物毛细胞的模型系统。本文展示了成年小鼠椭圆囊的解剖分离，并演示了在培养的椭圆囊中通过腺病毒介导感染支持细胞的方法。
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摘要
摘要
听力损失和平衡功能障碍通常由内耳的感受器细胞——机械感觉毛细胞的死亡引起。由于目前尚无能够充分代表哺乳动物毛细胞的细胞系，毛细胞的研究依赖于原代器官培养。最成熟的体外（in vitro）成年哺乳动物毛细胞模型系统采用成年小鼠球囊的器官培养（图1）1-6。球囊是一种前庭器官，其毛细胞在结构和功能上均与听觉器官——柯蒂氏器中的毛细胞相似。成年小鼠球囊制备物代表了一种成熟的感受上皮，可用于研究调控这些细胞存活、稳态及死亡的分子信号。
哺乳动物的耳蜗毛细胞为终末分化的细胞，一旦丢失便无法再生。在非哺乳动物脊椎动物中，听觉或前庭毛细胞死亡后会伴随强烈的再生反应，从而恢复听觉和平衡功能7, 8。毛细胞的再生由胶质样支持细胞介导，这些支持细胞与感觉上皮中毛细胞的基底外侧表面相接触9, 10。支持细胞也是调控毛细胞存活与死亡的重要中介因子11。我们近期建立了一种利用腺病毒感染培养耳石器中支持细胞的技术。通过使用5型腺病毒（dE1/E3）将由CMV启动子驱动的含GFP的转基因递送至细胞，我们发现腺病毒能够特异性且高效地感染支持细胞。支持细胞的感染效率约为25–50%，而毛细胞未被感染（图2）。重要的是，我们发现腺病毒感染支持细胞不会对毛细胞或支持细胞产生毒性作用，因为在Ad-GFP感染的耳石器中细胞数量与未感染的耳石器相当（图3）。因此，在培养的耳石器中利用腺病毒介导的支持细胞基因表达，为研究支持细胞在毛细胞存活、死亡和再生过程中的作用提供了一个强有力的工具。
方案
1. 球囊解剖与培养
- 使用批准的方案处死一只成年（4 周龄或以上）小鼠，并进行断头。
- 剪开头部两侧的外耳道，将皮肤向前拉至鼻部。从后向前将头部沿中线切开，取出两侧脑组织，暴露骨迷路。
- 去除耳蜗周围的颅骨组织，将骨迷路（包括鼓泡）转移至配备解剖显微镜的组织培养罩内（注意：腺病毒操作应在 II 级生物安全柜中进行）。
- 在罩内，将每个耳蜗转移至含有无菌解剖液（M199，Gibco/Invitrogen #12350）的 35 mm 组织培养皿中（图 1A）。
- 如果听泡仍完整（可在粗解剖过程中用拇指指甲插入听泡与耳蜗顶回之间将其分离），使用两把镊子（一把 #3 镊，一把 #5 镊）敲碎听泡（图 1B）。
- 辨认骨性耳蜗标本的解剖标志：顶回、基底回、听小骨、前庭窗和蜗窗、第 VIII 脑神经根、半规管（图 1 C, D）。
- 将内耳置于培养皿中，使内侧朝上，前庭窗、蜗窗及顶回位于皿底，第 VIII 脑神经根朝上。用 #3 镊夹住半规管区域以固定标本（图 1D）。
- 使用装有 #11 刀片的手术刀，在神经根稍偏耳蜗顶回一侧处切下耳蜗顶回（图 1D）。
- 翻转标本，使切面朝上。以前庭半规管作为手柄以稳定标本（图 1E）。
- 使用 #5 镊从蜗轴处开始向下剥离至基底回。当到达耳蜗钩部向下弯曲的位置时，使用细探针（折断的 #55 镊的一半）轻轻挑起骨螺旋板的最后一段骨性支架（图 1F），暴露球囊。球囊下方紧邻的是镫骨底板，这是一个重要的解剖标志。椭圆囊紧邻镫骨底板（图 1G），周围被骨组织包绕。用探针小心凿除部分骨组织，使约 1/3 的椭圆囊暴露。使用 #55 镊小心取出椭圆囊（图 1H）。此操作通常会在拉出椭圆囊时一并带走色素化的顶上皮。然而，若顶上皮仍完整附着于椭圆囊，则可用 #55 镊将其去除。
- 用于腺病毒感染（或活体成像实验）的椭圆囊必须在解剖过程中（感染前）去除耳石。此时，使用装有解剖液并配有细针头（通常为 26–28 号）的鲁尔锁式注射器。用 #55 镊夹住椭圆囊边缘（图 1I）。将针尖靠近椭圆囊，针尖斜面朝下。用解剖液的液流冲去耳石（图 1J）。或者，也可使用睫毛工具（Ted Pella, Inc. #113）轻轻刷去耳石。不进行腺病毒感染的椭圆囊通常在 24 孔组织培养板中以游离状态培养，并保留耳石完整（如需去除耳石，可在固定后进行，操作更简便，见下文）。
- 所有椭圆囊解剖完成后，将解剖液更换为无菌培养基：DMEM F12（Gibco #11320），添加 5% 胎牛血清和 50 U/ml 青霉素 G（Sigma）。
- 椭圆囊在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养。若培养时间超过 48 小时，应每隔一天更换一半培养基。培养可维持一周或更长时间。
2. 支持细胞的腺病毒感染
重要提示：使用腺病毒必须遵循生物安全二级（BSL2）操作规程并获得相应资质。请咨询您所在机构的生物安全负责人，以获取有关BSL2操作规程的指导和培训。
- 在解剖液（无血清）中如上所述解剖球囊。如上所述去除耳石。
- 准备感染时，将1个球囊（毛细胞面向上）转移至Nunc微型培养皿（Fisher #12-565-68）的每个孔中，每孔含15 μL 无血清 DMEM F12（此步骤至关重要，因为血清可能使病毒失活）。使用1.5 mm显微刮匙（Fine Science Tools #10082-15）进行转移操作更为方便。
- 我们使用的Ad-GFP为5型腺病毒，其病毒E1和E3基因已被删除，外源基因（GFP）由人巨细胞病毒（CMV）启动子驱动。该病毒购自Vector BioLabs（美国宾夕法尼亚州费城，vectorbiolabs.com）。病毒原液的滴度为1.0-4.0×1010 PFU/mL。向每孔含球囊的培养液中加入0.5–2 μL病毒原液（图1L）。实际使用量需根据病毒种类及原液滴度进行调整。我们通常使每个球囊感染1.0–4.0×107 PFU的病毒量。
- 将球囊在含病毒的培养基中于37 °C、5% CO2条件下培养2小时。2小时后，将球囊转移回含有含血清培养基的24孔细胞培养板中。在37 °C、5% CO2条件下继续培养过夜。
- 次日可直接用于活细胞成像实验，或进行固定以进行毛细胞免疫组织化学染色（见下文）。病毒外源基因的表达随时间逐渐增强，因此若感染后24小时外源基因表达水平较低，可考虑在含血清培养基中额外延长培养24小时。若观察到毛细胞出现毒性反应，应减少病毒使用量。
3. 前庭囊固定、耳石去除及免疫化学染色
- 培养期结束后，将椭圆囊在4%多聚甲醛中固定，可选择在室温下于摇床上孵育3小时，或在4 °C下过夜。在0.1 M（1X）Sorensen磷酸缓冲液（pH 7.4）中清洗椭圆囊（每次15分钟，共洗3次）。上述步骤均在24孔组织培养板中进行。
- 耳石去除：注意：在进行腺病毒感染前必须去除耳石（见上述步骤1.11）。然而，不进行感染的椭圆囊可在保留耳石完整的情况下进行培养和固定。在此情况下，可在固定后使用此处描述的步骤去除耳石。 检查椭圆囊是否残留有色素化的顶上皮组织。使用两把#55镊子小心去除残留的顶上皮。为去除耳石，将Sorensen磷酸缓冲液替换为750–1000 μl Cal-Ex脱钙剂（Fisher #CS510-1D）。使Cal-Ex作用于椭圆囊1分40秒（不得超过2分钟）。随后用0.1 M Sorensen磷酸缓冲液替换Cal-Ex，并清洗（每次5分钟，共洗5次）。
- 将椭圆囊在硼氢化钠溶液（Sigma #452882，1%溶于去离子水）中孵育10分钟。再用0.1 M Sorensen磷酸缓冲液清洗椭圆囊（每次5分钟，共洗5次）。
- 将椭圆囊置于封闭液（PBS + 2%牛血清白蛋白 + 0.8%正常山羊血清 + 0.4% Triton X-100）中，在室温下于摇床上孵育3小时。
- 加入一抗，在4 °C下孵育过夜。使用抗Myosin 7a抗体（Proteus Biosciences #25-6790 或发育研究杂交瘤库中的#MYO7A 138-1），按1:100比例溶于封闭液，可标记所有毛细胞。为分别标记中央区和非中央区毛细胞，我们采用双重标记法，联合使用单克隆抗钙调蛋白抗体（Sigma #C 3545；1:150）和多克隆抗钙结合蛋白抗体（Chemicon #AB1778，Temecula, CA, USA；1:200）。二抗（通常为Invitrogen, Carlsbad, CA, USA生产的Alexa Fluor标记二抗）按1:500比例溶于封闭液，在室温下于摇床上避光孵育4小时。
- 使用Fluoromount-G封片剂（Southern Biotech, Birmingham, AL, USA）将椭圆囊封固于玻璃载片上。
4. 代表性结果
采用该方法培养的椭圆囊保留了完整的毛细胞和支持细胞（图2）。健康培养物中的毛细胞显示为圆形的细胞核轮廓，周围环绕着较薄的肌球蛋白7a阳性细胞质区域（图2，上图）。支持细胞（以抗Sox2抗体标记）比毛细胞更小且排列更为紧密（图2，下图）。腺病毒感染椭圆囊中25–50%的支持细胞，而毛细胞无感染（图2，Ad-GFP图组）。需要注意的是，每种腺病毒的最佳工作滴度必须通过实验确定，因为病毒滴度过高可能导致毛细胞死亡。此外，在解剖过程中造成的机械损伤区域会大量吸收病毒。这些机械损伤区域表现为一条连续的、绿色荧光蛋白（GFP）表达水平极高的细胞带，且缺乏毛细胞，易于识别。这与未受损培养物中支持细胞呈散在分布的GFP表达形成对比（图2）。
图1. 球囊的解剖。A： 听泡（AB）。B： 使用两把坚固的镊子将听泡敲开。C： 骨性耳蜗（RW = 蜗窗，S = 镫骨动脉，C = 耳蜗，ST = 镫骨）。D： 使用手术刀片（SB）在第八脑神经（8th N）顶端方向切断耳蜗顶部。ASC = 前半规管。E： 用一把#3镊子牢固夹住标本，其中一个镊齿插入前半规管（ASC），另一个置于最外层骨质上（箭头所示），用镊子去除膜迷路。F： 去除膜迷路后，骨螺旋板的基底回在钩区附近可见。将细探针插入该骨性突起下方，将其抬起并移除（箭头所示）。G： 去除球囊后，椭圆囊（U）紧邻镫骨底板（SF）可见。H： 使用#55镊子（箭头所示）取出椭圆囊（U）。SF = 镫骨底板。I： 椭圆囊的耳石（O）部分被去除，其下可见感觉上皮（SE）。J： 使用连接26号针头的注射器喷出培养液流，将耳石（O）从椭圆囊上冲洗去除。图像底部可见针头的阴影（S）。K： 耳石被完全去除后的椭圆囊，感觉上皮（SE）清晰可见。L： 腺病毒感染：每个椭圆囊（U）被放置于微型培养板的独立孔中。通过移液将病毒加入孔中以感染支持细胞（P = 移液管尖）。
图2. 支持细胞的腺病毒感染。 球囊被携带绿色荧光蛋白表达基因的腺病毒（Ad-GFP）感染。图中显示了同一球囊区域的毛细胞层和支持细胞层的共聚焦图像。毛细胞用抗Myosin 7a抗体标记（品红色）。支持细胞用抗Sox2抗体标记（红色）。示意图展示了球囊感觉上皮的结构以及毛细胞（HC）和支持细胞（SC）的位置。上方（U）和下方（L）图板所示的共聚焦（光学）切片位置由示意图中的虚线标示。上图板：在毛细胞核水平获取的共聚焦图像中，Ad-GFP信号出现在毛细胞之间的区域，且不与毛细胞标志物Myosin 7a重叠。下图板：在支持细胞核水平的共聚焦切片中，Ad-GFP信号与支持细胞标志物Sox2共定位。Ad-GFP感染仅导致支持细胞中表达GFP，而无毛细胞被感染。
图 3. 腺病毒感染不会导致毛细胞或支持细胞死亡。 利用浓度为 4×108 PFU/mL 的 Ad-GFP 感染椭圆囊。使用抗 Myosin 7a（毛细胞标志物）和 Sox2（支持细胞标志物）抗体对椭圆囊进行标记。毛细胞和支持细胞数量在对照组椭圆囊与 Ad-GFP 感染的椭圆囊之间无差异。
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讨论
感觉毛细胞易受到多种应激因素导致的死亡，包括衰老、噪声创伤以及接触耳毒性药物，如氨基糖苷类抗生素和抗肿瘤药物顺铂。在哺乳动物中，毛细胞的死亡会导致永久性听力损失和/或平衡功能障碍。体外模型系统是研究毛细胞死亡的细胞与分子机制，以及探索预防或逆转毛细胞死亡策略的重要工具。与成年哺乳动物耳蜗毛细胞不同，椭圆囊毛细胞在体外培养中存活良好。椭圆囊毛细胞对与耳蜗毛细胞毒性相同的治疗药物具有敏感性，且耳毒性所致毛细胞死亡与存活的细胞机制在椭圆囊和耳蜗毛细胞之间相似12-18。此外，当在体内验证椭圆囊模型系统所获得的数据时，该制备方法已被证实可可靠预测成熟耳蜗中毛细胞的存活与死亡情况12, 18-21。小鼠椭圆囊制备模型还允许我们通过使用转基因和基因敲除动物的椭圆囊来研究特定蛋白质的作用。
在应激条件下介导感觉毛细胞存活与死亡的信号机制尚不明确。然而，越来越多的证据表明，内耳中的其他细胞类型可能在决定应激毛细胞最终存活或死亡的过程中发挥重要作用11, 22, 23。椭圆囊模型系统可用于在成熟的哺...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢 Shimon P. Francis 博士提供了共聚焦显微图像。
本研究工作由国家聋哑与其他交流障碍研究所（NIDCD）院内研究部提供资助，额外支持来自 NIDCD 5R01 DC007613 项目。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 12350 | |
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11320 | |
| 精细镊子（#55） | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| 精细镊子（#5） | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 镊子（#3） | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| 青霉素G | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10082-139 | |
| Nunc 小型托盘 | Fisher Scientific | 12-565-68 | |
| 腺病毒-GFP | Vector Biolabs | 1060* | |
| Cal-Ex 脱钙剂 | Fisher Scientific | CS510-1D | |
| 硼氢化钠 | Sigma-Aldrich | 452882 | |
| 抗肌球蛋白7a（多克隆抗体） | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| 抗肌球蛋白7a（单克隆抗体） | 发育研究杂交瘤库 | MYO7A 138-1 | |
| 抗钙调蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | C 3545 | |
| 抗钙结合蛋白抗体 | Chemicon International | AB1778 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 表1。 用于椭圆囊培养和腺病毒感染的试剂与工具 | |||
| * 注：Ad-GFP 通常由 Vector Biolabs 提供，储存滴度为 1×1010 PFU/mL。我们要求定制扩增，使储存病毒的滴度达到 1.2×1011 PFU/mL。 |
参考文献
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勘误
Formal Correction: Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection
Posted by JoVE Editors on 4/17/2012. Citeable Link.
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