方法文章

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

DOI：

10.3791/3736

⸱

2012年7月8日

 ,  , 
1Institute for Research in Biomedicine, Bellinzona (Switzerland), 2Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche, Universitá degli Studi di Milano

本文内容

摘要

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本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。

摘要

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骨髓是成年有机体中造血干细胞（HSCs）以及更成熟的血细胞谱系前体细胞定居和分化的首要场所。HSCs 是一类极少量的多能细胞群体，具有终生产生所有血细胞谱系的能力1。对骨髓中 HSCs 稳态的分子机制进行解析，在造血生物学、肿瘤学和再生医学领域具有重要意义。本文描述了使用荧光标记抗体进行标记以及在流式细胞术中进行电子门控的操作流程，用于分析单只小鼠中造血前体细胞亚群及 HSCs 的分布情况（图 1）。此外，我们还介绍了一种通过磁性富集表达 c-Kit 的细胞，从混合的骨髓细胞悬液中大规模富集造血前体细胞以及长期（LT）和短期（ST）重建能力的 HSCs 的方法。所获得的细胞样品可用于分选特定亚群，以开展体外和体内功能研究（图 2）。

骨小梁成骨细胞2,3和窦状内皮4共同构成了支持骨髓中造血干细胞（HSCs）的功能性微环境。在成骨细胞微环境中，多种机制共同决定HSCs的静息状态，包括一部分表达N-钙黏蛋白（N-cadherin+）的成骨细胞3，以及HSCs中表达的受体酪氨酸激酶Tie2与其配体血管生成素-1之间的相互作用5。骨髓中的“冬眠”状态对于保护HSCs免于过度增殖循环所导致的复制性耗竭至关重要6。来自先天免疫系统细胞的外源性刺激，例如Toll样受体配体7和干扰素-α6，也可诱导HSCs增殖并分化为特定谱系的前体细胞。最近已有研究描述了一群处于静息状态的小鼠HSCs，其属于lin-c-Kit+Sca-1+CD150+CD48-CD34-细胞群体8。如本文所述，通过CD34表达对富集造血前体细胞的悬浮液进行分选，可分离出具有自我更新能力的静息型长期造血干细胞（LT-HSCs）以及短期造血干细胞（ST-HSCs）9。此前已有类似方法报道，即通过去除谱系阳性细胞，并利用CD48和Flk2抗体分选LT-HSCs10。本报告中，我们提供了一种用于造血前体细胞表型鉴定及体外细胞周期分析的实验方案，可用于监测不同生理和病理条件下造血过程的变化。此外，我们还描述了一种HSCs的流式细胞分选（FACS）操作流程，可用于细胞生物学和信号转导实验中调控HSC自我更新、扩增和分化相关因子与机制的研究，亦可用于移植实验。

方案

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1. 从骨髓制备细胞悬液

  1. 处死小鼠，将其置于不锈钢托盘中，并用70%乙醇喷洒其腹部和背部。采集后肢的股骨和胫骨，以及脊柱。
  2. 使用尖头剪刀仔细去除脊柱上的所有软组织残留物，用纱布清除腿骨上的软组织。将骨骼置于含有30 mL RPMI培养基的50 mL Falcon离心管中，该培养基添加了10%热灭活胎牛血清（FBS）、50 μM β-巯基乙醇、100 μM MEM非必需氨基酸、1 mM MEM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素。
  3. 用无菌滤纸覆盖预先灭菌的研钵底部。
  4. 将骨骼转移至研钵中，并用一层滤纸覆盖，以形成摩擦表面。
  5. 准备一个配有Falcon滤器的50 mL Falcon离心管。
  6. 借助研杵研磨骨骼，直至获得均一的细胞悬液。
  7. 将悬液转移至离心管中。
  8. 向研钵中加入5 mL新鲜的完全RPMI培养基，以洗涤并收集残留细胞。
  9. 重复最后两个步骤，直至匀浆后的骨骼呈透明状。
  10. 将细胞悬液转移并过滤至新的离心管中，以去除残留的组织碎片。
  11. 在1,500 rpm下离心5分钟，小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。

2. 表型分析

  1. 用 15 mL 的 PBS 和 2% FBS 重悬并洗涤单只小鼠....

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讨论

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本文所述方法可实现对单只小鼠造血过程的快速且准确的分析（图1）。该方法适用于多种实验条件，包括炎症、自身免疫、免疫缺陷、退行性疾病、代谢紊乱和癌症等小鼠模型，可用于研究病理状态对造血过程的影响。图3展示了通过Ki-67单克隆抗体和DAPI染色，对健康小鼠和炎症性肠病（IBD）小鼠经电子门控分选的LKS CD34-细胞进行的细胞周期活性分析13。结果显示，后者细胞周期S/G2/M期的细胞比例显著增加。该流式细胞术分析表明，T细胞介导的炎症会影响造血干细胞（HSC）的周期活性12。
通过结合磁性标记富集表达c-Kit的骨髓细胞与流式细胞术分选，可获得高度纯化的造血谱系前体细胞和HSCs。所获得的细胞群体可用于多种实验，以研究细胞生物学（图4）、信号转导（图5）、发育调控的基因表达，以及不同细胞亚群的体外（in vitro）和体内（in vivo）功能潜.......

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Nobuyuki Onai、Hitoshi Takizawa 和 Markus Manz 提供的宝贵建议。本工作由瑞士国家科学基金会、瑞士癌症联盟以及提契诺癌症研究基金会资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI 1640Gibco42401
MEM NEAA 100XGibco11140
丙酮酸钠Gibco11360
青霉素-链霉素（PenStrep）Gibco15070
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco20012
胎牛血清（FBS）Gibco16000
40 μm 细胞筛BD Falcon352340
7-AAD 染色液BD Pharmingen559925
裂解/固定缓冲液（Lyse/Fix buffer）BD Pharmingen558049
Perm buffer IIIBD Pharmingen558050
Ki-67BD Pharmingen556026
DAPIInvitrogenD21490
CD4 (GK1.5)eBioscience150041
CD8 (53-6.7)eBioscience150081
CD3 (145-2C11)eBioscience150031
CD45R (RA3-6B2)eBioscience150452
CD19 (6D5)eBioscience150193
Gr1 (RB6-8C5)eBioscience155931
Tre119 (TER-119)eBioscience155921
NK-1.1 (PK136)eBioscience455941
c-Kit (2B8)eBioscience171171
Sca-1 (D7)eBioscience135981
CD34 (RAM34)eBioscience110341
FcγR (2.4G2)eBioscience553145
抗 APC 微珠（Anti-APC MicroBeads）Miltenyi Biotec130-090-855
LS 柱（LS Columns）Miltenyi Biotec130-042-401

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
  3. Zhang, J.

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标签

c Kit

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