小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

摘要

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。

摘要

骨髓是成年有机体中造血干细胞（HSCs）以及更成熟的血细胞谱系前体细胞定居和分化的首要场所。HSCs 是一类极少量的多能细胞群体，具有终生产生所有血细胞谱系的能力¹。对骨髓中 HSCs 稳态的分子机制进行解析，在造血生物学、肿瘤学和再生医学领域具有重要意义。本文描述了使用荧光标记抗体进行标记以及在流式细胞术中进行电子门控的操作流程，用于分析单只小鼠中造血前体细胞亚群及 HSCs 的分布情况（图 1）。此外，我们还介绍了一种通过磁性富集表达 c-Kit 的细胞，从混合的骨髓细胞悬液中大规模富集造血前体细胞以及长期（LT）和短期（ST）重建能力的 HSCs 的方法。所获得的细胞样品可用于分选特定亚群，以开展体外和体内功能研究（图 2）。

骨小梁成骨细胞^2,3和窦状内皮⁴共同构成了支持骨髓中造血干细胞（HSCs）的功能性微环境。在成骨细胞微环境中，多种机制共同决定HSCs的静息状态，包括一部分表达N-钙黏蛋白（N-cadherin⁺）的成骨细胞³，以及HSCs中表达的受体酪氨酸激酶Tie2与其配体血管生成素-1之间的相互作用⁵。骨髓中的“冬眠”状态对于保护HSCs免于过度增殖循环所导致的复制性耗竭至关重要⁶。来自先天免疫系统细胞的外源性刺激，例如Toll样受体配体⁷和干扰素-α⁶，也可诱导HSCs增殖并分化为特定谱系的前体细胞。最近已有研究描述了一群处于静息状态的小鼠HSCs，其属于lin^-c-Kit⁺Sca-1⁺CD150⁺CD48^-CD34^-细胞群体⁸。如本文所述，通过CD34表达对富集造血前体细胞的悬浮液进行分选，可分离出具有自我更新能力的静息型长期造血干细胞（LT-HSCs）以及短期造血干细胞（ST-HSCs）⁹。此前已有类似方法报道，即通过去除谱系阳性细胞，并利用CD48和Flk2抗体分选LT-HSCs¹⁰。本报告中，我们提供了一种用于造血前体细胞表型鉴定及体外细胞周期分析的实验方案，可用于监测不同生理和病理条件下造血过程的变化。此外，我们还描述了一种HSCs的流式细胞分选（FACS）操作流程，可用于细胞生物学和信号转导实验中调控HSC自我更新、扩增和分化相关因子与机制的研究，亦可用于移植实验。

方案

1. 从骨髓制备细胞悬液

1. 处死小鼠，将其置于不锈钢托盘中，并用70%乙醇喷洒其腹部和背部。采集后肢的股骨和胫骨，以及脊柱。
2. 用尖头剪刀仔细去除脊柱上的所有软组织残留物，用纱布去除腿骨上的软组织残留物。将骨骼置于含有30 mL RPMI培养基的50 mL Falcon离心管中，该培养基添加了10%热灭活胎牛血清（FBS）、50 μM β-巯基乙醇、100 μM MEM非必需氨基酸、1 mM MEM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素。
3. 用无菌滤纸覆盖预先灭菌的研钵底部。
4. 将骨骼转移至研钵中，并用一层滤纸覆盖，以形成摩擦表面。
5. 准备一个配有Falcon滤器的50 mL Falcon离心管。
6. 借助研杵捣碎骨骼，直至获得均一的细胞悬液。
7. 将悬液转移至离心管中。
8. 向研钵中加入5 mL新鲜的完全RPMI培养基，以洗涤并收集残留细胞。
9. 重复最后两个步骤，直至匀浆后的骨骼呈透明状。
10. 将细胞悬液转移并过滤至新的离心管中，以去除残留的组织碎片。
11. 在1,500 rpm条件下离心5分钟，小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。

2. 表型分析

1. 用 15 mL 的 PBS 和 2% FBS 重悬并洗涤单只小鼠的细胞。
2. 以 1,500 rpm 离心 5 分钟，小心吸弃上清液，注意不要扰动沉淀。
3. 将沉淀重悬于 5 mL PBS 和 2% FBS 中，并进行细胞计数。
4. 将 1×10⁶ 个细胞/孔转移至 96 孔圆底板中。
5. 以 1,500 rpm 离心 5 分钟。
6. 配制针对以下表面标志物的单克隆抗体混合液。按照说明用 PBS 和 2% FBS 稀释，用于细胞染色。
   • CD4、CD8、CD3、CD45R、CD19、Gr1、Ter119、NK1.1-PE-Cy5，1:200
   • c-Kit-APC，1:100
   • Sca1-生物素，1:50
   • CD34-FITC，1:50
   • FcγR-PE，1:100
   • IL-7R-PE-Cy7，1:100
7. 弃去上清液，每孔加入 50 μL 单克隆抗体混合液，通过移液将细胞解离为单细胞悬液。
8. 在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
9. 用 150 μL PBS 和 2% FBS 洗涤细胞两次。
10. 以 1,500 rpm 离心 5 分钟，通过倒置培养板弃去上清液。
11. 按照说明用 PBS 和 2% FBS 稀释链霉亲和素，用于细胞染色。
    • 链霉亲和素-APC-Cy7，1:300
12. 每孔加入 50 μL 染色液，通过移液将细胞解离为单细胞悬液。
13. 在 4 °C 避光孵育 10 分钟。
14. 用 150 μL PBS 和 2% FBS 洗涤细胞两次。
15. 以 1,500 rpm 离心 5 分钟，弃去上清液。
16. 将细胞重悬于 100 μL PBS 和 2% FBS 中。
17. 在流式细胞仪（FACS）上检测样品。

3. c-Kit⁺ 细胞的磁珠富集

1. 配制含有 PBS（pH 7.2）、0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA 的缓冲液。
2. 将来自至少 10 只小鼠的骨髓细胞沉淀重悬于 1 mL 缓冲液中，该缓冲液中含有以 1:50 稀释的 APC 标记的 c-Kit 单克隆抗体（mAb）。
3. 在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
4. 用 40 mL 缓冲液洗涤细胞两次。
5. 以 1,500 rpm 离心 5 分钟，并小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀。
6. 重悬细胞沉淀，并为每只处死的小鼠直接向沉淀中加入 50 μL Anti-APC MicroBeads。
7. 充分混匀后，在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
8. 加入 40 mL 缓冲液洗涤细胞，然后以 1,500 rpm 离心 5 分钟，彻底吸除上清液。
9. 每处死三只小鼠，将细胞沉淀重悬于 4 mL 倍数的缓冲液中。
10. 将 MACS LS 柱置于合适的 MACS 分离器的磁场中。每处死三只小鼠使用一根柱子。
11. 用 4 mL 缓冲液冲洗柱子以进行预处理。
12. 将细胞悬液加至柱子上。
13. 收集未标记的流穿细胞，并用 4 mL 缓冲液洗涤柱子。洗涤步骤共进行三次，每次加入 4 mL 缓冲液。当柱子储液室排空后，再加入新的缓冲液。
14. 从分离器上取下柱子，并将每根柱子放置于 15 mL Falcon 管上方。
15. 向每根柱子中加入 4 mL 缓冲液，立即通过推动柱塞将磁性标记的细胞冲洗下来。
16. 以 1,500 rpm 离心 5 分钟，并小心吸除上清液。
17. 将每个沉淀用 1 mL 缓冲液重悬，并将所有沉淀合并至一个 15 mL Falcon 管中。

4. 造血干细胞与谱系定向祖细胞的分选

1. 准备针对以下表面标志物的单克隆抗体（mAb）混合物。按照指示将其稀释于500 μL PBS和2% FBS中，用于细胞染色。
   • CD4、CD8、CD3、CD45R、CD19、Gr1、Ter119、NK1.1偶联PE-Cy5，1:200
   • c-Kit偶联APC，1:100
   • Sca-1偶联生物素，1:50
   • CD34偶联FITC，1:50
   • FcγR偶联PE，1:100
2. 将上一步骤中的离心管在1,500 rpm下离心5分钟，并通过抽吸小心去除上清液。
3. 将单克隆抗体混合液加入细胞沉淀中。通过移液将细胞重悬并解离为单细胞悬液。
4. 将细胞在4 °C避光孵育20分钟。
5. 用14 mL PBS和2% FBS洗涤细胞两次。
6. 将离心管在1,500 rpm下离心5分钟，并弃去上清液。
7. 按照说明将链霉亲和素稀释于500 μL PBS和2% FBS中，用于细胞染色。
   • 链霉亲和素偶联APC-Cy7，1:300
8. 将溶液加入离心管中。通过移液将细胞解离为单细胞悬液。
9. 将细胞在4 °C避光孵育10分钟。
10. 用14 mL PBS和2% FBS洗涤细胞两次。
11. 将离心管在1,500 rpm下离心5分钟，并弃去上清液。
12. 将细胞重悬于500 μL PBS和2% FBS中。
13. 将细胞悬液转移并过滤至新的5 mL离心管中，以去除可能干扰分选过程的细胞团块。
14. 向细胞悬液中加入5 μL 7-AAD（使用时稀释1:100），以排除7-AAD⁺死细胞，确保分选群体的活性。
15. 使用BD FACSAria根据以下表型分选细胞：
    • LKS细胞：lin^- c-Kit⁺ Sca-1⁺
    • LT-HSCs：LKS CD34^-
    • ST-HSCs：LKS CD34⁺
    • GMPs：lin^- c-Kit⁺ Sca-1^low FcγR^high CD34⁺
    • MEPs：lin^- c-Kit⁺ Sca-1^low FcγR^low CD34^-
    • CMPs：lin^- c-Kit⁺ Sca-1^low FcγR^low CD34⁺

5. 代表性结果

图1展示了电子门控方法的一个示例，用于鉴定常见的淋巴样祖细胞（CLPs），其表型为 Lin^-/c-Kit^lo/白细胞介素（IL）-7R⁺ 细胞；Lin^-/c-Kit⁺/Sca-1⁺（LKS）细胞和 Lin^-/c-Kit⁺/Sca-1^lo（c-Kit⁺）细胞；从 c-Kit⁺ 门控中，常见的髓系祖细胞（CMPs）被鉴定为 FcγR^loCD34⁺ 细胞，粒细胞/单核细胞祖细胞（GMPs）为 FcγR^hiCD34⁺ 细胞，巨核细胞/红细胞祖细胞（MEPs）为 FcγR^loCD34^- 细胞；从 LKS 门控中，长周期造血干细胞（LT-HSC）和短周期造血干细胞（ST-HSC）分别被鉴定为 CD34^- 和 CD34⁺ 细胞。该骨髓细胞悬液可通过磁珠法富集 c-Kit⁺ 细胞（图2）；随后可根据 CD34 的表达水平分选出 LT-HSC 和 ST-HSC，以及其他具有上述表型的祖细胞。

如图4所示，可通过活体成像共聚焦显微镜分析造血干细胞（HSCs），其中CD34^-细胞使用核酸结合化合物奎纳克林¹¹以及核红色荧光染料DRAQ5进行染色。在HSCs中可见细胞质内存在奎纳克林阳性囊泡，而在粒细胞-单核细胞前体细胞（GMPs）中则不可见¹²。此外，分选后的HSCs可用于功能实验，如图5所示，该图展示了长期造血干细胞（LT-HSC）在暴露于三磷酸腺苷（ATP）和离子霉素后，嘌呤能P2受体被激活，导致胞质内Ca²⁺浓度升高¹²。

图1. Lin- 骨髓细胞的代表性点图分析。通过流式细胞仪进行电子门控，以鉴定和定量骨髓细胞悬液中的造血祖细胞和造血干细胞，细胞染色方法详见实验方案正文。

图 2. 从小鼠骨髓中选择性富集 c-Kit⁺ 细胞的示意图。

图 3. 健康对照组及炎症性肠病（IBD）小鼠中经电子门控的 LKS CD34^- 造血干细胞（HSCs）的细胞周期分析，使用 Ki-67 抗体与 DAPI 染色。细胞经 Lyse/Fix 和 Perm 缓冲液固定和透化处理后，用 FITC 标记的 Ki-67 抗体和 1 μg/ml 的 DAPI 进行染色。在健康对照组的 LKS CD34^- HSCs 群体中，几乎无法检测到处于增殖周期的细胞¹²。

图4. 经FACS分选的CD34^-造血干细胞（HSCs）和粒细胞-单核细胞前体细胞（GMPs）经核酸结合化合物Quinacrine和核红色荧光染料（DRAQ5）染色后的活细胞共聚焦显微成像。右上角的小方框显示在HSCs的细胞质中检测到Quinacrine阳性囊泡，而在GMPs中未观察到。

图 5. 分选后的造血干细胞（HSCs）负载 Fura-2 后，经 ATP 和离子霉素刺激所引发的胞质 Ca²⁺ 升高。图中显示单个细胞的信号轨迹。所有细胞均对细胞外 ATP 产生反应，在加入 ATP 后胞质 Ca²⁺ 显著升高。

讨论

本文所述方法可实现对单只小鼠造血过程的快速且准确的分析（图1）。该方法适用于多种实验条件，包括炎症、自身免疫、免疫缺陷、退行性疾病、代谢紊乱和癌症等小鼠模型，可用于研究病理状态对造血过程的影响。图3展示了通过Ki-67单克隆抗体和DAPI染色，对健康小鼠和炎症性肠病（IBD）小鼠经电子门控分选的LKS CD34^-细胞进行的细胞周期活性分析¹³。结果显示，后者细胞周期S/G₂/M期的细胞比例显著增加。该流式细胞术分析表明，T细胞介导的炎症会影响造血干细胞（HSC）的周期活性¹²。
通过结合磁性标记富集表达c-Kit的骨髓细胞与流式细胞术分选，可获得高度纯化的造血谱系前体细胞和HSCs。所获得的细胞群体可用于多种实验，以研究细胞生物学（图4）、信号转导（图5）、发育调控的基因表达，以及不同细胞亚群的体外（in vitro）和体内（in vivo）功能潜...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	Gibco	42401
MEM NEAA 100X	Gibco	11140
丙酮酸钠	Gibco	11360
青霉素-链霉素（PenStrep）	Gibco	15070
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	20012
胎牛血清（FBS）	Gibco	16000
40 μm 细胞筛	BD Falcon	352340
7-AAD 染色液	BD Pharmingen	559925
裂解/固定缓冲液（Lyse/Fix buffer）	BD Pharmingen	558049
Perm buffer III	BD Pharmingen	558050
Ki-67	BD Pharmingen	556026
DAPI	Invitrogen	D21490
CD4 (GK1.5)	eBioscience	150041
CD8 (53-6.7)	eBioscience	150081
CD3 (145-2C11)	eBioscience	150031
CD45R (RA3-6B2)	eBioscience	150452
CD19 (6D5)	eBioscience	150193
Gr1 (RB6-8C5)	eBioscience	155931
Tre119 (TER-119)	eBioscience	155921
NK-1.1 (PK136)	eBioscience	455941
c-Kit (2B8)	eBioscience	171171
Sca-1 (D7)	eBioscience	135981
CD34 (RAM34)	eBioscience	110341
FcγR (2.4G2)	eBioscience	553145
抗 APC 微珠（Anti-APC MicroBeads）	Miltenyi Biotec	130-090-855
LS 柱（LS Columns）	Miltenyi Biotec	130-042-401