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从人初始T细胞和记忆T细胞诱导生成调节性T细胞

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DOI：

10.3791/3738

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2012年4月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of Kentucky

本文内容

摘要

我们介绍一种从单一人血供体中分离获得调节性T细胞、记忆性T细胞和初始T细胞的方法。在遗传同质性的条件下，可将极化后的调节性T细胞与其他T细胞亚群在多种遗传学和功能学实验中进行比较，其中包括本文详细描述的抑制功能实验。

摘要

免疫抑制性 CD4 细胞的发育与维持+ 调节性T细胞（Tregs）有助于维持外周耐受，以在人体内及体表大量自身抗原和共生抗原存在的情况下保持免疫稳态。Tregs与促炎性常规T细胞之间的平衡失调可能导致免疫病理反应或癌症。尽管在结肠炎小鼠模型中已证明Tregs的治疗性注射具有疗效1 1型糖尿病2 ，类风湿性关节炎和移植物抗宿主病，4 人类与小鼠调节性T细胞生物学的若干根本差异5 迄今为止，这一直限制了其临床应用。治疗性调节性T细胞（Tregs）在数量、纯度、稳定性和归巢特异性方面的不足， necessitated 一个用于优化其发育条件的人源Treg动态研究平台 离体 扩增6.

在此，我们描述了一种从单一人外周血供体诱导调节性T细胞（iTregs）分化的方法，该方法可分为四个阶段：外周血单个核细胞的分离、CD4阳性细胞的磁珠分选、T细胞的激活与扩增，以及iTregs的诱导与鉴定。+ T细胞， 体外 细胞培养与T细胞亚群的荧光激活细胞分选（FACS）。由于调节性T细胞（Treg）特征性转录因子叉头框P3（FoxP3）在人类中是一种由活化诱导的转录因子7 并且不存在其他独特标记物时，必须使用组合标记物 panel 来鉴定具有抑制活性的 T 细胞。经过六天培养后，根据细胞 CD25 和 CD45RA 的相对表达水平，可将本体系中的细胞区分为初始 T 细胞、记忆 T 细胞或诱导性调节性 T 细胞（iTregs）。由于记忆 T 细胞与初始 T 细胞在极化需求和可塑性方面已有不同的研究报道8 ，将初始T细胞群体按CD45RA预先分选+ 和 CD45RO+ 亚群可用于研究这些差异。与他人研究一致，我们的 CD25你好CD45RA- iTregs 高表达 FoxP39 ，GITR 和 CTLA-411 CD127 低表达水平12 经FACS分选各细胞群后，所获得的细胞可用于抑制功能检测，以评估其抑制羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的自体T细胞增殖的相对能力。

方案

1. 从血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞（PBMCs）

  1. 从医院或附近的血库获取一份血沉棕黄层。我们的血库通常为每位正常献血者提供约 40–60 mL 的血沉棕黄层。
  2. 将血液倒入含有无菌 PBS 的已灭菌 500 mL 玻璃瓶中，以稀释血沉棕黄层。PBS 与血沉棕黄层的最终总体积应为 250 mL。
  3. 向十个 50 mL 圆锥形离心管中各加入 20 mL Lymphoprep 溶液。
  4. 小心地将 25 mL 稀释后的血沉棕黄层缓慢铺加在 Lymphoprep 溶液上方，注意不要扰动 Lymphoprep 溶液层。
  5. 在室温下以 500 × g 离心 30 分钟。务必关闭离心机的刹车功能，以免扰动淋巴细胞层。
  6. 用移液器收集位于 Lymphoprep 与血浆-培养基层之间的界面处的外周血单个核细胞（PBMCs）。吸除上层血浆-培养基，直至剩余约 1 mL 覆盖含有 PBMCs 的血沉棕黄层。使用 10 mL 移液器将 PBMCs 转移至新的 50 mL 离心管中。
  7. 用 PBS 洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于 50 mL 冷 RPMI 培养基中，用于血细胞计数板计数。通常可获得 8 × 108 – 1 × 109 个 PBMCs。

该操作可根据较小体积的血液进行相应缩小。全血样本以PBS按1:1比例稀释。

2. 使用 EasySep 富集试剂盒（Stem Cell Technologies）从外周血单个核细胞中磁性阴选总 CD4+ T 细胞、CD4+ CD45RA+ 初始 T 细胞或 CD4+ CD45RO+ 记忆 T 细胞

适用于 1 × 108 至 4.25 × 108 个PBMC的实验步骤。

  1. 用含 2% FBS 和 1 mM EDTA 的 PBS 重悬 PBMC，终浓度为 5 × 107 个/mL。将细胞转移至新的 14 mL 聚丙烯圆底管中。
    1. 通过阴性选择法分离总人源 CD4+ T 细胞：每毫升 PBMC 中加入 50 μL 人 CD4+ T 细胞富集抗体混合物，混匀后室温孵育 10 分钟。
    2. 通过阴性选择法分离人源初始 T 细胞：每毫升 PBMC 悬液中加入 50 μL 抗-CD45RO 抗体，混匀后室温孵育 15 分钟。随后加入试剂盒提供的富集混合液（每毫升 PBMC 50 μL），混匀后室温孵育 10 分钟。
    3. 通过阴性选择法分离人源记忆 T 细胞：每毫升 PBMC 中加入 50 μL 人记忆 CD4+ T 细胞富集抗体混合物，混匀后室温孵育 10 分钟。
  2. 充分混匀磁性颗粒，使其在溶液中均匀分布。切勿对初始 T 细胞试剂盒中的纳米颗粒进行涡旋震荡。
  3. 加入磁性颗粒（总 CD4+ T 细胞和初始 T 细胞分离时为每毫升 PBMC 加 100 μL，记忆 T 细胞分离时为每毫升 PBMC 加 50 μL）。轻轻吹打混匀 2–3 次，室温孵育：初始 T 细胞分离孵育 10 分钟，记忆 T 细胞或总 CD4+ T 细胞分离孵育 5 分钟。
  4. 加入含 2% FBS 和 1 mM EDTA 的 PBS，将每管体积补至 10 mL。轻轻吹打混匀 2–3 次，然后将未加盖的管子放入银色 EasySep 磁铁中，分别放置 5 分钟（总 CD4+ T 细胞）、10 分钟（初始 T 细胞）或 2.5 分钟（记忆 T 细胞）。
  5. 保持试管仍在 EasySep 磁铁中，将上清液倒入新的 50 mL 管中，以分离目标细胞。
  6. 重复步骤 2.5 和 2.6 以提高回收率。

3. 诱导调节性T细胞的细胞培养条件

  1. 在步骤1和步骤2的前一天，通过将抗CD3抗体（OKT3克隆）用无菌PBS稀释至1 μg/mL的浓度来包被组织培养板。对于6孔板，每孔加入2 mL PBS + 抗CD3；对于12孔板，每孔加入1 mL；对于24孔板，每孔加入500 μL。将包被好的板置于4 °C保存，直至使用。
  2. 通过向已预先添加2.06 mM Glutamax-I和25 mM HEPES缓冲液的RPMI-1640培养基中加入10%热灭活胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和50 μM β-巯基乙醇，配制极化培养基。接着，加入2 ng/mL TGF-β和5 ng/mL IL-2。此处可根据需要向培养基中添加感兴趣的配体或抑制剂。将步骤2所得细胞重悬于极化培养基中，浓度为2 × 106 个细胞/mL。
  3. 将包被好的培养板在37 °C预热，然后吸去抗CD3包被孔中的PBS，再加入细胞悬液。对于6孔板，每孔加入4 mL细胞悬液；对于12孔板，每孔加入2 mL；对于24孔板，每孔加入1 mL。空孔中补加PBS以减少培养基蒸发。于37 °C、5% CO2条件下培养3天。
  4. 接种后第3天，将培养板在500 × g离心5分钟。小心吸去上清液一半体积，避免扰动底部的T细胞，并补充等量新鲜培养基。或者，若孔内细胞密度过高（浓度超过3 × 106/mL），可将细胞悬液等分转移至另一块抗CD3包被的培养板中，并补加新鲜培养基至原始体积。继续在37 °C、5% CO2条件下培养2至3天。

4. 三种T细胞群体的荧光激活细胞分选（FACS）

  1. 通过向无菌 PBS 中加入 0.5%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA 制备 FACS 洗涤缓冲液。将缓冲液置于 4 °C 变冷。
  2. 从细胞培养孔中收集细胞，每孔用 2 mL PBS 清洗，以确保细胞完全回收。将所有细胞转移至 50 mL 聚丙烯管中，在 500 x g 条件下离心 10 分钟，温度为 4 °C.
  3. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞密度。
  4. 加入3-5 × 105 每管细胞数置于四个独立的5 mL圆底聚苯乙烯管中，用于补偿对照。将剩余细胞置于50 mL聚丙烯管中，每管不超过35 × 10⁶个细胞6 每管细胞数
  5. 离心细胞5分钟，转速为 4 °C 并吸除培养基。将待分选的细胞重悬于 90 μL 每次使用 1 x 10 的冷洗涤缓冲液6 细胞。重悬于 100 μL 冷洗涤缓冲液的补偿对照管。
  6. 将待分选的细胞混合 2 μL 抗CD25-PE 3 μL 抗-CD45RA-PE-Cy5和 1 μL 每1 × 10个细胞使用抗CD127-APC6 细胞。第一个补偿对照管中不加抗体， 2 μL 向第二个试管中加入抗CD25-PE 3 μL 抗CD45RA-PE-Cy5 加入第三个管中，并1 μL 向第四个管中加入抗CD127-APC。将所有管置于冰上避光孵育45分钟。
  7. 向待分选细胞中加入 10 mL 冷洗涤缓冲液，向补偿对照管中加入 1 mL。将所有细胞在 500 x g 离心 5 分钟，温度为 4 °C.
  8. 吸去缓冲液，将细胞重悬于浓度为 1 x 107 每毫升洗涤缓冲液中的细胞数。加入 1.5 μL 每毫升细胞在过滤前加入 DNase II 40 μM 尼龙细胞滤网。将细胞转移至多个5 mL圆底聚丙烯管中，每管体积不超过3.5 mL。重悬补偿对照细胞于 300 μL 洗涤缓冲液。
  9. 在MoFlo流式细胞仪上设置补偿，以最小化PE、APC和PE-Cy5滤光片的交叉检测。设定门控以分选iTregs（CD25你好CD127-/低CD45RA- 细胞）、初始型（CD25-CD45RA+）和记忆（CD25-CD45RA-) T细胞加入含有1 mL新生小牛血清的5 mL圆底聚苯乙烯管中。

5. 抑制实验

  1. 在 AIM-V 培养基中加入 100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、5 ng/mL IL-2 和 2 ng/mL TGF-β，配制抑制实验培养基。
  2. 实验当天，按照步骤 1 和 2 所述方法从血沉棕黄层中纯化异源性 CD4+ T 细胞。这些细胞将作为抑制实验中的靶细胞，不含 CD25+ Treg 细胞，如图 2中第 0 天所示。
  3. 按照试剂盒说明书对细胞进行 CellTrace 标记，但每毫升细胞仅使用 1 μL 的 5 mM 储存液，而非 2 μL。避光操作，向一支 CFSE 冻干粉中加入 CellTrace 试剂盒提供的 18 μL DMSO，配制成 5 mM 储存液。将所需数量的靶细胞（最多 1 × 107）重悬于预热的 PBS + 0.1% (w/v) BSA 中，终浓度为 1 × 106 个细胞/mL。每毫升细胞加入 1 μL 5 mM CFSE，于 37 °C 水浴中孵育 5 分钟。加入 5 倍体积的含 10% FBS 的冰冻完全 RPMI 培养基以终止染色，并在冰上孵育 5 分钟。用冰冷的完全 RPMI 培养基洗涤细胞两次，最后将 1 × 105 个细胞重悬于 100 μL 抑制实验培养基中。
  4. Treg 抑制检测微珠的储存浓度为 2 × 107 个微珠/mL。根据每次实验所需的总细胞数，通过快速离心收集相应数量的微珠至离心管中。用 RPMI 洗涤微珠一次后再次离心。吸除 RPMI 后，将微珠重悬，使每孔所需的微珠量溶于 8 μL 抑制实验培养基中。
  5. 向 96 孔圆底组织培养板中加入 CFSE 标记的细胞（1 × 105 个细胞/mL）、检测微珠以及极化并分选的细胞（1 × 105 个细胞/mL），使用新鲜的抑制实验培养基，调节至所需的靶细胞（CFSE 标记）:效应细胞（分选细胞）比例，终体积为 200 μL。所有实验条件均设三个重复孔。
  6. 制备第一种对照条件：每孔加入 100 μL CFSE 标记的细胞、8 μL 检测微珠以及 1 × 105 个新鲜未标记的细胞，并用 92 μL 抑制实验培养基补足体积。第二种对照条件的细胞组分与上述相同，但不加入 Treg 检测微珠。
  7. 用铝箔包裹培养板，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育五天。
  8. 避光操作，用移液器收集各孔细胞，转移至 5 mL 圆底聚苯乙烯管中。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，吸除上清，用步骤 4 中的 300 μL 冷 FACS 洗涤缓冲液重悬细胞。使用 Cell Quest 软件分析活淋巴细胞门内代表靶细胞的前 3 × 104 个 CFSE+ 事件的直方图。

6. 代表性结果

在图2中可见基于CD25与FoxP3、CTLA-4及CD45RA相对共表达水平、监测iTreg分化过程的五天流式细胞术伪彩色点图示例。在图3的直方图中显示了一项成功的抑制实验，其中经分选的iTregs（CD25HiCD45RA-CD127-/LOW细胞）是五天培养后唯一获得调节/抑制功能的细胞亚群。图4展示了在标准iTreg培养基中培养五天后，由初始T细胞群（上排图）和记忆T细胞群（下排图）诱导生成Tregs的结果。初始细胞的CFSE染色表明，无论是初始T细胞（右上图）还是记忆T细胞（右下图），均只有在经历多轮细胞分裂后才分化为iTregs（FoxP3表达水平最高的细胞）。

外周血T细胞增殖、分化示意图；流式细胞术、抑制实验的应用。
图1. 实验流程示意图。通过密度梯度离心法从人外周血中分离PBMCs，随后通过磁珠阴性分选获得CD4+CD25- T细胞。细胞培养5至6天后进行流式细胞术分析，并与异源CFSE标记的靶细胞共孵育，以检测其抑制活性。

流式细胞术分析示意图；FoxP3、CTLA-4、CD45RA 表达；按天数显示的诱导性调节性T细胞（iTreg）分化情况。
图 2. 纯化的人原代 CD4+CD25- T 细胞在 iTreg 培养基中培养。在细胞分离后（第 0 天）以及培养第 1、3 和 5 天时分别取样，以监测 CD45RA、FoxP3、CTLA-4 和 CD25 标志物的表达变化。iTreg 表型对应于 CD45RA-、FoxP3Hi、CTLA-4Hi 和 CD25Hi（图中窗口内高亮显示）。

调节性T细胞的流式细胞术图：初始型、记忆型、诱导型调节性T细胞；CFSE染色，数据分析。
图3. 纯化的CD4+ CFSE标记细胞（1 × 105/孔）与分选后的初始型、记忆型或诱导型调节性T细胞（3 × 104/孔）共同培养，并加入Treg suppression inspector beads。培养五天后，收集细胞，通过流式细胞术分析染色细胞的CFSE信号分布。诱导型调节性T细胞的存在完全抑制了CD4+ T细胞的增殖。图中数值表示发生分裂的CFSE标记细胞所占的百分比。

流式细胞术图谱，CD45RA 初始/记忆细胞、iTreg、CD25 与 FoxP3、CFSE 标记分析。
图 4. 纯化的人原代初始性（CD4+CD25-CD45RA+）和记忆性（CD4+CD25-CD45RO+）T 细胞用 CFSE 标记后，在 iTreg 培养基中培养。培养五天后，对细胞进行表型分析并估算细胞分裂速率。如图 2所示，由上述两种细胞群分化而来的 iTreg 亚群表现为 CD45RA-CD25Hi FoxP3Hi 和 CTLA-4Hi（后两者未显示）。通过比较 CFSE 染色图谱可发现，iTreg（此处定义为 FoxP3 表达水平最高的 T 细胞）在五天培养期间具有最强的增殖能力。

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讨论

尽管调节性T细胞（Treg）移植在治疗自身免疫、移植物排斥及其他免疫或炎症介导的疾病方面具有巨大的治疗潜力，但目前尚未建立高效生成和稳定维持Treg的有效方法。由于循环中的人T细胞仅有1-5%为Treg，因此对其扩增和分化的可控性研究克服了这一数量上的不足，解决了Treg临床应用中的主要障碍。另一方面，正如我们从TGN1412试验13中所学到的，在实施任何治疗方案之前，深入理解调控人类T细胞命运决定的分子事件在科学和伦理上都是必要的。通过本iTreg分化方法，可从单一人外周血供体获得初始T细胞、记忆T细胞、效应T细胞及iTreg群体，从而便于在源自同一供体的不同细胞群体之间进行基因表达或功能比较。在我们的实验中，分选后的细胞已被用于微阵列和qRT-PCR分析以检测基因变化，用于Western印迹分析关键信号事件，或用于膜片钳技术功能性地评估离子通道的使用情况14。

我们的系统提供了一个额外优势，即可围绕一个核心框架和读出体系，对分化过程中的关键环节进行调控。因此，可以预先分选外周血单个核细胞（PBMCs）以改变输入的细胞群体，或在培养基...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Jennifer Strange和Greg Bauman在流式细胞术分析与分选方面的协助。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为2P20 RR020171（来自NCRR），以及肯塔基大学为F.M.提供的启动资金；G.I.E.感谢总统研究生奖学金和肯塔基机遇奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LymphoprepAxis-Shield1114547室温保存
冷藏台式离心机Eppendorf5810R
亮线血细胞计数板豪泽科学3110
EasySep 人 CD4+ T细胞富集试剂盒干细胞技术19052
EasySep 人记忆性CD4+ T细胞富集试剂盒 干细胞技术19157
EasySep 人 Naïve CD4+ T细胞富集试剂盒干细胞技术19155
The Big Easy EasySep 磁力架干细胞技术18001银
5 mL 圆底聚苯乙烯管BD 生物科学352008
15 mL 聚丙烯离心管VWR 国际89004-368
14 mL 聚丙烯圆底管BD Biosciences352059
50 mL聚丙烯离心管VWR 国际公司89004-364
人抗CD3抗体Bio X CellBE0001-2克隆：OKT3
24孔细胞培养聚苯乙烯板BD 生物科学353047
96孔圆底组织培养板Greiner Bio-One650180
含Glutamax-I和HEPES缓冲液的RPMI 1640培养基GIBCO，隶属于 Life Technologies72400
胎牛血清（FBS）GIBCO，隶属于 Life Technologies16000
β巯基–乙醇Sigma-AldrichM7522
重组人 TGF-β1eBioscience14-8348-62
重组人 IL-2eBioscience14-8029-63
牛血清白蛋白（BSA）MP Biomedicals810531
0.5 M EDTAAmrescoE177
小鼠抗人 CD25-PEMiltenyi Biotec130-091-024克隆：4E3
小鼠抗人 CD45RA-PE-Cy5eBioscience15-0458-42克隆：HI100
小鼠抗人CD127-APCMiltenyi Biotec130-094-890克隆：MB15-18C9
DNase IIMP Biomedicals190370
MoFlo 流式细胞仪贝克曼库尔特公司
FlowJo 软件Tree Star, Inc.
Cell Quest Pro 软件BD Biosciences
新生牛血清 GIBCO，隶属于 Life Technologies16010
L-谷氨酰胺GIBCO，隶属于 Life Technologies25030
AIM-VGIBCO，隶属于 Life Technologies0870112
CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒InvitrogenC34554
Treg 抑制检测微珠Miltenyi Biotec130-092-909
青霉素-链霉素GIBCO，隶属于 Life Technologies15140
40 μM 尼龙细胞筛BD 生物科学352340

参考文献

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CD4 T T FoxP3 CD25 CD45RA CFSE

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