从人初始T细胞和记忆T细胞诱导生成调节性T细胞

摘要

我们介绍一种从单一人血供体中分离获得调节性T细胞、记忆性T细胞和初始T细胞的方法。在遗传同质性的条件下，可将极化后的调节性T细胞与其他T细胞亚群在多种遗传学和功能学实验中进行比较，其中包括本文详细描述的抑制功能实验。

摘要

免疫抑制性 CD4 细胞的发育与维持⁺ 调节性T细胞（Tregs）有助于维持外周耐受，以在人体内及体表大量自身抗原和共生抗原存在的情况下保持免疫稳态。Tregs与促炎性常规T细胞之间的平衡失调可能导致免疫病理反应或癌症。尽管在结肠炎小鼠模型中已证明Tregs的治疗性注射具有疗效¹ 1型糖尿病² ，类风湿性关节炎和移植物抗宿主病，⁴ 人类与小鼠调节性T细胞生物学的若干根本差异⁵ 迄今为止，这一直限制了其临床应用。治疗性调节性T细胞（Tregs）在数量、纯度、稳定性和归巢特异性方面的不足， necessitated 一个用于优化其发育条件的人源Treg动态研究平台 离体 扩增⁶.

在此，我们描述了一种从单一人外周血供体诱导调节性T细胞（iTregs）分化的方法，该方法可分为四个阶段：外周血单个核细胞的分离、CD4阳性细胞的磁珠分选、T细胞的激活与扩增，以及iTregs的诱导与鉴定。⁺ T细胞， 体外 细胞培养与T细胞亚群的荧光激活细胞分选（FACS）。由于调节性T细胞（Treg）特征性转录因子叉头框P3（FoxP3）在人类中是一种由活化诱导的转录因子⁷ 并且不存在其他独特标记物时，必须使用组合标记物 panel 来鉴定具有抑制活性的 T 细胞。经过六天培养后，根据细胞 CD25 和 CD45RA 的相对表达水平，可将本体系中的细胞区分为初始 T 细胞、记忆 T 细胞或诱导性调节性 T 细胞（iTregs）。由于记忆 T 细胞与初始 T 细胞在极化需求和可塑性方面已有不同的研究报道⁸ ，将初始T细胞群体按CD45RA预先分选⁺ 和 CD45RO⁺ 亚群可用于研究这些差异。与他人研究一致，我们的 CD25^你好CD45RA^- iTregs 高表达 FoxP3⁹ ，GITR 和 CTLA-4¹¹ CD127 低表达水平¹² 经FACS分选各细胞群后，所获得的细胞可用于抑制功能检测，以评估其抑制羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的自体T细胞增殖的相对能力。

方案

1. 从血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞（PBMCs）

1. 从医院或附近的血库获取一份血沉棕黄层。我们的血库通常为每位正常献血者提供约 40–60 mL 的血沉棕黄层。
2. 将血液倒入含有无菌 PBS 的已灭菌 500 mL 玻璃瓶中，以稀释血沉棕黄层。PBS 与血沉棕黄层的最终总体积应为 250 mL。
3. 向十个 50 mL 圆锥形离心管中各加入 20 mL Lymphoprep 溶液。
4. 小心地将 25 mL 稀释后的血沉棕黄层缓慢铺加在 Lymphoprep 溶液上方，注意不要扰动 Lymphoprep 溶液层。
5. 在室温下以 500 × g 离心 30 分钟。务必关闭离心机的刹车功能，以免扰动淋巴细胞层。
6. 用移液器收集位于 Lymphoprep 与血浆-培养基层之间的界面处的外周血单个核细胞（PBMCs）。吸除上层血浆-培养基，直至剩余约 1 mL 覆盖含有 PBMCs 的血沉棕黄层。使用 10 mL 移液器将 PBMCs 转移至新的 50 mL 离心管中。
7. 用 PBS 洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于 50 mL 冷 RPMI 培养基中，用于血细胞计数板计数。通常可获得 8 × 10⁸ – 1 × 10⁹ 个 PBMCs。

该操作可根据较小体积的血液进行相应缩小。全血样本以PBS按....

讨论

尽管调节性T细胞（Treg）移植在治疗自身免疫、移植物排斥及其他免疫或炎症介导的疾病方面具有巨大的治疗潜力，但目前尚未建立高效生成和稳定维持Treg的有效方法。由于循环中的人T细胞仅有1-5%为Treg，因此对其扩增和分化的可控性研究克服了这一数量上的不足，解决了Treg临床应用中的主要障碍。另一方面，正如我们从TGN1412试验¹³中所学到的，在实施任何治疗方案之前，深入理解调控人类T细胞命运决定的分子事件在科学和伦理上都是必要的。通过本iTreg分化方法，可从单一人外周血供体获得初始T细胞、记忆T细胞、效应T细胞及iTreg群体，从而便于在源自同一供体的不同细胞群体之间进行基因表达或功能比较。在我们的实验中，分选后的细胞已被用于微阵列和qRT-PCR分析以检测基因变化，用于Western印迹分析关键信号事件，或用于膜片钳技术功能性地评估离子通道的使用情况¹⁴。

我们的系统提供了一个额外优势，即可围绕一个核心框架和读出体系，对分化过程中的关键环节进行调控。因此，可以预先分选外周血单个核细胞（PBMCs）以改变输入的细胞群体，或在培养基.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Lymphoprep	Axis-Shield	1114547	室温保存
冷藏台式离心机	Eppendorf	5810R
亮线血细胞计数板	豪泽科学	3110
EasySep 人 CD4+ T细胞富集试剂盒	干细胞技术	19052
EasySep 人记忆性CD4+ T细胞富集试剂盒	干细胞技术	19157
EasySep 人 Naïve CD4+ T细胞富集试剂盒	干细胞技术	19155
The Big Easy EasySep 磁力架	干细胞技术	18001	银
5 mL 圆底聚苯乙烯管	BD 生物科学	352008
15 mL 聚丙烯离心管	VWR 国际	89004-368
14 mL 聚丙烯圆底管	BD Biosciences	352059
50 mL聚丙烯离心管	VWR 国际公司	89004-364
人抗CD3抗体	Bio X Cell	BE0001-2	克隆：OKT3
24孔细胞培养聚苯乙烯板	BD 生物科学	353047
96孔圆底组织培养板	Greiner Bio-One	650180
含Glutamax-I和HEPES缓冲液的RPMI 1640培养基	GIBCO，隶属于 Life Technologies	72400
胎牛血清（FBS）	GIBCO，隶属于 Life Technologies	16000
β巯基–乙醇	Sigma-Aldrich	M7522
重组人 TGF-β1	eBioscience	14-8348-62
重组人 IL-2	eBioscience	14-8029-63
牛血清白蛋白（BSA）	MP Biomedicals	810531
0.5 M EDTA	Amresco	E177
小鼠抗人 CD25-PE	Miltenyi Biotec	130-091-024	克隆：4E3
小鼠抗人 CD45RA-PE-Cy5	eBioscience	15-0458-42	克隆：HI100
小鼠抗人CD127-APC	Miltenyi Biotec	130-094-890	克隆：MB15-18C9
DNase II	MP Biomedicals	190370
MoFlo 流式细胞仪	贝克曼库尔特公司
FlowJo 软件	Tree Star, Inc.
Cell Quest Pro 软件	BD Biosciences
新生牛血清	GIBCO，隶属于 Life Technologies	16010
L-谷氨酰胺	GIBCO，隶属于 Life Technologies	25030
AIM-V	GIBCO，隶属于 Life Technologies	0870112
CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒	Invitrogen	C34554
Treg 抑制检测微珠	Miltenyi Biotec	130-092-909
青霉素-链霉素	GIBCO，隶属于 Life Technologies	15140
40 μM 尼龙细胞筛	BD 生物科学	352340