冠状血管的可视化对于深入理解心血管疾病至关重要。本文介绍一种通过不透射线的硅橡胶（Microfil）灌注小鼠冠状血管的方法，以为微型计算机断层扫描（μCT）成像做好准备。
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本文内容
摘要
摘要
对血管系统的可视化在理解多种疾病状态方面正变得越来越重要。尽管目前已存在多种血管成像技术，但很少有方法能够在涵盖整个血管网络的同时，达到足以显示微小血管的分辨率1,2。此外，许多血管铸型技术会破坏周围组织，从而阻碍对样本的进一步分析3-5。一种可避免上述问题的方法是显微计算机断层扫描（μCT）。μCT成像的分辨率可达<10 微米，能够生成血管网络的三维重建图像，并且可保持组织完整，以便后续分析（如组织学和形态计量学）6-11。然而，通过离体（ex vivo）μCT方法对血管进行成像，需要将血管内填充一种不透射线的化合物。因此，μCT成像所获得的血管结构的准确表征，依赖于血管内填充的可靠性和完整性。在本实验方案中，我们描述了一种用于填充小鼠冠状血管以备进行μCT成像的技术。
目前存在两种主要技术用于灌注冠状血管系统：一种是通过插管逆行灌注主动脉（或主动脉弓的分支）实现的体内灌注方法12-14，另一种是通过离体Langendorff灌注系统实现的体外灌注方法15-17。本文介绍一种专为确保所有血管充分灌注而设计的体内主动脉插管技术。我们使用一种低黏度的放射显影剂Microfil，该化合物可渗透至最细小的血管，从而完整填充毛细血管以及血管网络中的动脉和静脉部分。首先采用加压灌注系统以缓冲液灌注血管，随后灌入Microfil。为确保Microfil能够进入阻力较高的细小血管，我们结扎从主动脉发出的主要大分支，以引导Microfil流入冠状动脉。灌注完成后，为防止心脏组织的弹性回缩将Microfil从部分血管中挤出，需立即结扎可及的主要血管出口。因此，本技术经过优化，可实现灌注剂的完全填充与最大程度的保留，从而能够清晰显示完整的冠状血管网络——包括动脉、毛细血管和静脉。
方案
1. 开始前的准备工作
- 分别用血管扩张缓冲液（PBS 中含 4mg/L 罂粟碱和 1g/L 腺苷）或含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 填充压力灌注装置的两侧。
- 准备一支 1/2 cc 胰岛素注射器（带固定 29G ½" 针头），吸入 0.1 ml 1:100 肝素溶液（5000U/ml 原液），并将针头弯曲至约 120 度角，针尖斜面朝上。同样操作一支 1 ml 注射器（带 26G ½" 针头），吸入 0.3 ml 饱和 KCl 溶液。
2. 暴露心脏并插管主动脉
- 使用您选择的麻醉剂对小鼠进行麻醉。（我们采用过量的氯胺酮/赛拉嗪混合物：按130 mg/kg氯胺酮和8.8 mg/kg赛拉嗪的剂量，经腹腔注射生理盐水溶液。）
- 将麻醉后的小鼠仰卧位固定于解剖托盘上。沿腹中线做切口打开腹腔，并将皮肤向两侧牵拉以暴露器官。将肠管移至一侧，暴露后腔静脉（PVC）区域。
- 向后腔静脉（PVC）内注射肝素溶液。拔出针头时，用棉签轻压针孔以防止渗漏，并保持数秒，直至静脉壁形成血凝块并封闭穿刺点。等待2–3分钟，使肝素在小鼠全身循环中充分扩散。
- 解剖膈肌和肋骨，以便观察跳动的心脏。通过后腔静脉缓慢注射KCl溶液，直至心脏停止跳动。
- 移除膈肌以下的所有器官，并切除小鼠后部组织，保留膈肌前方区域完整。去除....
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讨论
心脏组织具有极高的代谢需求，因此需要冠状血管持续提供血液中的营养物质和氧气。冠状血管疾病会因血管狭窄和阻塞导致冠状循环功能下降，从而引起组织缺氧和缺血，使患者面临心肌梗死以及心肌不可逆损伤的风险。深入了解这些血管的病变状态十分必要，而研究冠状血管的关键在于对血管系统的可视化。本文介绍一种用于制备小鼠冠状血管以进行 离体 通过向血管系统注入造影剂进行成像。本方案专门设计用于确保所有冠状血管（包括毛细血管）的充分充填，从而实现完整显影。
为确保所有毛细血管完全充填，必须将填充剂Microfil注入一个部分封闭的系统中，以迫使Microfil进入血管网络中更细小、阻力更高的血管。为在我们的系统中实现这种部分封闭， 体内 灌注系统，我们结扎主动脉弓发出的三条较粗大且阻力较低的动脉。尽管这并不能完全排除所有其他潜在的“渗漏”部位，但其余血管（主要是肋间动脉）管径足够小，由此造成的压力损失不会影响冠状血管系统的充分灌注。当Microfil完全灌注心脏内所有血管后，心肌和血管组织固有的弹性会将部分Microfil从血管中挤压排出。为防止Microfil流失，.......
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披露
小鼠的处理方法经华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准，并遵循 实验动物护理指南 美国国立卫生研究院（NIH出版物编号85-23，1996年修订版）发布的《实验动物的照护与使用指南》。
致谢
感谢 Kelly Stevens 博士对本方案的初步试验，感谢 Michael Simons 博士、Kip Hauch 博士以及他们两个实验室的成员提供的总体讨论。
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 HL087513 和 P01 HL094374。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 ml 注射器 |  BD Biosciences | BD-309602 | |
| 1/2cc 胰岛素注射器，带永久连接的 29G ½’ 针头 | BD Biosciences | BD-309306 | |
| 2" x 2" 纱布垫 | Med101store.com | SKU 2208 | |
| 24G ¾" Angiocath 静脉导管 | BD Biosciences | BD-381112 | |
| 26G ½" 规格针头 | BD Biosciences | BD-305111 | |
| 腺苷 | Sigma-Aldrich | A9251 | 在 PBS 中配制成 1 g/L，用于血管扩张缓冲液（含罂粟碱） |
| 斜角 Graefe 镊 | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| 棉签：6" 非无菌 | Cardinal Health | C15055-006 | |
| 弯头手术剪 | Fine Science Tools | 14085-09 | |
| 解剖显微镜及光源 | Nikon Instruments | NA | NA |
| 解剖托盘，11.5 x 7.5 英寸 | Cole-Parmer | YO-10915-12 | 填充焦油，用于固定小鼠 |
| 精细弯头镊 | Aesculap | FD281R | 需准备两把 |
| 肝素，5000 U/ml 储存液 | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | 以水稀释 1:100 |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | 在 H₂O 中配制成饱和溶液 |
| 氯胺酮（Ketaset），100 mg/ml 储存液 | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | 与赛拉嗪在 0.9% 生理盐水中混合，剂量为 130 mg/kg 体重 |
| Microfil | FlowTech | MV-122（黄色），也可提供其他颜色选项 | 按重量 1:1 混合，并加入 10% 体积的固化剂。注射前现配，并涡旋混匀以确保充分混合 |
| 非无菌缝合线：6-0，编织丝线 | Harvard Apparatus | 723287 | |
| 罂粟碱 | American Regent Inc. | NDC 0517-4010-01 | 在 PBS 中配制成 4 mg/L，用于血管扩张缓冲液（含腺苷） |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | 配制成 4% 溶液 |
| 灌注装置 | 见图 2 | ||
| 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| 赛拉嗪（Anased），20 mg/ml 储存液 | Lloyd, Inc. | NADA #139-236 | 与氯胺酮在 0.9% 生理盐水中混合，剂量为 8.8 mg/kg 体重 |
参考文献
- Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease.
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重印与许可
