小鼠冠状血管逆行灌注与充填作为显微计算机断层扫描成像的制备方法

摘要

冠状血管的可视化对于深入理解心血管疾病至关重要。本文介绍一种通过不透射线的硅橡胶（Microfil）灌注小鼠冠状血管的方法，以为微型计算机断层扫描（μCT）成像做好准备。

摘要

对血管系统的可视化在理解多种疾病状态方面正变得越来越重要。尽管目前已存在多种血管成像技术，但很少有方法能够在涵盖整个血管网络的同时，达到足以显示微小血管的分辨率^1,2。此外，许多血管铸型技术会破坏周围组织，从而阻碍对样本的进一步分析^3-5。一种可避免上述问题的方法是显微计算机断层扫描（μCT）。μCT成像的分辨率可达<10 微米，能够生成血管网络的三维重建图像，并且可保持组织完整，以便后续分析（如组织学和形态计量学）^6-11。然而，通过离体（ex vivo）μCT方法对血管进行成像，需要将血管内填充一种不透射线的化合物。因此，μCT成像所获得的血管结构的准确表征，依赖于血管内填充的可靠性和完整性。在本实验方案中，我们描述了一种用于填充小鼠冠状血管以备进行μCT成像的技术。

目前存在两种主要技术用于灌注冠状血管系统：一种是通过插管逆行灌注主动脉（或主动脉弓的分支）实现的体内灌注方法^12-14，另一种是通过离体Langendorff灌注系统实现的体外灌注方法^15-17。本文介绍一种专为确保所有血管充分灌注而设计的体内主动脉插管技术。我们使用一种低黏度的放射显影剂Microfil，该化合物可渗透至最细小的血管，从而完整填充毛细血管以及血管网络中的动脉和静脉部分。首先采用加压灌注系统以缓冲液灌注血管，随后灌入Microfil。为确保Microfil能够进入阻力较高的细小血管，我们结扎从主动脉发出的主要大分支，以引导Microfil流入冠状动脉。灌注完成后，为防止心脏组织的弹性回缩将Microfil从部分血管中挤出，需立即结扎可及的主要血管出口。因此，本技术经过优化，可实现灌注剂的完全填充与最大程度的保留，从而能够清晰显示完整的冠状血管网络——包括动脉、毛细血管和静脉。

方案

1. 开始前的准备工作

1. 分别用血管扩张缓冲液（PBS 中含 4mg/L 罂粟碱和 1g/L 腺苷）或含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 填充压力灌注装置的两侧。
2. 准备一支 1/2 cc 胰岛素注射器（带固定 29G ½" 针头），吸入 0.1 ml 1:100 肝素溶液（5000U/ml 原液），并将针头弯曲至约 120 度角，针尖斜面朝上。同样操作一支 1 ml 注射器（带 26G ½" 针头），吸入 0.3 ml 饱和 KCl 溶液。

2. 暴露心脏并插管主动脉

1. 使用您选择的麻醉剂对小鼠进行麻醉。（我们采用过量的氯胺酮/赛拉嗪混合物：按130 mg/kg氯胺酮和8.8 mg/kg赛拉嗪的剂量，经腹腔注射生理盐水溶液。）
2. 将麻醉后的小鼠仰卧位固定于解剖托盘上。沿腹中线做切口打开腹腔，并将皮肤向两侧牵拉以暴露器官。将肠管移至一侧，暴露后腔静脉（PVC）区域。
3. 向后腔静脉（PVC）内注射肝素溶液。拔出针头时，用棉签轻压针孔以防止渗漏，并保持数秒，直至静脉壁形成血凝块并封闭穿刺点。等待2–3分钟，使肝素在小鼠全身循环中充分扩散。
4. 解剖膈肌和肋骨，以便观察跳动的心脏。通过后腔静脉缓慢注射KCl溶液，直至心脏停止跳动。
5. 移除膈肌以下的所有器官，并切除小鼠后部组织，保留膈肌前方区域完整。去除膈肌时需小心操作，在靠近膈肌处切断后腔静脉，以便在后续步骤中易于定位靠近心脏的静脉段。
6. 找到主动脉的切断端。取一段较长的6-0编织丝线缝合线，从主动脉切断端前方数毫米处穿过其下方，并使缝线对折。将此长缝线从中剪断，使主动脉下方保留两段缝线。将套管针插入主动脉的切断端（图1A、B），然后分别用双结扎紧两根缝线，以固定套管针位置，并防止主动脉内产生逆向压力导致液体渗漏。

3. 灌注与Microfil注射

1. 将套管针连接至压力灌注装置（图2），并通过将灌注装置加压至100–110 mmHg，开始用血管扩张缓冲液灌注血管（图1C）。通过确认液体从上腔静脉（PVC）流出，仔细检查缓冲液是否已流经冠状动脉。持续灌注至少3分钟，或直至从PVC流出的液体变澄清为止。（在灌注的同时继续进行后续步骤。）
2. 解剖肋骨并将肋骨固定向后（或移除）以暴露心脏。暴露后，注意避免心脏干燥，可将缓冲液滴加到心脏表面，使用浸有缓冲液的纱布轻轻挤压滴液。清除胸腺以暴露主动脉弓。使用6-0编织丝线结扎主动脉的三个主要分支，以确保液体流向冠状动脉，而非通过这些较大且阻力较低的血管（图1D）。
3. 用固定剂灌注心脏15分钟，然后用血管扩张缓冲液冲洗至少2分钟。同时，结扎两条前腔静脉，以防止注射Microfil后其从心脏泄漏（图1E）。在上腔静脉（PVC）和主动脉周围预先放置缝线，但在填充完成前不要收紧。
4. 按照试剂表中的说明配制Microfil，并将其装入1 ml注射器中。在解剖托盘中加入足量的水，以浸没导管（以便在从灌注管路切换至Microfil注射器时防止气泡进入）。断开灌注装置与导管的连接，接上已准备好的Microfil注射器。
5. 将Microfil注入主动脉，直至冠状动脉充分充填（图1F，图3A）：动脉首先被充填，随后Microfil会“溢出”至毛细血管，使组织呈现Microfil的颜色。当进入静脉侧时，由于Microfil具有疏水性，其最初会以独立小球状形式从小血管中渗出。继续注射Microfil，直至静脉内形成连续的液柱。当血管内Microfil连续不断，并从PVC处持续流出时，表明充填完成。
6. 充填完成后，迅速收紧先前放置在PVC和主动脉周围的缝线，以防止因心肌组织的弹性作用将Microfil从血管中挤出。
7. 用湿润的纱布（浸有解剖托盘中的水）覆盖心脏，防止其干燥，并在室温下静置约1小时，直至Microfil完全聚合。在聚合过程中应避免对心脏施加任何外部压力，例如提起或翻转心脏以提前观察心脏背面的充填血管，这可能导致Microfil从某些血管被挤压至心脏更具弹性的区域，从而造成Microfil断裂。
8. 取出心脏，在4%多聚甲醛（PFA）中后固定过夜（4°C）。随后在70%乙醇中4°C保存。此时心脏血管系统已准备好进行μCT成像。

4. 典型结果

能够被Microfil有效灌注的血管，其内部将充满连续且无中断的Microfil（图3A）。冠状血管的充填程度可通过肉眼判断；静脉位于心外膜层¹⁸，易于观察（图3A，箭头所示）；动脉则多位于心肌内部¹⁸，但也可透过心脏表面清晰可见（图3A，箭头所示）。毛细血管的充填也十分明显，由于心肌组织中毛细血管密度极高，当毛细血管被充填时，心肌组织会呈现出Microfil的颜色（图3A，星号所示）。因此，未能充填的血管网络将因缺乏Microfil而清晰可辨（图3B、C）。

Microfil 中的不连续区域（图 3B 中的星号）经常出现，这是因为 Microfil 具有疏水性，会使其自身收缩，从而导致灌注血管内出现“断裂”。如果通过妥善结扎心脏血管出口来维持血管内的压力，则可减少这些“断裂”。其他不连续区域可能由 Microfil 内的气泡引起。为防止引入空气，在将灌注装置切换至 Microfil 注射器时，应确保套管针完全浸没在水中。如果引入了气泡，通常只需继续进行 Microfil 灌注，直至气泡被推过并排出冠状血管即可将其去除。

如果部分血管床被阻塞，血管网络可能无法完全充盈（图3B，箭头所示）。尽管肝素可抑制血栓形成，但由于灌注操作开始前肝素灌注不充分或其他未知因素，偶尔仍可能发生阻塞。据我们所知，一旦发生阻塞，目前尚无方法可清除阻塞以完成血管充盈。如果充盈过程中使用压力过低，也可能导致充盈不完全，因为Microfil无法被压入所有血管床和毛细血管网络中（图3C）。相反，压力过高则可能导致毛细血管破裂，使Microfil渗漏至周围组织中（图3D）。

图1. Microfil灌注方案概览。（A）在膈肌水平附近切断主动脉和下腔静脉（PVC）。（B）使用套管插入升主动脉。（C）通过压力灌注装置（图中未显示）将血管扩张缓冲液灌注至血管中，同时（D）结扎主动脉弓的三个主要分支。（E）将4% PFA灌注至冠状动脉，同时结扎两条前腔静脉。（F）使用注射器将Microfil灌注至冠状动脉，直至观察到其从下腔静脉（PVC）流出。

图 2. 灌注装置。 两个锥形瓶分别装有血管舒张缓冲液或 4% 多聚甲醛（PFA），通过侧臂连接的管道连接并加压。系统通过手动挤压橡胶球进行加压，其中一个锥形瓶连接压力表，以便监测和维持压力。细管穿过橡胶塞并伸入每个锥形瓶的液体中。来自侧臂的压力将液体从每个锥形瓶经由这些细管泵出。细管随后汇入一个止流阀，该阀仅允许来自一个锥形瓶的液体流动。

图3. Microfil灌注的心脏样本。（A）灌注良好的血管中Microfil连续完整，几乎无中断（或完全没有），且由于毛细血管已被填充，心肌组织染上了Microfil的颜色（星号所示，与C图比较）。通过心脏表面可清晰观察到动脉（箭头——左前降支动脉）和静脉（箭头头——左冠状静脉）。（B）心脏血管中存在Microfil中断（星号所示）以及部分血管阻塞，导致Microfil未能完全渗透。这些阻塞的血管仍呈红色（箭头），表明灌流过程中血液未被充分冲洗干净。（C）血管灌注不完全的心脏。注意组织未呈现Microfil的黄色，表明Microfil未进入毛细血管。（D）在灌注过程中毛细血管破裂，导致Microfil渗漏至周围组织的心脏（箭头所示）。

讨论

心脏组织具有极高的代谢需求，因此需要冠状血管持续提供血液中的营养物质和氧气。冠状血管疾病会因血管狭窄和阻塞导致冠状循环功能下降，从而引起组织缺氧和缺血，使患者面临心肌梗死以及心肌不可逆损伤的风险。深入了解这些血管的病变状态十分必要，而研究冠状血管的关键在于对血管系统的可视化。本文介绍一种用于制备小鼠冠状血管以进行 离体 通过向血管系统注入造影剂进行成像。本方案专门设计用于确保所有冠状血管（包括毛细血管）的充分充填，从而实现完整显影。

为确保所有毛细血管完全充填，必须将填充剂Microfil注入一个部分封闭的系统中，以迫使Microfil进入血管网络中更细小、阻力更高的血管。为在我们的系统中实现这种部分封闭， 体内 灌注系统，我们结扎主动脉弓发出的三条较粗大且阻力较低的动脉。尽管这并不能完全排除所有其他潜在的“渗漏”部位，但其余血管（主要是肋间动脉）管径足够小，由此造成的压力损失不会影响冠状血管系统的充分灌注。当Microfil完全灌注心脏内所有血管后，心肌和血管组织固有的弹性会将部分Microfil从血管中挤压排出。为防止Microfil流失，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 ml 注射器	BD Biosciences	BD-309602
1/2cc 胰岛素注射器，带永久连接的 29G ½’ 针头	BD Biosciences	BD-309306
2" x 2" 纱布垫	Med101store.com	SKU 2208
24G ¾" Angiocath 静脉导管	BD Biosciences	BD-381112
26G ½" 规格针头	BD Biosciences	BD-305111
腺苷	Sigma-Aldrich	A9251	在 PBS 中配制成 1 g/L，用于血管扩张缓冲液（含罂粟碱）
斜角 Graefe 镊	Fine Science Tools	11052-10
棉签：6" 非无菌	Cardinal Health	C15055-006
弯头手术剪	Fine Science Tools	14085-09
解剖显微镜及光源	Nikon Instruments	NA	NA
解剖托盘，11.5 x 7.5 英寸	Cole-Parmer	YO-10915-12	填充焦油，用于固定小鼠
精细弯头镊	Aesculap	FD281R	需准备两把
肝素，5000 U/ml 储存液	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-047-10	以水稀释 1:100
KCl	Fisher Scientific	P217	在 H₂O 中配制成饱和溶液
氯胺酮（Ketaset），100 mg/ml 储存液	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	与赛拉嗪在 0.9% 生理盐水中混合，剂量为 130 mg/kg 体重
Microfil	FlowTech	MV-122（黄色），也可提供其他颜色选项	按重量 1:1 混合，并加入 10% 体积的固化剂。注射前现配，并涡旋混匀以确保充分混合
非无菌缝合线：6-0，编织丝线	Harvard Apparatus	723287
罂粟碱	American Regent Inc.	NDC 0517-4010-01	在 PBS 中配制成 4 mg/L，用于血管扩张缓冲液（含腺苷）
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	配制成 4% 溶液
灌注装置			见图 2
弹簧剪	Fine Science Tools	15018-10
赛拉嗪（Anased），20 mg/ml 储存液	Lloyd, Inc.	NADA #139-236	与氯胺酮在 0.9% 生理盐水中混合，剂量为 8.8 mg/kg 体重