本报告介绍了利用活细胞成像和光漂白技术，研究在神经元质膜上外源性表达的、pH敏感型GFP标记蛋白的表面表达、转运途径及运输动力学。
本文内容
摘要
摘要
受体和离子通道等膜蛋白在神经元中经历活跃的转运过程，而神经元具有高度极性和复杂的形态结构。这种定向转运对于突触蛋白的递送、维持或清除具有根本性的重要意义。
超灵敏pHluorin（SEP）是一种对pH敏感的eGFP衍生物，已被广泛用于细胞膜蛋白的活细胞成像1-2。在低pH条件下，SEP发生质子化，导致光子吸收减少并消除荧光发射。由于大多数细胞内运输事件发生在低pH的细胞器中，在这些区域SEP的荧光被抑制，因此SEP标记蛋白的荧光信号主要来自细胞膜表面，此处SEP暴露于中性的细胞外环境。当受到高强度光照时，SEP与所有荧光染料一样会发生不可逆的光损伤（光漂白）3-5。重要的是，由于低pH会抑制光子吸收，只有位于细胞表面的SEP可被光漂白，而细胞内的SEP则不受高强度光照的影响6-10。
对带有SEP标签的蛋白质进行FRAP（光漂白后荧光恢复）是一种方便且强大的技术，可用于评估质膜上蛋白质的动态变化。当在特定兴趣区域（ROI）对荧光标记的蛋白质进行光漂白后，荧光的恢复是由于未被漂白的SEP标记蛋白质移动进入漂白区域所致。这种移动可通过侧向扩散和/或通过胞吐作用实现，后者所用的未光漂白受体可来源于de novo合成或循环再利用（见图1）。可在基础状态或刺激条件下（如施加激动剂或神经元激活刺激物NMDA或KCl8,10）测定不可移动蛋白与可移动蛋白的比例，并进一步研究可扩散组分的移动性和动力学特征。
我们描述了旨在选择性地观察与胞吐作用相关的荧光恢复的光漂白技术。简而言之，首先对一个感兴趣区域（ROI）进行一次光漂白，类似于标准的FRAP实验方案，经过短暂恢复后，再对两侧邻近区域进行重复漂白。该“FRAP-FLIP”方案由本实验室开发，已用于表征树突棘中AMPA受体的转运过程10，并可广泛应用于多种转运研究，以评估细胞内转运和胞吐作用。
方案
1. 细胞培养、病毒转导与蛋白质表达
- 在聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上培养胚胎18天（E18）大鼠仔鼠的高密度海马神经元14至25天 体外 （体外培养天数）
- 在进行活体实验前6-24小时，用携带目的膜蛋白并标记有超 ecliptic pHluorin（SEP）的减毒辛德毕斯病毒转导细胞。
- 将含有假病毒颗粒的培养基直接加入含有1 mL条件培养基的盖玻片中，然后放回培养箱继续培养。病毒转导后蛋白表达的滴度和时间会因病毒批次不同而有所差异，应在开展活细胞实验前针对每一批次病毒确定其最佳条件。
2. FRAP-FLIP 活细胞成像
- 仪器设备设置
- 将盖玻片转移至蔡司Axiovert LSM 510 META共聚焦显微镜的成像腔室。为尽量减少成像过程中的功率波动，应在成像前至少20分钟开启显微镜，并将激光输出调至100%。
- 立即用预热的培养基替换原培养基（37 °C细胞外记录液，含140 mM NaCl、5 mM KCl、15 mM葡萄糖、1.5 mM CaCl₂2，1.5 mM MgCl2，20-25 mM HEPES（用NaOH调节pH至7.4），并将培养室置于预热的载物台上（37 °C蔡司Axiovert的)
确保细胞外记录液的渗透压调节至与培养基相差10 mOsM以内。若实验过程中未发生显著蒸发，则此条件可维持稳定。2 独立溶液适用于短时间实验（<10 小时）。建议补充 1–2 mM 碳酸氢钠。
- 定义成像采集参数
- 首先，确定表达目标重组蛋白的神经元，并将其调至清晰对焦。
- 使用63倍油镜，采用488 nm激光在低激光功率下对整个细胞进行成像。为最大限度减少光漂白，应使用较快的扫描速度（7-9）和较低的像素分辨率（512×512），并保持总体扫描速度 <1 秒。
- 选择一段树突进行成像，并放大以获取包含感兴趣区域（ROI）的图像帧（约1.5–2.5倍光学放大）。在条件允许的情况下，确保视野中包含多个突起结构，以便从参考树突获取测量数据，从而判断成像过程中是否发生由采集引起的非特异性光漂白。
- 调整滤光片、针孔、扫描速度和探测器增益，以在最小激光激发下获得最强荧光信号，同时避免过度饱和。建议采用较大的针孔直径，以最大化光子收集效率。2μm 适用于脊柱和三级树突）。探测器增益应足够强，以检测到微小的荧光增加，使得光漂白前最初的图像中，饱和像素不超过10%。
- 将此配置保存，用于实验的漂白前/漂白后及恢复阶段。
- 接下来定义光漂白区域；选择一个ROI作为初始光漂白区域，并在其两侧设置相邻区域用于后续的重复光漂白阶段。确保相邻区域足够宽，以防止扫描间因扩散导致的信号恢复（通常 5 μm，见图2。
- 调整两个光漂白ROI的漂白参数。初始光漂白应快速完成（0.1–0.5秒），需进行1–5次迭代，具体次数取决于光学缩放倍数和ROI的体积。对于侧翼区域，应调节激光激发强度，以确保对侧翼区域持续进行光漂白，同时避免光毒性损伤。
- 作为指导原则，我们使用100%的激光激发进行初始光漂白，使用10%的激光激发进行重复光漂白阶段。
- 图像采集
- 所有参数设置完成后，按照下方所示的4个步骤，以可变时间间隔图像序列的方式进行FRAP-FLIP实验：
区块1：3-10次预漂白基线图像，使用低激光功率，无时间延迟
第二步：以全激光功率对中央 ROI 进行 1-5 次漂白
第三部分：光漂白后3-10次恢复图像采集
第4步：使用中等激光功率对侧翼区域进行重复漂白，同时以1-5秒的典型时间间隔采集图像，具体间隔取决于所研究蛋白的恢复速率。 - 最后，将细胞外记录液更换为pH6缓冲的记录液，其中含有140 mM NaCl、5 mM KCl、15 mM葡萄糖、1.5 mM CaCl₂2，1.5 mM MgCl2，20–25 mM MES（用于淬灭荧光）或补充含90 mM NaCl、5 mM KCl、15 mM葡萄糖、1.8 mM CaCl₂的50 mM NH₄Cl2，0.8 mM MgCl2，20-25 mM HEPES，pH 7.4（用于揭示低pH值细胞内储存中的蛋白质），（见图2）。
- 为每种重组蛋白至少收集10至20组数据，以进行统计分析。为避免结果偏差，需确保各重复实验间的成像条件保持一致。若观察到不完全漂白、明显的焦平面漂移或光毒性细胞损伤，则应舍弃相应数据集。
- 所有参数设置完成后，按照下方所示的4个步骤，以可变时间间隔图像序列的方式进行FRAP-FLIP实验：
3. 数据分析
- 使用 ImageJ 软件打开图像。
- 利用 Stackreg 插件对图像序列进行对齐，以校正时间序列过程中可能发生的 xy 平面微小波动（插件 → stackreg → 变换方式：刚体 → <确定>）。
- 对于在 Zeiss 共聚焦显微镜上采集的图像，使用 LSM Toolbox 插件将时间值导出为文本文件（插件 → LSM Toolbox → 显示 LSM Toolbox → <应用标记> → <应用时间标记>），并将这些值导入分析电子表格中。
- 为测量 FRAP-FLIP 实验期间的荧光波动，将光漂白区域划分为若干个单独的像素区域（约 20 像素），并在每个时间点测量这些感兴趣区域（ROI）的平均荧光强度（F）。为快速获取这些数值，可使用 ImageJ 的“ROI 管理器”分析工具（分析 → 工具 → ROI 管理器）选择多个 ROI，并通过“绘制 Z 轴轮廓”命令（图像 → 图像栈 → 绘制 Z 轴轮廓）报告每个像素的平均荧光强度。
- 重复此步骤，测量背景非荧光区域的荧光强度。
- 通过减去背景值对每个时间点的荧光强度进行归一化处理，以消除实验噪声，并将所有数值除以光漂白前基线测量值的平均值。
- 测量相邻未光漂白树突的荧光强度，以评估采集过程中非特异性光漂白的程度。不建议对“FRAP-FLIP”数据进行非特异性光漂白校正，应尽可能避免此类校正。
- 为计算某个 ROI 内是否发生了显著性恢复，用序列最后 5–10 个测量值的平均值减去最初 5–10 个测量值的平均值（ΔF），并确定其统计学显著性。根据恢复与非恢复的 ROI 分类，评估胞吐作用的模式（例如，胞吐热点或树突棘与主干的恢复差异）。
4. 典型结果
典型的FRAP-FLIP实验结果如图2所示。此处，表达AMPA型谷氨酸受体GluA2亚基并标记有SEP的神经元，其树突的某一区域被选择性地进行了光漂白。图2.A展示了成像的树突区域，并标示了用于光漂白的选中ROI（白色方框区域）。较大的白色方框区域被漂白一次后，接着对两侧相邻的方框区域进行重复漂白，这些区域以双头蓝色箭头标出。红色箭头指示的是测量用的ROI，在下方图中以高倍放大显示。
图2B显示了实验过程中所测ROI内荧光强度随时间的变化。在此示例中，初始光漂白后记录了一分钟的恢复期，以允许未漂白的受体通过侧向扩散进入ROI。当两侧区域被光漂白时，这一高流动性受体组分的荧光信号被阻断而无法进入中央区域，同时区域内原有的受体逐渐被稀释。因此，在“FLIP”序列中观察到的荧光增强（ΔF）可归因于树突干中SEP-GluA2的插入。低pH缓冲液冲洗以及随后加入pH 7.4含NH4Cl溶液，分别证实所测荧光来源于膜表面蛋白，并揭示了在所测ROI内被隔离的胞内蛋白所占的比例。
与FRAP不同，该方法分离了由胞吐作用引起的恢复，从而导致光漂白区域的荧光恢复水平显著降低。迄今为止，尚未开发出可靠的数学模型用于拟合并分析使用这种选择性漂白技术记录的恢复曲线。然而，仍可用单指数恢复函数对恢复曲线进行拟合：
F(t)=As - A0e(-t/τ)
其中，F(t) 表示时间 t 时的荧光强度，As 表示稳态值，A0 表示时间 0 时的偏移量，τ 表示时间常数。恢复增长以给定速率固定进行，以达到插入与扩散之间平衡的稳态。重要的是，由此分析获得的时间常数并不反映胞吐作用的时间常数，仅可用于同一蛋白不同处理条件之间的比较。
此外，在光漂白区域内的亚结构中也可能观察到预期的荧光恢复模式。分析光漂白片段内较小的兴趣区域（ROI）对于揭示胞吐“热点”至关重要，建议分析长度相近的区域，因为这些热点在树突中的密度差异会影响计算所得的速率。
图3展示了该方案的一个扩展应用，即对视野中包含多条树突的大范围区域进行光漂白，随后仅对其中一条树突进行选择性重复漂白。这种方法能够同时获取传统的“FRAP”和“FRAP-FLIP”数据。在本示例中，海马神经元被感染表达了一种红藻氨酸盐类谷氨酸受体亚基——SEP标记的GluK2。在成像前，这些神经元经环己酰亚胺处理（200μg/ml，持续2小时），以抑制蛋白质合成。因此，在相应测量的ROI中（图3.B）观察到的荧光恢复反映了标准FRAP树突中由侧向扩散和受体再循环共同贡献的恢复比例，而经历“FRAP-FLIP”方案的树突则仅反映再循环的贡献。通过比较FRAP与“FRAP-FLIP”恢复曲线中的ΔF值，可推断出再循环（ΔFrec = 11.05%）与侧向扩散（ΔFdiff = 9.35%）的相对贡献。与图2不同，荧光恢复并未维持在稳态水平，而是由于蛋白质合成被抑制，呈现出短暂上升后信号下降的趋势，对应于可用受体库的耗竭（在记录期间观察到约20%的下降）。
图1. FRAP与FRAP-FLIP实验原理示意图 该示意图展示了使用SEP标记受体时，常规FRAP与“FRAP-FLIP”实验方案的结果差异。左侧显示传统FRAP中的荧光恢复情况。中心ROI中测得的荧光恢复归因于两个因素：来自光漂白ROI区域外未被漂白的SEP标记受体的侧向扩散，以及通过受体循环和/或从头胞吐作用插入到树突主干中的受体。相比之下，右侧所示的对两侧ROI进行重复光漂白操作，体现了这种改进的“FRAP-FLIP”方案如何抑制由侧向扩散引起的荧光恢复。因此，任何测得的荧光恢复均可归因于受体在ROI内的直接插入。
图2. SEP-GluA2 插入树突干质膜的过程
A) 表达 SEP-GluA2 的海马神经元，沿树突某区域选择性光漂白。示意图展示了成像的树突区域，左上方图示标出了用于光漂白的选定 ROI。大白色方框区域被漂白一次后，接着对两侧相邻的方框区域进行重复漂白，以双头蓝色箭头标示。该图显示的是光漂白前的树突形态。红色箭头指示实验中测量的 ROI，其高倍放大图像见下方图示。B) 显示实验过程中测量 ROI 内荧光强度随时间的变化，以 ROI 内灰度值表示（未归一化）。黑色箭头标示初始光漂白的时间点，绿色箭头表示重复光漂白的开始。ΔF 表示在恢复期间观察到的荧光增强，源于 SEP-GluA2 插入树突主干。随后的低 pH 及 pH 7.4 + NH4Cl 冲洗证实，恢复的荧光来源于细胞表面表达的受体。
图3. 经环己酰亚胺处理后，树突干上SEP-GluK2的循环与侧向扩散对比其循环情况
A) 表达 SEP-GluK2 的海马神经元，使用平行 FRAP 和“FRAP-FLIP”恢复方案，在不同树突 ROI 区域进行选择性光漂白。该神经元经环己酰亚胺预处理（200 μg/ml，2 小时）以阻断蛋白质合成。示意图展示了成像所用的树突区域，左侧图示突出显示了用于光漂白的选定 ROI。大白色方框区域仅漂白一次，随后对下方树突两侧的相邻方框区域进行重复漂白，以双头蓝色箭头标示。该图显示光漂白前的树突形态。红色箭头标示 B) 中高倍放大显示的 ROI，用于比较传统 FRAP 与“FRAP-FLIP”方案的荧光恢复情况。恢复后期（第三列图）荧光强度的比较显示了侧向扩散与受体内吞再循环的共同作用，以及仅由再循环介导的恢复差异。C) 显示实验过程中所测 ROI 内荧光强度随时间的变化，以归一化强度值绘制。黑色箭头标示初始光漂白的时间点，绿色箭头标示重复光漂白的开始时刻。ΔFrec 表示由受体内吞再循环引起的瞬时恢复，数据来源于 FRAP/FLIP 树突区域；ΔFdiff 表示在“仅 FRAP”ROI 中 SEP-GluK2 向树突主干侧向扩散的贡献。瞬时增强后荧光信号逐渐下降，反映了因环己酰亚胺处理导致可利用受体耗竭。随后的低 pH 及 pH 7.4 + NH4Cl 洗脱步骤证实，恢复的荧光来源于细胞膜表面表达的受体。
讨论
我们介绍一种可视化血浆膜蛋白运输组分的创新策略。通过将光漂白技术与SEP标记蛋白相结合，可选择性地评估血浆膜插入事件。在恢复过程中持续对侧翼区域的膜蛋白进行光漂白，“FRAP-FLIP”方法能够评估囊泡运输对荧光恢复的贡献。这种新方法可直接记录蛋白质膜插入过程，从而确定观察到恢复的亚区室数量以及稳态下的恢复幅度（ΔF）。此外，通过比较有和无FLIP的FRAP结果，可计算出由侧向扩散所导致的恢复比例。
此外，在同一实验中，可在恢复期间对紧邻两侧光漂白区域的非光漂白树突区域进行定性评估；在这些区域中观察到的荧光减少是由于光漂白的受体侧向扩散进入这些非光漂白的树突片段所致。
该选择性光漂白方案可用于研究多种细胞内运输过程，例如在特定亚区域（如树突或树突棘）中表征细胞质膜上的胞吐作用，或通过在相邻树突上平行进行FRAP和“FRAP-FLIP”实验，评估侧向扩散与新插入的相对贡献（图3）。
显然，尽管已提供具体的操作指南，但每个实验室仍需根据特定的样本和设备优化成像参数。重要的是，在感兴趣区域（ROI）内的所有表面受体都必须被完全光漂白，且该过程应不受z轴焦平面的影响，同时避免产生显著的光毒性损伤或非特异性光漂白。当在细胞胞体区域实施本方案时，操作者应格外谨慎，因为该区域通常含有较高比例的低pH细胞内区室，容易导致背景荧光较强。此外，尽管我们已展示了该技术的多种应用方式，但在对新的SEP标记构建体开展选择性光漂白实验之前，我们建议首先按照Ashby等2所述方法对标记受体进行初步表征。
总体而言，该方法是对标准FRAP方案的一种强大且多功能的改进，能够近乎实时地评估细胞质膜上的插入事件。
致谢
我们感谢惠康基金会和欧洲研究委员会提供的资金支持。IMGG 是欧洲分子生物学组织（EMBO）的博士后研究员。KLH 是由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）资助的博士研究生。我们感谢 Philip Rubin 和 Patrick Tidball 在技术及细胞培养方面提供的支持，感谢 Andrew Doherty 博士在显微镜维护和使用方面提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24 mm 玻璃盖玻片 | VWR international | 631-0161 | |
| 多聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P2636 | 以硼酸盐缓冲液配制成 1 mg/ml 用于包被盖玻片 |
| Neurobasal 培养基 | Invitrogen | 21103 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 在神经元铺板和换液培养基中使用浓度为 2% |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P0781 | 在神经元铺板和换液培养基中使用浓度为 1% |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030 | 铺板/换液培养基中分别为 2 mM / 0.8 mM |
| 马血清 | Biosera | DH-291H | 仅在神经元铺板培养基中使用，浓度为 10% |
| pSIN ReP5 克隆载体 | Invitrogen | K75001 | 用于辛德毕斯病毒的制备 |
| LSM510 META 共聚焦系统 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Image J 软件 | 美国国立卫生研究院 | 开放获取软件。本文所述所有插件均可在 http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ 获取 |
参考文献
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