本报告详细描述了利用递增比率操作式条件反射任务来测量高脂食物在小鼠中奖赏效应的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
富含脂肪和糖的食物显著促进过度进食，并导致肥胖率不断上升。摄入可口的食物会产生奖赏效应，从而强化行为与结果之间的关联，并加强未来获取此类食物的行为。越来越多的证据表明，高能量密度食物的奖赏效应在过度进食及肥胖发生过程中发挥着重要作用，这使得人们对调控食物奖赏的基因、分子和神经环路的研究兴趣日益增加1,2。不同刺激的奖赏效应可通过测量个体为获得该刺激而愿意付出的努力来评估，例如在操作性条件反射任务中进行研究3。食物奖赏的操作性模型用于测量为获取食物而习得的、自主产生的行为反应。衡量奖赏强度的一种常用方法是称为递增比率（progressive ratio, PR）强化程序的操作性范式4,5。在PR任务中，动物为获得每一次后续奖励所需完成的操作反应次数逐渐增加。Hodos（1961年）的开创性研究表明，为获得最后一次奖励所做出的反应次数（称为“断裂点” breakpoint）可作为奖赏强度的指标4。尽管仅通过测量反应速率变化的操作性程序无法区分奖赏强度变化与行为执行能力改变之间的差异，但由PR程序得出的断裂点是评估食物奖赏效应的一个经过充分验证的指标。PR任务已被广泛用于评估成瘾药物和食物对大鼠的奖赏作用（例如6-8），但在小鼠中的应用相对较少9。随着基因工程小鼠和饮食诱导肥胖小鼠模型的广泛应用，对小鼠食物奖赏行为测量方法的需求日益增加。本文详细介绍了训练小鼠在PR强化程序下通过按压杠杆以获取高脂高糖食物颗粒所使用的材料与操作步骤。我们发现，急性禁食后断裂点反应阈值升高，而外周给予厌食激素瘦素（leptin）则使断裂点降低，从而验证了该食物操作性范式在小鼠中的适用性。
方案
*最重要的步骤。
1. 仪器与软件
- 训练和测试在配备有两个超轻可伸缩杠杆的小鼠操作箱中进行1，杠杆位于食物接收口两侧（参见Table 1）。每个杠杆上方设有刺激灯，笼子顶部设有背景灯。颗粒饲料分配器位于箱体外部。每个操作箱均置于带通风风扇的隔音箱内。通过“Smart Control”接口箱，操作箱与装有MedPC IV软件的PC计算机相连。
注意： 当无法获得超轻触杆时，建议在小鼠研究中采用鼻触作为操作性反应。然而，当两种选择均可使用时，我们建议选用超轻触杆作为更可靠的动机测量指标，因为鼻触反应可能由探索性嗅闻所引发。
- 用于运行操作性任务的 MedPC 程序采用 Medstate 状态符号代码编写，用户可在随附的编程手册帮助下学习该代码。编程为用户提供了灵活性，可修改现有代码或生成独特的实验参数。某些代码可从 Med Associates 的“Medstate Notation Repository”免费获取：http://www.mednr.com。其他代码可直接向 Med Associates 购买。
2. 小鼠适应性饲养与食物限制
- 小鼠到达后需同笼饲养至少10天，以适应12小时颠倒的明暗循环，并提供 随意摄取 可自由获取标准饲料和水。本实验所用为购自查尔斯河实验室（Charles River，加拿大魁北克省圣康斯坦市）的成年C57BL/6小鼠。所有小鼠操作及行为学实验均在黑暗周期内进行。涉及动物使用的全部实验程序均经CRCHUM动物护理委员会批准。
- 小鼠随后被单独饲养并进行食物限制（每日食物摄入量的70%），直至其体重降至自由进食体重的90–95%，以促进杠杆按压反应的学习。每天实验结束后，小鼠在饲养笼中获得当日配给的食物。当小鼠体重下降5–10%后，每日食物供给量将进行调整，以使较低的体重在后续训练期间保持稳定。一旦小鼠达到习得标准（见下文），则重新恢复 随意摄取 喂食时间表。小鼠在约3-4天内恢复失去的体重。
- 在首次训练开始前的连续3天，将小鼠置于测试房间内进行适应性操作。训练开始前一天，向小鼠的饲养笼中放入10至15粒高脂高糖（HFHS）食物颗粒，以避免食物新奇恐惧对操作表现产生潜在影响。我们使用20 mg无粉尘精密食物颗粒（也可使用14 mg规格），其中脂肪提供48.9%的千卡能量（Bio Serv，Frenchtown，NJ）。
3. 操作性训练
- 小鼠最初在固定比率（FR）-1 强化程序下进行训练，即单次按压杠杆即可触发一个食物颗粒被送入食盒。仅有一个杠杆被指定为“活动”杠杆（可触发食物奖励的递送），左右杠杆的分配在小鼠之间进行交叉平衡。重要的是，在 FR1 程序中至少加入 5 秒的超时（TO）期（记为 FR1/TO-5），在此期间额外的按压杠杆行为不会导致食物颗粒的递送。该超时期允许小鼠有时间消耗已递送的食物颗粒，但如果实验人员认为有必要，也可使用更长的超时期。每次 FR 训练会话持续 1 小时，或以递送 50 个食物颗粒为结束条件。
- *习得标准：用于判断小鼠是否习得食物维持的操作式反应的标准包括：（1）活动杠杆按压的最小次数及获得的奖励数量；（2）对活动杠杆与非活动杠杆的行为区分能力；以及（3）连续会话间表现的稳定性。若小鼠在连续三个会话中，对活动杠杆与非活动杠杆的按压比例达到或超过 3:1，并且每个会话获得 ≥ 20 次奖励，则认为其达到了习得标准10。我们观察到，大多数（约 75%）C57BL6 小鼠需要约 7–10 天的训练才能达到习得标准。未能在此时间内达标的小鼠将接受额外 5–7 天的训练。若在额外训练第 5 天仍无进展，则将该小鼠排除于测试之外（约占 5% 的情况）。需要注意的是，某些药理学或遗传学干预可能导致操作式行为习得受损，此类情况应予以记录。
- 在连续三个会话中均获得 ≥ 20 个食物颗粒后，程序升级为 FR5/TO-5 秒，即需连续 5 次按压活动杠杆才能触发一次食物颗粒递送。FR5 程序的训练持续三天。
- *随后，小鼠进入强化的递增比率（PR）程序训练。PR 测试期间的反应比率可依据 Richardson 和 Roberts（1996）11 提出的公式计算（结果四舍五入至最接近的整数）：
= [5e (R*0.2)] - 5
其中 R 等于已获得的食物奖励次数加 1（即下一次强化物）。因此，获得每次食物奖励所需按压次数依次为：1、2、4、6、9、12、15、20、25、32、40、50、62、77、95，依此类推。最终完成的比率即为断点（breakpoint）。 - PR 会话最长持续 1 小时。若在任意连续 10 分钟内未发生杠杆按压，则会话终止。当小鼠在 1 小时会话中连续至少 3 天获得的奖励数量波动不超过 ±10% 时，认为其在 PR 强化程序上的表现已趋于稳定。
4. 递增比率测试与验证
- 为了验证PR任务中由食物维持的操作式反应，可以通过已知能够调节食物奖赏的干预措施来评估断点反应。一个相对容易实施的测试是食物剥夺，这会增强小鼠对食物的动机状态，从而提高断点值。小鼠首先需要在自由进食状态下进行PR任务测试，随后在食物剥夺期间再次测试 随意摄取 持续喂养直至达到稳定的基础水平表现。在最后一次“基础水平”日的次日，从鼠笼中移除食物，并在禁食开始24小时后对小鼠进行PR任务测试。
- 我们还研究了外周给予厌食激素瘦素是否会对停顿点阈值产生相反的影响。瘦素（A.F. Parlow，国家激素与肽计划，NIDDK）溶解于无菌PBS中。在某一天进行腹腔注射PBS后的PR测试，次日则在注射瘦素（5 mg/kg）后进行PR测试。瘦素在PR测试前1小时注射。使用配对t检验（GraphPad Prism）比较停顿点。
5. 代表性结果
在测试食物剥夺对PR强化程序中断点反应的调节能力时，我们预期会显著提高中断点，如图1所示。本实验中，与自由进食基线状态相比，24小时食物剥夺使中断点提高了约3.6倍，表明食物剥夺增强了食物的奖赏效应。相反，测试前1小时外周给予厌食激素瘦素（leptin，5 mg/kg，IP）应会降低中断点反应，如图2所示。
图1. 禁食增强食物的奖赏效应。在小鼠中，24小时禁食显著提高了在递增比率（PR）强化程序中的断点值（n=4）。数据表示为均值±标准误；*p<.05。
图 2. 瘦素降低小鼠的食物奖赏。外周给予瘦素（5 mg/kg）降低了小鼠的PR断点反应阈值（n=4）。均值±标准误；*p<0.05。
讨论
操作性条件反射任务为评估食物动机属性的变化提供了有效手段。本文详述的实验步骤可训练小鼠通过按压杠杆获取食物奖励，并在渐进比率（PR）强化程序下稳定地作出反应。
测量食物摄入量并不能提供与基于努力的反应指标相同的读数，因为并非所有影响食物摄入的因素都会调节食物的奖赏效应。例如，在大鼠中外周给予2-脱氧葡萄糖以耗竭可利用的葡萄糖，会增加自由获取食物的摄入量，但不会改变以渐进比率（PR）任务获取食物的断裂点12。PR断裂点反应还可反映食物奖赏质量的变化。例如，断裂点与蔗糖浓度呈正相关，表明对蔗糖的动机随甜味强度的增加而增强8。本文中，我们证明了24小时禁食显著提高了小鼠对高脂高糖（HFHS）食物的PR断裂点。相反，我们发现外周给予厌食激素瘦素（leptin）可显著降低小鼠对HFHS食物的断裂点。这些结果与先前报道的禁食和瘦素在大鼠奖赏阈值中的作用一致12-14。
使用本实验方案时，需注意食物维持型操作式反应的习得过程会因规律训练（每1-2天一次）以及通过实施食物限制方案提高小鼠的动机状态而显著增强。此外，在转入更复杂的强化程序（例如从FR1过渡到FR5）之前，确保小鼠在一种强化程序下表现出相对稳定的反应，是减少测试期间表现波动的关键。尽管采取了上述措施，个体间仍可能出现一定程度的变异性，尤其在不同小鼠之间。因此，建议尽可能采用被试内设计（重复测量），以消除个体间的差异。虽然在研究稳定的遗传修饰（例如基因敲除小鼠与对照小鼠的比较）时无法使用被试内设计，但该设计可用于考察药物、损毁或急性遗传操作（例如光遗传学操作）的影响。
肥胖及相关疾病日益严重，迫切需要明确参与其中的分子和神经通路。越来越多的证据表明，大脑奖赏回路在食物渴求、热量摄入增加及体重增长中发挥重要作用。PR任务是评估神经生物学、遗传学或药物干预对食物奖赏效应影响的有效工具。
披露
本视频文章的制作和免费访问由 Med Associates, Inc. 赞助。
致谢
本项目得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（355881）和加拿大创新基金会资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠操作式条件反射箱 |  Med Associates, Inc. | ENV-009A | Med Associates Inc. 邮政信箱 319 佛蒙特州圣奥尔本斯，05478 美国 电话：(802) 527-2343 |
| 8通道/16通道智能控制连接面板 | Med Associates, Inc. | SG-716B | |
| 超轻型可伸缩小鼠杠杆 | Med Associates, Inc. | ENV-312 | |
| 颗粒分液器 | Med Associates, Inc. | ENV-203 | |
| 室内照明灯 | Med Associates, Inc. | ENV-215 | |
| 刺激光 | Med Associates, Inc. | ENV-221 | |
| 无尘精密 20 mg 高脂饮食 & 高糖颗粒 | Bio-Serv | F-06649 | Bio-Serv 八街一号，一单元 美国新泽西州弗伦奇敦 08825 电话：(800)-996-9908 |
| 表1. 特定仪器与材料 |
参考文献
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