本文描述了在胚胎期和新生小鼠中测量左心室压力（LV）的方法。通过在超声引导下将连接至液体填充式换能器的针头插入左心室来测量压力。在实验过程中必须注意维持心脏的正常功能。
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摘要
摘要
在脊椎动物的胚胎期和出生后发育过程中，血压显著升高。在小鼠中，大约胚胎第8.5天（E8.5）可首次检测到血流1。左心室收缩压在E9.5时为2 mmHg，到E14.5时升至11 mmHg2。在这些中期胚胎阶段，由于肋骨和皮肤尚未完全发育，左心室（LV）可通过胸壁清晰观察，便于进行有创性压力测量。在E14.5至出生（约E21）之间，必须使用成像方法观察左心室。出生后，平均动脉压从出生后第2天至第35天（P2–P35）由30 mmHg上升至70 mmHg3。出生后20天（P20）以后，可使用固态导管（如Millar或Scisense导管）测量动脉压。而在P20之前，这些导管对发育中的小鼠动脉而言过大，必须使用自制的拉制塑料导管连接充液压力传感器3，或使用玻璃微移液管连接伺服零位压力传感器来测量动脉压4。
我们近期的研究表明，在小鼠从晚期胚胎期到出生后早期阶段，血压升高最为显著5-7。这一显著的血压升高可能影响发育中动脉的平滑肌细胞（SMC）表型，并触发重要的机械转导事件。在人类疾病中，当发育中动脉的机械特性因细胞外基质蛋白缺陷而受损时（例如马凡综合征8和主动脉瓣上狭窄9），此阶段血压的快速变化可能通过改变机械转导信号，影响疾病的表型和严重程度。因此，能够在人类疾病的小鼠模型中测量晚期胚胎期和新生儿期的血压变化显得尤为重要。
我们描述了一种用于测量晚期胚胎期（E18）及早期出生后（P1–20）小鼠左心室（LV）压力的方法。在超声引导下，将连接至充满液体的压力换能器的针头插入左心室。实验过程中需特别注意维持心脏的正常功能，尤其是对胚胎期小鼠。本文展示了代表性数据，并讨论了该实验方案的局限性。
方案
1. 超声与压力系统
- 根据制造商的说明启动超声系统（Vevo 770，Visualsonics）。安装合适的探头（E18–P7 阶段使用型号 708，年龄 > P7 = 型号 707B）用蒸馏水冲洗，并连接至超声系统。将探头置于可调节支架上，调整至大致方位，以便对固定在成像平台上的小鼠获取左心室长轴切面图像，使左心室心尖朝向注射臂。
- 压力系统由充满液体的压力传感器、桥式放大器、数据采集系统和数据记录软件（LabChart）组成。连接部分包括三通旋塞阀、管路、鲁尔锁接头和软管接头。一支20 mL注射器一端充入10%肝素化生理盐水用于冲洗，另一端连接针头；另取一支3 mL注射器筒体经改装后用作外壳，以固定注射臂中的针头管路（图1）。
- 使用压力计校准压力传感器系统。
- 将针管和套管安装至超声系统的注射臂上。将压力传感器用铁架台夹住，固定在成像平台大致相同的高度。根据小鼠的年龄选择合适的针头（E18至P3阶段使用30G针头，年龄 > P3 = 25G）连接至针头导管。较细的针头更容易堵塞，穿过胸壁时操作更困难，且响应速度较慢。因此，应针对每个年龄段选择能够适配左心室腔内径的最大针径。
- 在成像平台上放置一 mound 超声耦合剂，并使用可调节支架仔细对准探头，使针头能够直接穿过耦合剂进入探头中心下方（图 2）。针头必须位于探头下方足够深的位置，以避免刺破探头护套，但又需足够接近，以确保处于探头的焦深范围内。如有必要，可手动弯曲针头，使其在整....
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讨论
本文所述方案提供了一种用于测量晚期胚胎及早期新生小鼠左心室（LV）压力的方法。该方案的主要局限在于压力系统的时相分辨率。压力信号从左心室经由针头传递至换能器的过程中会发生衰减，因此仅能记录平均压力值。可通过使用尽可能粗的针头来最小化衰减效应，但针头必须适配不同日龄小鼠左心室腔的大小。由于舒张压可近似视为零，因此可根据平均左心室压力测量值计算出左心室以及相应的动脉收缩压。尽管获取额外的动脉参数更为理想（例如脉压），但收缩压仍能为了解小鼠发育过程中作用于心脏及心血管系统的力学因素提供重要信息。该方案的优势在于操作简便、快速且可重复，适用于对不同小鼠基因型或处理方案进行高通量比较。通过在关键发育阶段测量收缩压，我们能够逐步理解机械力与人类疾病中心脏及心血管结构和功能变化之间的相互作用。
固态导管被认为是压力测量的金标准，其时间分辨率优于充液式换能器。固态小鼠导管的标准规格为1.0F（0.33 mm，Millar）、1.2F（0.4 mm，Scisense）或1.4F（0.47 mm，Millar）。使用1.2F Scisense导管可对出生后21天（P21）以上的小鼠获得良好的动脉压读数.......
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致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 HL087653 和 HL105314。部分方法是在华盛顿大学医学院 Robert Mecham 博士的实验室中开发的。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高分辨率超声系统 | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | 或其他合适的超声系统 |
| 高频超声探头 | VisualSonics, inc. | 708 和 707B | |
| 成像平台与注射臂 | VisualSonics, inc. | Imaging Station 2 | 配备平台的 ECG 和温度反馈控制系统 |
| 压力传感器 | ADInstruments | MLT 844 | |
| 桥式放大器 | ADInstruments | ML221 | |
| 数据采集系统 | ADInstruments | ML866 | |
| 数据记录软件 | ADInstruments | LabChart | |
| 铁架台和夹具 | Various | 用于在测量期间固定压力传感器 | |
| 带鲁尔接头的三通旋塞，公端锁定 | Cole-Parmer | 30600-02 | |
| 内径 1/16" 的Tygon管 | Cole-Parmer | 06408 | |
| 带 1/16" 软管接头的公鲁尔和母鲁尔接头 | Cole-Parmer | 45510-50 45510-00 | |
| 两端分别为公鲁尔和母鲁尔接头的 24" 管路 | Cole-Parmer | 30600-60 | |
| 3 和 10 mL 注射器 | BD Biosciences | ||
| 30G 和 25G 针头 | BD Biosciences | 长度为 1.5 英寸 | |
| Big Ben 压力计 | Riester | 1456-100 | |
| 生理盐水 | Various | ||
| 肝素 | Various | ||
| 超声耦合凝胶 | Parker Hannifin Corporation | Aquasonic 100 | |
| 脱毛乳液 | Nair |
参考文献
- Ji, R. P. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ. Res. 92 (2), 133-135 (2003).
- Ishiwata, T., Nakazawa, M., Pu, W. T., Tevosian, S. G., Izumo, S.
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