测量晚期胚胎及新生小鼠的左心室压力

摘要

本文描述了在胚胎期和新生小鼠中测量左心室压力（LV）的方法。通过在超声引导下将连接至液体填充式换能器的针头插入左心室来测量压力。在实验过程中必须注意维持心脏的正常功能。

摘要

在脊椎动物的胚胎期和出生后发育过程中，血压显著升高。在小鼠中，大约胚胎第8.5天（E8.5）可首次检测到血流¹。左心室收缩压在E9.5时为2 mmHg，到E14.5时升至11 mmHg²。在这些中期胚胎阶段，由于肋骨和皮肤尚未完全发育，左心室（LV）可通过胸壁清晰观察，便于进行有创性压力测量。在E14.5至出生（约E21）之间，必须使用成像方法观察左心室。出生后，平均动脉压从出生后第2天至第35天（P2–P35）由30 mmHg上升至70 mmHg³。出生后20天（P20）以后，可使用固态导管（如Millar或Scisense导管）测量动脉压。而在P20之前，这些导管对发育中的小鼠动脉而言过大，必须使用自制的拉制塑料导管连接充液压力传感器³，或使用玻璃微移液管连接伺服零位压力传感器来测量动脉压⁴。

我们近期的研究表明，在小鼠从晚期胚胎期到出生后早期阶段，血压升高最为显著^5-7。这一显著的血压升高可能影响发育中动脉的平滑肌细胞（SMC）表型，并触发重要的机械转导事件。在人类疾病中，当发育中动脉的机械特性因细胞外基质蛋白缺陷而受损时（例如马凡综合征⁸和主动脉瓣上狭窄⁹），此阶段血压的快速变化可能通过改变机械转导信号，影响疾病的表型和严重程度。因此，能够在人类疾病的小鼠模型中测量晚期胚胎期和新生儿期的血压变化显得尤为重要。

我们描述了一种用于测量晚期胚胎期（E18）及早期出生后（P1–20）小鼠左心室（LV）压力的方法。在超声引导下，将连接至充满液体的压力换能器的针头插入左心室。实验过程中需特别注意维持心脏的正常功能，尤其是对胚胎期小鼠。本文展示了代表性数据，并讨论了该实验方案的局限性。

方案

1. 超声与压力系统

1. 根据制造商的说明启动超声系统（Vevo 770，Visualsonics）。安装合适的探头（E18–P7 阶段使用型号 708，年龄 > P7 = 型号 707B）用蒸馏水冲洗，并连接至超声系统。将探头置于可调节支架上，调整至大致方位，以便对固定在成像平台上的小鼠获取左心室长轴切面图像，使左心室心尖朝向注射臂。
2. 压力系统由充满液体的压力传感器、桥式放大器、数据采集系统和数据记录软件（LabChart）组成。连接部分包括三通旋塞阀、管路、鲁尔锁接头和软管接头。一支20 mL注射器一端充入10%肝素化生理盐水用于冲洗，另一端连接针头；另取一支3 mL注射器筒体经改装后用作外壳，以固定注射臂中的针头管路（图1）。
3. 使用压力计校准压力传感器系统。
4. 将针管和套管安装至超声系统的注射臂上。将压力传感器用铁架台夹住，固定在成像平台大致相同的高度。根据小鼠的年龄选择合适的针头（E18至P3阶段使用30G针头，年龄 > P3 = 25G）连接至针头导管。较细的针头更容易堵塞，穿过胸壁时操作更困难，且响应速度较慢。因此，应针对每个年龄段选择能够适配左心室腔内径的最大针径。
5. 在成像平台上放置一 mound 超声耦合剂，并使用可调节支架仔细对准探头，使针头能够直接穿过耦合剂进入探头中心下方（图 2）。针头必须位于探头下方足够深的位置，以避免刺破探头护套，但又需足够接近，以确保处于探头的焦深范围内。如有必要，可手动弯曲针头，使其在整个行进过程中始终保持在正确的成像平面内。
6. 保持对齐，回撤针头并抬起成像探头，以便将小鼠放置在成像平台上。冲洗针头，以清除可能进入针尖的凝胶。

2. 小鼠准备

1. 本方案中所示所有方法均已获得机构动物护理和使用委员会批准。通过持续吸入1.5%异氟烷对定时妊娠母鼠（E18）或新生小鼠（P1–20）进行麻醉。可将导管插入标准鼻罩，以适应早期新生小鼠（P1–15）较小的头部。
2. 将小鼠以仰卧位固定在超声系统的成像平台上，使左心室心尖朝向注射臂。对于妊娠母鼠，涂抹超声耦合剂，使用附带的ECG检测器监测心率，并插入直肠温度计以实现体温的反馈控制。新生小鼠体型过小，无法使用这些检测设备，因此在压力测量期间监测心率，并通过外部加热灯维持体温。
3. 使用脱毛膏去除妊娠母鼠腹部或幼鼠胸部的毛发。新生小鼠（P1–10）无需进行脱毛处理。
4. 对于妊娠母鼠，使用解剖剪刀和弯头镊子切开腹部。外置一侧子宫角，并置于用温盐水浸湿的纱布上。小心调整胚胎位置，利用超声探头获得左心室的胸骨旁长轴切面图像。在暴露另一侧子宫角之前，测量该侧所有胚胎的压力。定期补充温盐水，以保持所有胚胎及母鼠腹部的湿润状态。

3. 压力测量

1. 将预热并脱气的超声耦合剂涂抹于胚胎期或新生期小鼠。对于未脱毛的新生小鼠，应先在胸部轻轻涂抹少量超声耦合剂以增强耦合效果，然后再涂抹剩余的耦合剂。降低成像探头，并调整成像平台的角度，以获得最佳的胸骨旁左心室长轴切面。切勿调整探头角度，以免破坏针头的对准位置。
2. 在超声屏幕监控左心室图像的同时，缓慢推进针头，直至其接近探头底部。如有必要，调整针头和探头位置以纠正对准偏移。用生理盐水轻轻冲洗针头。开始记录压力数据，并使用 LabChart 软件对压力传感器进行调零。由于传感器会随温度和位置发生漂移，因此在每只小鼠测量前立即调零至关重要。
3. 缓慢推进针头，直至其出现在超声图像边缘，但尚未进入左心室。如有必要，调整针头位置，使其从心尖处进入左心室。如有必要，调整探头位置以保持针头的清晰成像。在推进针头进入左心室腔（图3）的同时，持续记录压力数据并监控超声图像上的针头位置。当压力传感器开始记录到搏动性波形时，即可确认针头已进入左心室腔内（图4）。
4. 若针头看似已在左心室腔内，但记录到的压力信号无搏动性，可轻推注射器活塞进行冲洗，直至检测到压力上升（约 5 - 10 μL 体积）。此举可清除可能阻碍准确读数的堵塞。若压力信号仍无搏动性，则针头可能位于正确平面的上方或下方，未真正进入左心室腔。此时应撤回针头，用生理盐水冲洗后再次推进。若仍无法获得搏动性信号，则应更换下一只小鼠。每只小鼠均应使用新的针头。
5. 在尝试的胚胎期和新生期小鼠中，约 75% 可成功获得压力读数。每次读数应持续 5 - 10 分钟，若某只小鼠的心率与预期值显著不同，则其压力数据不应纳入分析（图5A）。心率对心血管参数具有显著影响，异常心率提示心脏功能受损。胚胎期小鼠通常在子宫首次暴露于体外后 1 - 1.5 小时出现应激反应，因此在整窝小鼠中快速完成压力测量至关重要。

4. 代表性结果

所有结果显示均为 C57BL6J 小鼠的数据。图 3 展示了 P1 小鼠左心室腔内针头位置的图像。针头用于穿刺胸壁并进入较小的左心室腔，但它显著延长了压力系统的响应时间。当手动对系统施加近似阶跃的压力增加时，仅使用导管时达到最大压力 67% 所需的时间为 0.067 秒（最可能代表实际施加压力阶跃所需的时间），使用 25 G 针头时为 0.105 秒，使用 30 G 针头时为 0.529 秒。在图 4A 和 4C 所示的完整记录曲线中可以观察到达到最大压力的延迟。尽管使用 30 G 针头时响应时间较慢，但在胚胎期和新生早期阶段能更准确地捕捉波形，因为小鼠的心率随年龄增长而增加⁵。尽管存在这一限制，仍可假设真实的左心室舒张压（最小值）为零，并根据稳态读数所确定的平均左心室压力的两倍来计算收缩压（最大值）（图 4B 和 4D）⁶。通常认为左心室收缩压与动脉压相等。图 5 展示了 E18 至 P14 不同年龄段测得的心率及计算得到的左心室压力。

图1. 带有连接的三通阀、公（M）和母（F）鲁尔锁接头、软管接头、管路、注射器和针头的压力换能器图像。

图2. 针头与成像探头对齐的装置示意图（A）。成像平台已旋转，使小鼠左心室心尖朝向注射臂。探头安装在可调节支架上，大致调整至获取左心室长轴图像所需的方向。针头的管路外壳固定在注射臂上。将针头插入成像平台上的一堆超声耦合剂中，以确定其相对于成像探头的合适角度以及垂直和水平位置（B）。

图3. 针头（N）穿过P1小鼠胸壁（CW）并进入左心室腔内的图像。比例尺 = 0.1 mm。

图4. 针头进入E18（A）和P14（C）小鼠左心室（LV）时记录到的典型脉动压力读数。由于连接针头后系统的响应时间，达到稳态存在延迟。B和D展示了稳态时读数的放大视图。注意，E18小鼠左心室的最低压力接近零，但在P14小鼠较高心率条件下，无法完整记录从零到最大压力的整个波形。平均压力由稳态读数测得，并假设左心室收缩压 = 2 × 测得的平均压力。

图5. E18至P14小鼠测得的心率（A）和计算的左心室收缩压（B）。E18组n=7，P1组n=5，P3组n=22，P7组n=23，P14组n=16^5-7。

讨论

本文所述方案提供了一种用于测量晚期胚胎及早期新生小鼠左心室（LV）压力的方法。该方案的主要局限在于压力系统的时相分辨率。压力信号从左心室经由针头传递至换能器的过程中会发生衰减，因此仅能记录平均压力值。可通过使用尽可能粗的针头来最小化衰减效应，但针头必须适配不同日龄小鼠左心室腔的大小。由于舒张压可近似视为零，因此可根据平均左心室压力测量值计算出左心室以及相应的动脉收缩压。尽管获取额外的动脉参数更为理想（例如脉压），但收缩压仍能为了解小鼠发育过程中作用于心脏及心血管系统的力学因素提供重要信息。该方案的优势在于操作简便、快速且可重复，适用于对不同小鼠基因型或处理方案进行高通量比较。通过在关键发育阶段测量收缩压，我们能够逐步理解机械力与人类疾病中心脏及心血管结构和功能变化之间的相互作用。

固态导管被认为是压力测量的金标准，其时间分辨率优于充液式换能器。固态小鼠导管的标准规格为1.0F（0.33 mm，Millar）、1.2F（0.4 mm，Scisense）或1.4F（0.47 mm，Millar）。使用1.2F Scisense导管可对出生后21天（P21）以上的小鼠获得良好的动脉压读数...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高分辨率超声系统	VisualSonics, inc.	Vevo 770	或其他合适的超声系统
高频超声探头	VisualSonics, inc.	708 和 707B
成像平台与注射臂	VisualSonics, inc.	Imaging Station 2	配备平台的 ECG 和温度反馈控制系统
压力传感器	ADInstruments	MLT 844
桥式放大器	ADInstruments	ML221
数据采集系统	ADInstruments	ML866
数据记录软件	ADInstruments	LabChart
铁架台和夹具	Various		用于在测量期间固定压力传感器
带鲁尔接头的三通旋塞，公端锁定	Cole-Parmer	30600-02
内径 1/16" 的Tygon管	Cole-Parmer	06408
带 1/16" 软管接头的公鲁尔和母鲁尔接头	Cole-Parmer	45510-50 45510-00
两端分别为公鲁尔和母鲁尔接头的 24" 管路	Cole-Parmer	30600-60
3 和 10 mL 注射器	BD Biosciences
30G 和 25G 针头	BD Biosciences		长度为 1.5 英寸
Big Ben 压力计	Riester	1456-100
生理盐水	Various
肝素	Various
超声耦合凝胶	Parker Hannifin Corporation	Aquasonic 100
脱毛乳液	Nair