Euprymna scolopes 乌贼的 Vibrio fischeri 定植

摘要

该方法概述了夏威夷短尾乌贼（Euprymna scolopes）及其细菌共生体费氏弧菌（Vibrio fischeri）的独立培养过程，并介绍了如何将二者引入以实现细菌对乌贼发光器官的特异性定植。文中描述了通过细菌产生的生物发光以及直接菌落计数来检测定植情况的方法。

摘要

某些细菌与动物组织相关联^1-5。这类宿主-细菌关联（共生关系）可能对宿主有害（致病性），可能对宿主适应性无影响（共栖性），也可能对宿主有益（互利性）。尽管致病性相互作用已受到广泛关注，但目前对有益或共栖细菌如何从环境中被可重复地获取的机制仍知之甚少。海洋革兰氏阴性细菌 V. fischeri 与夏威夷短尾乌贼 E. scolopes 之间的发光器官互利共生关系是一种高度特异性的相互作用，在其整个生命周期中，一个宿主（E. scolopes）仅与一种细菌物种（V. fischeri）建立共生关系^6,7。在此共生过程中，V. fischeri 产生的生物发光为 E. scolopes 在夜间活动时提供了抗捕食的益处^8,9，而富含营养的宿主组织则为 V. fischeri 提供了一个受保护的生态位¹⁰。在每一代宿主中，这种关系都会被重新建立，因此代表了一个可预测的过程，可在共生发育的各个阶段进行详细评估。在实验室条件下，幼年乌贼孵化时处于无共生状态（未定植），若在孵化后最初30–60分钟内收集并转移至无共生体的水中，则只能通过实验接种物实现定植⁶。因此，该相互作用提供了一个有用的研究模型系统，可用于评估从环境中特异性获取共生微生物的各个步骤^11,12。

本文介绍了一种评估新孵化的无菌夏威夷短尾乌贼（E. scolopes）暴露于含有费氏弧菌（V. fischeri）的人工海水中后定植程度的方法。该简单检测方法描述了细菌共生体对E. scolopes新生发光器官的接种、自然感染及回收过程。在共生发育期间，特别注意为动物提供稳定一致的环境条件，尤其是水质和光信号。用于表征共生菌群的方法包括：（1）检测细菌产生的生物发光；（2）对回收的共生菌进行直接菌落计数。

方案

1. 细菌接种物的制备

1. 第0天
   在接种鱿鱼前两天，将相关细菌菌株划线接种于LBS¹³琼脂平板上。
2. 在25-28°C条件下将细菌培养过夜。
3. 第1天
   在玻璃培养管中，用各一环V. fischeri菌株的单菌落接种3 ml LBS液体培养基用于感染实验。同时制备重复管作为备用。
4. 第2天
   （将细菌操作步骤1.4-1.6与鱿鱼操作步骤3.7-3.10同步进行）
   接种前1小时，将细菌以1:80比例（37.5 μl）转接至装有3 ml LBS培养基的玻璃培养管中，并在通气条件下培养1小时。
5. 接种前测定样品的OD₆₀₀值。典型读数范围为0.3-0.6，具体数值因菌株而异。
6. 若目标接种浓度为3-5 × 10³ CFU/ml，则按以下公式计算接种体积：接种体积（μl）= 1.25 / OD₆₀₀（例如，当OD₆₀₀ = 0.5时，计算得接种体积 = 1.25 / 0.5 = 2.5 μl）。该体积将直接加入第4.1步含鱿鱼的人工海水中。对于不同V. fischeri菌株或非本方案所述接种浓度的情况，此计算可能需要相....

讨论

所述的定植实验可在受控的实验室环境中分析一种自然共生过程。因此，该实验可用于评估突变菌株、不同天然分离株以及在不同化学条件下的定植能力。对所述实验进行适当修改后，常用于评估共生关系的不同方面。通过在前24小时检测发光情况，可测定定植的动力学过程，发光信号可在移除符合检测器的闪烁计数器中自动检测。此外，可通过竞争性定植实验测定一种菌株相对于另一种菌株的相对定植能力，该方法将一组动物中两种菌株的输出比例相对于其输入比例进行归一化处理（通过不同的抗生素抗性、荧光或显色标记[LacZ/X-gal]进行区分检测）。最后，可利用共聚焦显微镜直接观察定植过程。

实验中必须使用健康的幼年鱿鱼。鱿鱼健康状况不佳的行为指标包括：持续绕圈游动（应实施安乐死）或在深色表面上保持白色、不改变其色素细胞变为棕色的个体（需谨慎使用）。由于宿主群体之间存在差异，通常进行更多次重复实验且每次使用较少数量的动物，比进行较少次重复实验但每次使用大量样本更具价值。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃培养管，直径16 mm	VWR 国际公司	47729-580
玻璃培养管帽	Fisher Scientific	NC9807998
用于测定光密度的可见光分光光度计600	Biowave	CO8000	任何能够测量OD的分光光度计600 将能够工作。该装置可测量OD600 将液体直接加入玻璃培养管中。根据所用仪器的不同，可能需要对接种量的计算进行适当调整。
GloMax 20/20 单管 luminometer	普洛麦格公司	E5311	相当于Turner BioSystems 20/20n型 luminometer。包含微量离心管架。
GloMax 20/20 光学标准	普洛麦格公司	E5341	用于荧光计校准。
手持式折射仪	福斯特 &和史密斯	CD-14035	每次使用前用去离子水校准。每次使用后用去离子水冲洗，以防止盐分沉积。
Instant Ocean（人工海水浓缩液）	Foster &和史密斯	CD-16881	准备于 35 ≥ 在去离子水中，使用折光仪测定，然后经0.2 μm SFCA 滤膜
过滤装置	Nalge Nunc International	158-0020	无表面活性剂的醋酸纤维素（SFCA）膜，0.2 μm. 我们发现某些含表面活性剂的聚醚砜（PES）滤膜会产生不同的结果。
移液管	Fisher Scientific	13-711-9AM	使用剪刀或剃刀刀片，在第一条脊线以上整齐地切掉移液管尖端，以增大移液管尖端直径，避免挤压鱿鱼幼体。
一次性样品杯（塑料杯）	彗星	T9S（9 盎司）	用于接种的培养皿，上部直径为3 ¼"，下部直径 2 ¼"，高度 3"碗状容器因无底部边缘，可形成均匀的环境，避免鱿鱼陷入低氧区域。其尺寸经优化，适用于40 ml的接种量。产品可从 webstaurantstore.com 购买，型号 #619PI9。
果蝇 小瓶	VWR 国际公司	89092-720	小瓶直径与发光仪光电倍增管（PMT）的开口相匹配。
1.5 ml 微型离心管	ISC Bioexpress	C-3217-1CS	研钵杵的形状必须与试管相匹配。
乙醇，200 证明	Fisher Scientific	BP2818-100
研钵杵	Kimble Chase	749521-1500
5 mm 直径的涂布珠	Kimble Chase	13500 5	每管准备5个，进行高压灭菌。