该方法概述了夏威夷短尾乌贼（Euprymna scolopes）及其细菌共生体费氏弧菌（Vibrio fischeri）的独立培养过程，并介绍了如何将二者引入以实现细菌对乌贼发光器官的特异性定植。文中描述了通过细菌产生的生物发光以及直接菌落计数来检测定植情况的方法。
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摘要
摘要
某些细菌与动物组织相关联1-5。这类宿主-细菌关联（共生关系）可能对宿主有害（致病性），可能对宿主适应性无影响（共栖性），也可能对宿主有益（互利性）。尽管致病性相互作用已受到广泛关注，但目前对有益或共栖细菌如何从环境中被可重复地获取的机制仍知之甚少。海洋革兰氏阴性细菌 V. fischeri 与夏威夷短尾乌贼 E. scolopes 之间的发光器官互利共生关系是一种高度特异性的相互作用，在其整个生命周期中，一个宿主（E. scolopes）仅与一种细菌物种（V. fischeri）建立共生关系6,7。在此共生过程中，V. fischeri 产生的生物发光为 E. scolopes 在夜间活动时提供了抗捕食的益处8,9，而富含营养的宿主组织则为 V. fischeri 提供了一个受保护的生态位10。在每一代宿主中，这种关系都会被重新建立，因此代表了一个可预测的过程，可在共生发育的各个阶段进行详细评估。在实验室条件下，幼年乌贼孵化时处于无共生状态（未定植），若在孵化后最初30–60分钟内收集并转移至无共生体的水中，则只能通过实验接种物实现定植6。因此，该相互作用提供了一个有用的研究模型系统，可用于评估从环境中特异性获取共生微生物的各个步骤11,12。
本文介绍了一种评估新孵化的无菌夏威夷短尾乌贼（E. scolopes）暴露于含有费氏弧菌（V. fischeri）的人工海水中后定植程度的方法。该简单检测方法描述了细菌共生体对E. scolopes新生发光器官的接种、自然感染及回收过程。在共生发育期间，特别注意为动物提供稳定一致的环境条件，尤其是水质和光信号。用于表征共生菌群的方法包括：（1）检测细菌产生的生物发光；（2）对回收的共生菌进行直接菌落计数。
方案
1. 细菌接种物的制备
- 第0天
在接种鱿鱼前两天，将相关细菌菌株划线接种于LBS13琼脂平板上。 - 在25-28°C条件下将细菌培养过夜。
- 第1天
在玻璃培养管中，用各一环V. fischeri菌株的单菌落接种3 ml LBS液体培养基用于感染实验。同时制备重复管作为备用。 - 第2天
（将细菌操作步骤1.4-1.6与鱿鱼操作步骤3.7-3.10同步进行）
接种前1小时，将细菌以1:80比例（37.5 μl）转接至装有3 ml LBS培养基的玻璃培养管中，并在通气条件下培养1小时。 - 接种前测定样品的OD600值。典型读数范围为0.3-0.6，具体数值因菌株而异。
- 若目标接种浓度为3-5 × 103 CFU/ml，则按以下公式计算接种体积：接种体积（μl）= 1.25 / OD600（例如，当OD600 = 0.5时，计算得接种体积 = 1.25 / 0.5 = 2.5 μl）。该体积将直接加入第4.1步含鱿鱼的人工海水中。对于不同V. fischeri菌株或非本方案所述接种浓度的情况，此计算可能需要相应调整。
2. 接种物计数用琼脂平板的制备
- 针对每种处理，标记LBS平板（每种处理2个），用于在步骤4.1中接种样品。
- 每个平板加入5个无菌涂布珠。
3. 采集鱿鱼幼体
- 使用折射仪测量Instant Ocean的盐度，并调节至35‰。
- 使用过滤装置和连接的真空管线或真空泵过滤1 L Instant Ocean，以制备滤膜除菌的Instant Ocean（FSIO）。每次分装前需剧烈涡旋振荡以充氧。过滤装置可在2天内重复使用。
- 将40-50 ml FSIO分装至两个一次性样品杯中。标记其中一个为 最早 以及一个作为 时间线.
- 准备过量的塑料移液管，用于采集幼体鱿鱼：将移液管尖端最低环状纹路上方约1 cm处剪断（见图3）。此操作可扩大鱿鱼通过的截面积，便于收集。若移液管断口处存在粗糙的暴露表面，则应弃用。
- 使用预先准备的移液管收集 E. scolopes 过夜孵化后转移至 最早 FSIO 培养皿。早期孵化的幼体已在卵系统中超过 1 小时，易受到污染微生物的定植 V. fischeri 在卵系统中。不要使用 最早期的 用于敏感定植实验。
- 每30-45分钟检查一次卵箱，观察是否有新孵化的幼体。每次检查时确保清除所有已孵化的幼体。使用移液管将幼体移出，并放入 时间线 FSIO 培养皿中的动物若及时收集，可用于定植实验。
- 当采集结束（日落后约 45 分钟）后，将鱿鱼转移至主实验室。根据经验，将动物置于持续的实验室光照条件下培养，有利于进行 3 小时的接种。
- 每种处理准备一个装有40 ml FSIO的容器。将鱿鱼加入容器中用于实验（每个容器最多n=40）。
- 另准备一个碗作为无共生体（阴性）对照。
- 为每种处理准备专用的移液管。
- 用2%乙醇处死多余的鱿鱼。
4. 桡足类定植
- 第2天 - 使用P10移液器，将计算好的细菌分装量（步骤1.5）加入每个处理组的鱿鱼培养皿中（步骤3.8）。在完成首次接种后立即启动3小时计时器。
- 对每个处理组，使用专用的转移移液器在培养皿中制造“涡流”：将移液器靠近培养皿边缘，反复吸打约10秒，以充分混匀水体和鱿鱼。彻底混匀至关重要。
- 从每个培养皿中取50 μl样品，涂布于步骤2.2中的LBS琼脂平板上（为获得技术重复，每种处理涂布两个50 μl样品）。在25-28°C下过夜培养。
- 为每个处理组准备清洗用培养皿（每皿100 ml FSIO）。
- 为每只鱿鱼准备Drosophila培养管（每管4 ml FSIO）。
- 接种后恰好3小时，将鱿鱼转移至各自对应的清洗培养皿中（所有处理组均需完成）。此步骤终止接种过程。
- 继续将每只鱿鱼单独转移至含有FSIO的Drosophila培养管中。每种处理组使用专用的转移移液器。
- 将装有Drosophila培养管的托盘转移至鱿鱼饲养设施，使其恢复胚胎发育期间经历的昼夜光周期。
- 第3天 - 为每只鱿鱼准备Drosophila培养管（每管4 ml FSIO）。
- 在接种后22-24小时、黄昏前，将每只鱿鱼转移至新的Drosophila培养管中。每种处理组使用专用的转移移液器。
- 第4天 - 准备标记好的1.5 ml微量离心管（每只鱿鱼1管）。
- 在接种后46-48小时、黄昏前，测量并记录每只鱿鱼在Drosophila培养管中的发光强度（使用设定为6秒积分时间、闭盖自动读数的发光仪）。
- 作为背景发光的阴性对照，测量一个不含任何鱿鱼、仅含FSIO的培养管。
- 将每只鱿鱼连同约700 μl液体转移至步骤4.12准备的1.5 ml微量离心管中。随后放入纸板冷冻盒内。一旦盖上盒盖，不得再打开，因为目前尚不清楚诱导细菌排出的光信号机制。
- 将微量离心管在-80°C下冷冻过夜。
5. 定量定植水平
- 每只鱿鱼准备两个（2）微量离心管，每个管中加入 475 μl FSIO（或经高压灭菌的 70% Instant Ocean）。
- 使用无尘纸（Kimwipe）清洁研杵，去除明显碎屑和/或组织，以完成研杵的准备工作。
- 将研杵尖端朝下放入盛有 95% 乙醇的 50 ml 烧杯中。乙醇液面高度应约为 3 cm。
- 对每个研杵，从烧杯中取出后，用无尘纸擦拭其尖端。
- 将研杵再次浸入乙醇中，取出后插入微量离心管架中（尖端朝上），静置晾干约 15 分钟，确保完全干燥。
- 在微量离心管架中解冻鱿鱼（最多 n=8）。
- 如有必要，将体积调整至 700 μl。
- 使用第 5.5 步准备好的研杵，研磨动物组织直至墨囊破裂（液体将变为浑浊的灰黑色）。
- 取出研杵，并确保所有组织均保留在管内。
- 将组织短暂涡旋振荡，精确持续 10 秒（使用计时器）。
- 静置组织 10 分钟。组织将沉淀，而细菌和墨汁保持在溶液中。后续计算中，细菌/墨汁溶液即为 [A] 稀释液（即 700 μl 中的 E. scolopes 发光器官匀浆液）。以下描述了 1:20 的系列稀释液（[B]、[C]）。
- 对于 [B] 稀释液，取 25 μl [A] 加入第 5.1 步准备的微量离心管之一中，涡旋混匀。
- 对于 [C] 稀释液，取 25 μl [B] 加入第 5.1 步准备的另一微量离心管中，涡旋混匀。
- 将每种稀释液各取 50 μl 接种至 LBS 琼脂平板，每种处理设两个重复。
- 将平板在 25–28°C 下过夜培养。
6. 数据分析
- 为计算每个光器官（LO）的菌落形成单位（CFU），对每个处理组中菌落数量在10–400之间的平板进行计数，并使用相应的公式：
CFU/LO = （[A] 平板上的菌落数）× 14；或
CFU/LO = （[B] 平板上的菌落数）× 280；或
CFU/LO = （[C] 平板上的菌落数）× 5600。 - 以对数尺度绘制各个数据点及中位数。
- 数据通常不符合正态分布，方差不齐，且异常值可能包含具有生物学意义的信息。因此，非参数检验是判断不同处理组之间是否存在显著差异的有效方法。
- 使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析。对于两个处理组的比较，采用 Wilcoxon 秩和检验；对于多于两个处理组的比较，采用 Kruskal-Wallis 检验并结合适当的事后检验。
7. 代表性结果
图4展示了一次示例性定植实验的结果。将两种发光水平相对不同的V. fischeri菌株分别接种至六只乌贼体内，同时设置六只无共生菌（未定植）的乌贼作为对照。其中，E. scolopes的共生菌为ES11414，而发光更强的Sepiola robusta共生菌为SR515,16。相似的接种量（图4A）在3小时内即可实现100%定植。在48小时时，通过测定发光水平（图4B）和CFU计数（图4C）来评估菌株的定植能力。通过计算特异性发光强度（图4D；每细菌发光量），可确定各细菌菌株在共生过程中的发光亮度。
图1. 定植实验流程图。分别收集细菌与鱿鱼，随后按指定接种量混合。在接种后3小时、24小时和48小时，将鱿鱼清洗并转移至新培养液中。在48小时时测定其发光强度，并将动物冷冻，此步骤可实现动物体表的灭菌。光器官内定植的细菌在-80°C下可保持活性，经历一次解冻后仍存活（不可进行额外的冻融循环）。
图 2. 细菌均质化与稀释涂布的流程图。连续20倍梯度稀释可为定植细菌的计数提供适当的动态范围。
图3. 移液管的管 shaft 过于尖细，末端孔径过窄（A），可能损伤幼体鱿鱼。通过剪刀或刀片预先切除最细部分，可获得适合转移幼体鱿鱼的合适工具（B）。
图 4. 定植实验的示例数据。（A）接种液中细菌的含量水平。（B）单个鱿鱼的发光强度。（C）单个鱿鱼的菌落计数。（D）单个鱿鱼的特异性发光强度。Apo，无共生型（未定植的阴性对照）。
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讨论
所述的定植实验可在受控的实验室环境中分析一种自然共生过程。因此，该实验可用于评估突变菌株、不同天然分离株以及在不同化学条件下的定植能力。对所述实验进行适当修改后，常用于评估共生关系的不同方面。通过在前24小时检测发光情况，可测定定植的动力学过程，发光信号可在移除符合检测器的闪烁计数器中自动检测。此外，可通过竞争性定植实验测定一种菌株相对于另一种菌株的相对定植能力，该方法将一组动物中两种菌株的输出比例相对于其输入比例进行归一化处理（通过不同的抗生素抗性、荧光或显色标记[LacZ/X-gal]进行区分检测）。最后，可利用共聚焦显微镜直接观察定植过程。
实验中必须使用健康的幼年鱿鱼。鱿鱼健康状况不佳的行为指标包括：持续绕圈游动（应实施安乐死）或在深色表面上保持白色、不改变其色素细胞变为棕色的个体（需谨慎使用）。由于宿主群体之间存在差异，通常进行更多次重复实验且每次使用较少数量的动物，比进行较少次重复实验但每次使用大量样本更具价值。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Mattias Gyllborg 对乌贼饲养设施的支持以及对本文稿的评论，感谢 Michael Hadfield 和 Kewalo 海洋实验室在野外样本采集期间提供的帮助，以及 Ruby 实验室和 McFall-Ngai 实验室成员对本实验方案的贡献。Mandel 实验室的工作由美国国家科学基金会（NSF）IOS-0843633 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玻璃培养管，直径16 mm | VWR 国际公司 | 47729-580 | |
| 玻璃培养管帽 | Fisher Scientific | NC9807998 | |
| 用于测定光密度的可见光分光光度计600 | Biowave | CO8000 | 任何能够测量OD的分光光度计600 将能够工作。该装置可测量OD600 将液体直接加入玻璃培养管中。根据所用仪器的不同，可能需要对接种量的计算进行适当调整。 |
| GloMax 20/20 单管 luminometer | 普洛麦格公司 | E5311 | 相当于Turner BioSystems 20/20n型 luminometer。包含微量离心管架。 |
| GloMax 20/20 光学标准 | 普洛麦格公司 | E5341 | 用于荧光计校准。 |
| 手持式折射仪 | 福斯特 &和史密斯 | CD-14035 | 每次使用前用去离子水校准。每次使用后用去离子水冲洗，以防止盐分沉积。 |
| Instant Ocean（人工海水浓缩液） | Foster &和史密斯 | CD-16881 | 准备于 35 ≥ 在去离子水中，使用折光仪测定，然后经0.2 μm SFCA 滤膜 |
| 过滤装置 | Nalge Nunc International | 158-0020 | 无表面活性剂的醋酸纤维素（SFCA）膜，0.2 μm. 我们发现某些含表面活性剂的聚醚砜（PES）滤膜会产生不同的结果。 |
| 移液管 | Fisher Scientific | 13-711-9AM | 使用剪刀或剃刀刀片，在第一条脊线以上整齐地切掉移液管尖端，以增大移液管尖端直径，避免挤压鱿鱼幼体。 |
| 一次性样品杯（塑料杯） | 彗星 | T9S（9 盎司） | 用于接种的培养皿，上部直径为3 ¼"，下部直径 2 ¼"，高度 3"碗状容器因无底部边缘，可形成均匀的环境，避免鱿鱼陷入低氧区域。其尺寸经优化，适用于40 ml的接种量。产品可从 webstaurantstore.com 购买，型号 #619PI9。 |
| 果蝇 小瓶 | VWR 国际公司 | 89092-720 | 小瓶直径与发光仪光电倍增管（PMT）的开口相匹配。 |
| 1.5 ml 微型离心管 | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | 研钵杵的形状必须与试管相匹配。 |
| 乙醇，200 证明 | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| 研钵杵 | Kimble Chase | 749521-1500 | |
| 5 mm 直径的涂布珠 | Kimble Chase | 13500 5 | 每管准备5个，进行高压灭菌。 |
参考文献
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , PACON International. Honolulu, Hawaii. (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
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