本文描述了一种分析组织成纤维细胞对相关上皮细胞影响的简单方法。该方法与三维组织培养相结合，可促进从三维结构中分离后细胞的分析。该技术适用于具有不同恶性潜能的细胞，有助于系统研究肿瘤相关间质对肿瘤细胞的影响。
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本文内容
摘要
摘要
尽管研究人员已投入大量努力来鉴定参与正常和恶性细胞行为的信号通路及分子1-2，但这些研究大多基于传统的二维细胞培养模型，因其便于对细胞进行操作。目前人们已认识到，细胞内信号通路会受到细胞外力的影响，包括环境的维度以及细胞表面张力3-4。为了更准确地模拟生物组织的结构，研究人员已采用多种方法建立三维模型3。尽管这些模型能够体现多维性及结构应力，但由于模型本身的局限性以及难以从中分离细胞以进行后续分析，对细胞所受相应影响的研究仍不如二维组织培养那样便捷。
肿瘤周围微环境在肿瘤发生及肿瘤行为中的重要作用正日益受到重视4。肿瘤间质由多种细胞类型和细胞外分子组成。在肿瘤发展过程中，肿瘤细胞与间质细胞之间存在双向信号交流5。尽管已鉴定出部分参与肿瘤-间质共进化的因子，但仍需建立简便的技术以系统性地识别和研究这些信号的完整谱系6。成纤维细胞是正常或肿瘤相关间质组织中最丰富的细胞类型，参与基底膜的沉积与维持以及旁分泌生长因子的分泌7。
许多研究团队已采用三维培养系统来研究成纤维细胞在多种细胞功能中的作用，包括肿瘤对治疗的反应、免疫细胞的募集、信号分子、增殖、凋亡、血管生成以及侵袭能力8-15。我们优化了一种简便的方法，利用市售的细胞外基质模型建立混合细胞群体（共培养）的三维培养体系，以评估乳腺成纤维细胞对乳腺上皮细胞的影响16-22。在持续共培养过程中，细胞会形成球状体，其中成纤维细胞聚集于内部，而上皮细胞主要位于球状体外部，并向基质中延伸出多细胞突起。通过观察上皮细胞突起的数量和长度变化，可便捷地量化成纤维细胞调控后对上皮细胞侵袭能力的影响23。此外，我们还建立了一种从三维共培养体系中分离上皮细胞的方法，便于分析成纤维细胞暴露对上皮细胞行为的影响。我们发现，共培养所产生的效应在上皮细胞分离后可持续数周，为开展多种检测提供了充足的时间。该方法适用于不同恶性潜能的细胞，且无需特殊设备。本技术可在多种条件下快速评估体外细胞模型，相应结果还可与体内动物组织模型以及人类组织样本进行比较。
方案
1. 建立三维共培养体系
- 在建立共培养体系的前一天，从冷冻箱中取出Matrigel，置于冰上，并在4 °C冰箱中过夜融化。
- 实验当天，准备共培养用的培养基，该培养基与所用上皮细胞的培养基相同（本示例中为HMEC培养基：DME/F12培养基，含10%小牛血清、5 μg/mL胰岛素、1 μg/mL氢化可的松和1 ng/mL EGF）。在与Matrigel混合前，至少将培养基置于冰上1小时。
- 为稀释已融化的Matrigel，确定所需Matrigel:培养基的总体积（24孔板每孔300 μL），取该体积的一半量的冰上预冷的HMEC培养基加入无菌离心管中，再加入等体积的已融化Matrigel，得到1:1的稀释液。将离心管保持在冰上。
- 在24孔板的指定孔中加入50 μL Matrigel:培养基混合液，置于37 °C、含加湿空气和5% CO2的培养箱中孵育10分钟。
- 向各孔中再加入450 μL Matrigel:培养基混合液，并继续孵育60分钟。
- 在孵育期间，将成纤维细胞（此处为表达GFP的h-TERT永生化还原性乳腺成纤维细胞）与上皮细胞（此处为表达RFP的h-TERT永生化人乳腺上皮细胞系）以每0.5 mL HMEC培养基中各含0.5 × 105个细胞的浓度配制成1:1的细胞悬液。
- 60分钟孵育结束后，将细胞悬液轻轻滴加至已凝固的凝胶表面，并将培养板放回....
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讨论
本文介绍的方法为分析基质成纤维细胞对上皮细胞（包括肿瘤细胞）的影响提供了一种简便的途径。该方法可在由细胞外基底膜基质支撑的三维环境中实现细胞间的直接相互作用，同时便于从基质中轻松分离细胞以进行后续分析。该方法可用于肿瘤相关基质的研究，因为成纤维细胞系可被改造以调控特定的信号通路，而上皮细胞系则可具有不同的侵袭潜能，如图1所示。三维共培养模型可直观验证细胞侵袭性的变化是否已被诱导。该分离方案可在最少操作步骤下从三维培养物中提取细胞，并避免使用可能影响细胞特性的胰蛋白酶或基质溶解试剂。上皮细胞在从三维共培养体系中分离后，仍持续保留其在三维共培养中受到成纤维细胞影响所产生的效应，从而有利于后续分析（图4）。尽管本文示例展示了对细胞迁移的影响，但所有适用于二维培养细胞的检测方法均可用于这些分离后的细胞。我们已利用该方法分析了成纤维细胞中Tiam1表达水平变化对相关乳腺上皮细胞行为的影响。成纤维细胞中Tiam1的缺失可促进乳腺肿瘤细胞在三维培养及动物肿瘤模型中的侵袭和转移23。本方法使我们能够通过分子、生化及功能检测手段分析潜在的参与通路（Liu 和 Buc.......
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披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | 无酚红 |
| Hyclone 经典液体培养基：DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone 小牛血清 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| 胰岛素 | EMD Millipore | 407709 | 溶于 0.005N HCl；0.22 μM 滤膜过滤 |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H4001 | 溶于 50% 乙醇；0.22 μM 滤膜过滤 |
| 表皮生长因子（EGF） | Sigma-Aldrich | E9644 | 溶于 10 mM 乙酸；0.22 μM 滤膜过滤 |
参考文献
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Kim, J. B.
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