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通过展示活细胞中动粒蛋白动态行为与染色体运动研究有丝分裂检查点 果蝇 合胞体胚胎

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DOI：

10.3791/3763

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2012年6月14日

 , 
1Institute for Cell and Molecular Biosciences, University of Newcastle, United Kingdom

本文内容

摘要

动粒是纺锤体组装检查点（SAC）启动信号、监控姐妹染色单体有丝分裂分离的位点。本文介绍了一种利用徕卡激光扫描共聚焦系统，在Drosophila胚胎中可视化动粒蛋白招募与周转过程，并将其与染色体运动进行协调分析的方法。

摘要

纺锤体组装检查点（SAC）机制是一种活性信号，可监测染色体动粒与纺锤体微管之间的相互作用，以阻止后期的启动，直到染色体正确连接为止。细胞利用这一机制防止非整倍性或基因组不稳定，从而避免癌症以及出生缺陷、阿尔茨海默病等其他人类疾病1。目前已鉴定出多个SAC组分，如Mad1、Mad2、Bub1、BubR1、Bub3、Mps1、Zw10、Rod和Aurora B激酶，它们均为动粒动态蛋白2。证据表明，动粒是SAC信号的起始位点。SAC的主要调控靶点是Cdc20。Cdc20是APC/C（后期促进复合物或周期体）的关键激活因子之一3，同时也是一种动粒动态蛋白4-6。当SAC被激活时，会抑制APC/C的活性，阻止两种关键底物——细胞周期蛋白B（cyclin B）和securin——的降解，从而抑制中期向后期的转变7,8。然而，SAC信号究竟如何在动粒上启动并组装，并进一步传递至APC/C以抑制其功能，目前仍不清楚。

Drosophila 是一种极为易于操作的实验体系；与人类相比，它是一种更简单且被深入理解的生物，但却与人类共享许多基本的生命过程。它或许是用于活细胞生物成像研究的最佳模式生物之一，尤其适用于有丝分裂事件在时空中的可视化观察，因为其早期胚胎会同步经历13次快速的核分裂周期（在25 °C下每个周期持续8-10分钟），并逐渐将细胞核有序排列在皮层下方的单层结构中9。

本文介绍了一种利用表达GFP（绿色荧光蛋白）或其变体标记的目标蛋白的转基因果蝇（Drosophila），结合徕卡TCS SP2共聚焦激光扫描显微镜系统，研究果蝇中纺锤体组装检查点（SAC）功能的生物成像方法，并以SAC组分Cdc20和Mad2的GFP融合蛋白图像为例进行展示。

方案

1. 转基因果蝇及其保种

  1. 本演示中使用的转基因果蝇： Ubq-gfp-Cdc20 (II) Ubq-rfp-His2B (X*) Ubq-gfp-Cdc20 (II*) Ubq-gfp-Cdc20 (II*) mad2EY(III*) 和 Ubq-gfp-Cdc20 转基因果蝇此前已在实验室中通过标准的P元件介导转基因方法获得10,11 和 Ubq-rfp-His2B 由法国巴黎居里研究所（Institute Curie）CNRS/UMR 144 的 Yohanns Belaïche 惠赠。通过标准方法将其导入 Mad2 突变背景中 果蝇 遗传学。该 mad2EY 原始突变品系购自Bloomington保种中心。本实验方案中不讨论用于培养转化子的步骤。
    注：* 代表染色体数目。
  2. 维护： 转基因果蝇在 25 °C 置于含有果蝇食物的塑料小瓶中，并在顶部添加干燥酵母粉。根据培养条件，小瓶通常每3-4周常规更换一次。图1).

2. 果蝇食物制备（实验室规模）

  1. 将适量的果蝇培养基混合物加热并持续搅拌，以溶解其中的成分。
  2. 使用Jencons Scientific Ltd生产的蠕动泵，将约8-10 ml该培养基以浆状物形式分装至每个塑料小瓶（直径2.5 cm，长8 cm）中。
  3. 待培养基凝固并冷却至室温后，用棉质泡沫塞封口。将这些培养基小瓶置于托盘中，再用塑料袋密封，保存于4 °C环境中以备后续使用。

3. 小规模卵收集

  1. 将约50对2-3日龄的成年果蝇转移至一个新鲜的果蝇培养管中，培养基表面添加干酵母粉，并在25 °C条件下让其产卵。
  2. 随后每小时将果蝇转移至一个新的培养管中，使胚胎在管中保留30分钟，以确保所收集的部分胚胎处于核分裂周期8-10阶段，此时细胞核逐渐迁移至皮层并排列成单一单层。通常弃去第一小时收集的胚胎，因为其中常含有在产卵条件不适宜时滞留在雌蝇体内的较老胚胎。

4. 准备盖玻片和载玻片

  1. 取一个 50 x 22 mm 的盖玻片，用湿润的细毛笔在其一侧的四个角上蘸取极少量的水，然后将其放置在显微镜载玻片上，使盖玻片因薄液膜产生的毛细表面张力而固定不动。
  2. 在盖玻片中央横向涂上一条薄薄的庚烷胶水，庚烷应在数秒内挥发，仅在盖玻片上留下胶水。
  3. 用金刚石笔将另一片盖玻片切割成小方块（约 1.5 mm2），取其中一块放置在胶水条的一端（用于微注射时开启针尖），其余保存以备后续使用。
  4. 取另一张显微镜载玻片，在其上粘贴一段长约 2 cm 的双面胶带，并撕去覆盖纸。（见 图 2A & B）。

5. 去除胚胎的卵膜

  1. 将果蝇转移至新的培养管中，使用湿润的细毛笔将约50枚卵连同适量液体转移到载玻片的双面胶带上，使卵能够分散开。待液体蒸发后，卵将牢固地粘附在胶带上。
  2. 在解剖显微镜下，用一对镊子的外侧边缘沿卵的长轴方向轻轻多次触碰，直至卵壳（chorion）破裂开口，但需将胚胎保留在卵壳内以防止快速脱水。重复此操作，直至处理了10–20枚卵（具体数量根据单次实验所需卵数而定）。
  3. 随后可将胚胎逐个从卵壳中取出，并小心地转移至涂有胶的条带上。根据是否需要进行显微注射，可将胚胎的长轴与胶带的长边平行或反向平行排列放置。
  4. 为防止进一步干燥，可立即用适量Voltalef 10S油（Holocarbon 700油与27油按5:1混合，Sigma）覆盖胚胎，用于即时成像；或根据实验目的和环境湿度，先将胚胎置于干燥室中干燥3–8分钟以进一步脱水。若需进行显微注射，应在适当时机用10S油覆盖已脱水的胚胎，以防过度脱水。（见图2C、D和E）。

6. 胚胎成像

  1. 使用配备 HCX PL APO CS 40X 1.25 油浸物镜的 Leica TCS SP2 倒置共聚焦显微镜系统采集活体胚胎的时间序列或单张图像（也可根据实验目的使用 60 或 100 倍物镜，放大倍数越高，光漂白现象越明显）。
  2. 当对光谱重叠且在同一胚胎中共表达的多种荧光蛋白进行成像时，需依次采集每种荧光蛋白的发射波长。Leica TCS SP2 系统可用的激发与发射波长如下：GFP，λEx：488 nm，λEm：500–600 nm；RFP，λEx：543 nm，λEm：555–700 nm。
  3. 通常以 2 条扫描线的平均值和 2 帧扫描的平均值获取单张图像。在同步扫描模式下扫描一幅 512×512 像素的图像至少需要 6.3 秒，在顺序扫描模式下则需 15.44 秒，可获得良好的信噪比。设置时间序列图像采集的时间间隔时，需充分考虑上述扫描时间。
  4. 针孔通常设置为 1–2 AU（艾里单位），激光功率应调节至尽可能低的水平，以避免明显的光漂白。

7. 通过显微注射适当试剂诱导胚胎的纺锤体组装检查点（SAC）

  1. 在实验前准备好针头。我们倾向于使用火焰拉制仪（Sutter Instrument，型号：P-97）从硅化玻璃毛细管（GC-100-10，Harvard）中拉制针头，参数设置为：heat = 600，pull = 90，vel = 70，del = 150。
  2. 使用细加样尖端（20 μl Eppendorf，批号：W215818J）将适量浓度的试剂注射缓冲液1-2 ml反向填充至针头中。
  3. 将针头安装在显微镜的针头夹持器上，并将压力管连接至Eppendorf注射控制系统。
  4. 在40X物镜下找到胚胎，并通过移动针头至视野中心并逐渐降低至正确焦平面，找到针头的投影，而不改变焦平面。
  5. 轻柔地将胚胎移开，找到预先固定在胶条一端的盖玻片小方块。极其轻柔地移动针尖，直至其接触小方块盖玻片的边缘，并轻轻将其戳破。
  6. 将胚胎移回视野，选择适合注射的合适发育时期的胚胎。我通常在核分裂周期5-7期进行注射，因为此时细胞核尚未迁移至皮层。注射前可通过快速扫描GFP-Cdc20或RFP-Histone 2B的荧光信号来确定核分裂周期阶段9。
  7. 小心地将胚胎移近针头，并重新调整胚胎和针头的焦平面。将胚胎移入针头下方，在目标位置注入一滴试剂，然后将胚胎移开（或按照显微注射系统的操作说明进行）。根据实验目的，可从胚胎后端或侧面进行注射。
  8. 注射完成后，胚胎即可在适当时间进行成像。（参见 图2F & G）

8. 代表性结果

酵母实验用品，包括玻璃盖玻片、载玻片、镊子、解剖刀、胶带、试管、烧瓶。
图1. 所需材料：a. 细毛笔，b. 小型方形碎玻璃容器，c. 22 × 50 mm 盖玻片，d. 显微镜载玻片，e. 双面胶带，f. 瓶盖带孔的试管中的干酵母粉，g. 用于果蝇饲养的酵母颗粒，h. 果蝇培养管，i. 用于去壳胚胎的半把镊子，j. 一对镊子，k. 正庚烷胶液容器（量瓶）。

显示设置、去壳胚胎放置、油的使用和针头制备的胚胎显微注射示意图。
图 2. 图示为第 4 步中盖玻片和载玻片的准备、第 5 步中胚胎去壳以及第 7 步中显微注射针头的制备。A. 上图显示一张盖玻片，其中间有一条横贯的庚烷胶带，一端粘附着一小块破碎的盖玻片碎片。下图显示一张载玻片，其四个角上各有一薄层水滴，用于固定盖玻片。使用载玻片来承载盖玻片的原因是保持与在载玻片上使用双面胶带时大致相同的焦距，从而在解剖及在胶带与盖玻片之间转移胚胎时，避免重新对显微镜调焦。B. 一张载玻片，其上预先贴有一小段双面透明胶带（Scotch tape），在剥离覆盖纸后用于胚胎去壳。C. 左侧图片显示具有完整卵壳的胚胎，其前端和后端已标记；右侧图片显示胚胎位于破碎的卵壳中，在被转移至带有胶条的盖玻片之前的状态。D & E. 图示两种将去壳后的胚胎转移、放置并排列在胶条上的方法。胚胎在适当干燥后被10S油覆盖。F & G. 图示如何打开注射针尖端并将其定位以进行注射。

上述实验获得的单张图像或延时图像可直接使用 Leica 软件进行分析，或以 .TIF 文件格式保存，该格式为开放格式，可用于后续通过其他常见图像分析软件（如 Image J、Photoshop 和 MetaMorph 等）进行定量分析或编辑处理。以下将讨论两个示例说明此过程：

示例 1： 一段延时录像（图 3）展示了活体 Drosophila 合胞体胚胎中 GFP-Cdc20 的动态着丝粒招募过程以及染色体运动。从原始延时序列图像中确定/编辑了感兴趣区域，并使用 Photoshop 软件进行自动批量转换。该录像使用 QuickTime 软件进行合成。

Mitosis phases sequence, GFP-Cdc20 expression, DNA visualization; fluorescence microscopy images.
图3. 一部延时电影展示了活细胞中GFP-Cdc20在动粒上的动态招募过程及染色体运动 果蝇 合胞体胚胎。（A） 对一只共表达 GFP-Cdc20（绿色）和 RFP-Histone 2B（红色）融合蛋白的转基因合胞体胚胎进行延时成像，使用 Leica TCS SP2 共聚焦系统记录图像，于 18 °C 在第7-8次核分裂周期期间。每10秒采集一帧图像。以细胞已处于前期的帧作为零时间点10. 单击此处查看图3A的视频. （B） GFP-Cdc20 可在前期和前中期的动粒上清晰观察到（B3 & 4，白色箭头）并持续存在于中期和后期的着丝粒上（B5 & 6，白色箭头）。GFP-Cdc20 在间期细胞核中被排除在外（白色箭头指示），在早前期进入细胞核。染色质形态通过共表达的 His2BmRFP 作为标记物确定（B8-14）。比例尺 = 5 mm。

示例 2： 可通过显微注射抗体、荧光标记蛋白或可能激活纺锤体组装检查点（SAC）的化学化合物来操控胚胎，从而研究SAC的功能。例如，注射秋水仙素以解聚微管，从而激活SAC，如图410所示。

显示经秋水仙素处理的 mad2 酵母细胞中 GFP-Cdc20 和 GFP-Mad2 的免疫荧光检测结果。
图 4. Mad2 对秋水仙素诱导的纺锤体组装检查点（SAC）功能至关重要10。对 gfp-cdc20; mad2+/+、gfp-cdc20; mad2EY（mad2-/- 空白突变体）以及 gfp-mad2; mad2EY 胚胎通过显微注射方式进行秋水仙素处理。在注射前（01、07 和 13）或注射后（02–06，上图；08–12，中图；14–18，下图）采集延时共聚焦图像。GFP-Cdc20（上图和中图）或 GFP-Mad2（下图）在动粒上的信号被用作细胞周期进程的标志。上图中，箭头指示 02–06 中停滞的动粒。01 中箭头标记的区域表明，在秋水仙素处理前，GFP-Cdc20 被排除在晚间期细胞核之外。中图显示，在缺乏内源性 Mad2 的情况下，尽管细胞质分裂似乎存在缺陷（如在含秋水仙素条件下缺乏微管的胚胎中所预期的那样），GFP-Cdc20 信号仍持续进出细胞核，并在动粒上反复结合与解离（如 07–12 中箭头所示），提示 SAC 功能失效，无法在秋水仙素处理后使细胞周期停滞。图 10 显示子代细胞核未能正常分离。下图中，14–18 中的箭头指示动粒停滞，并伴有 GFP-Mad2 融合蛋白的积累，表明功能性的 GFP-Mad2 可挽救 Mad2 突变胚胎中的 SAC 缺陷表型。图 13 中的箭头指示 GFP-Mad2 在晚间期细胞核中的积累。比例尺 = 5 mm。胚胎显微注射了约相当于 1% 卵体积的 100 mg/ml 秋水仙素储存液（溶于 1×PBS 中）。

讨论

本文所述方案是一种利用Leica TCS SP2共聚焦激光扫描显微镜对果蝇合胞体胚胎进行成像的通用方法，可根据需要修改以适用于其他显微镜系统，并可通过调整用于研究其他基因功能 果蝇 合胞体胚胎。我们已采用该方案，利用转基因果蝇或多种多克隆抗体，通过观察活体或固定样品中蛋白质的定位，研究纺锤体组装检查点、蛋白质动态变化及蛋白质降解的多个方面。4,6,12-14 .

在收集少量（约10–100枚）卵时，最简便的方法是将果蝇保留在新鲜的果蝇培养管中。这可以避免制备额外的苹果汁琼脂平板和卵收集装置，而这些装置在其他文献中有描述15,16。在盖玻片上的胶带一端添加一小块破碎的盖玻片玻璃，可显著方便打开针头，并在针头浸入10S油时通过调节显微注射系统设置来确定注射体积。胚胎脱水程度对于注射成功至关重要，可有效防止泄漏并维持胚胎活力，尤其是在需要较长时间操作的实验或注射后培育转基因个体时。然而，脱水所需的确切时间并无统一标准，其时长因实验而异，取决于注射溶液的量以及工作环境的湿度。

通过显微注射特定蛋白抑制剂、针对特定蛋白的单克隆或多克隆抗体、信使RNA或荧光标记的多肽，可以在野生型或基因突变背景下操控目标蛋白的特定功能。许多此类突变品系或GFP标记的转基因品系均可从果蝇（Drosophila）品系保藏中心公开获取，其中大部分品系信息可在Flybase（http://flybase.org/）上查询并在线检索。

披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

本方案是在惠康信托基金（Wellcome Trust）资助下开发的。我们感谢 Maureen Sinclair 女士多年来对果蝇品系的维护以及果蝇饲料的制备。我们还要感谢 Michael Aitchison 先生在本方案开发过程中提供的帮助和技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论

必需的仪器和试剂：

<强>共聚焦成像系统： 本方案中描述的成像系统为 Leica TCS SP2 激光扫描共聚焦倒置显微镜系统。所述方法也可适用于其他成像系统，可能仅需进行少量调整。

<强>体视显微镜： 我们使用配备 DF PLAPO 1X-4 物镜的 Olympus SZX7 体视显微镜。

<强>针头拉拔器： Flaming/brown 微量移液器拉制仪（Sutter Instrument，型号：P-97）

<强>显微注射系统： 文中描述了使用Eppendorf显微注射系统，但也可使用其他合适的系统。

<强>果蝇饲料分配器： Jencons Scientific Ltd 蠕动泵

试剂：

玉米粉SUMA，英国100.0 g
红糖Billington’英国50.0 g
干酵母DCL YEAST有限公司，英国25.0 g
琼脂Fisher Scientific10655612.5克
山梨酸BDH，英国 VWR International Ltd.88293100.4g
苯甲酸Fisher Scientific10195992.9克
尼泊金（对羟基苯甲酸甲酯）BDH，VWR International Ltd. 英国K359690150.9克
H2O 至多1L

<强>表1. 果蝇食物成分。

购自 Sigma 的 Holocarbon 700 和 27 油。

<强>干酵母： Thomas Allison，英国

<强>制备庚烷胶： 取约1.5米双面透明胶带，放入15 ml Falcon离心管中，加入5 ml正庚烷，旋转3–5小时或过夜。之后将溶液均分为4份，每份转移至1.5 ml Eppendorf离心管中，在台式离心机中高速离心5分钟，以去除任何杂质。将正庚烷胶液收集并储存于10 ml容量瓶中备用。胶液的粘性强度取决于其浓度及使用量。通常情况下，较稀的胶液在共聚焦显微镜扫描时产生的背景噪声更小。

    <李>盖玻片 BDH，VWR International Ltd. 英国
  • 显微镜载玻片 BDH，VWR International Ltd. 英国
    • <李>硅化玻璃毛细管： GC-100-10，Harvard <李>精细加样技巧： 20μl eppendorf 货号：W215818J <李>镊子 <李>细头画笔

参考文献

  1. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).
  2. Zekanowski, C., Wojda, U. Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).
  3. Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. Flies without a spindle checkpoint. Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).
  4. Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint. Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).
  5. Huang, J., Raff, J. W. The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells. EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).
  6. Xia, G. Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint. Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).
  7. Lorca, T. Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts. Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).
  8. Howell, B. J. Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation. J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).
  9. Foe, V. E., Alberts, B. M. Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis. Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).
  10. Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster. Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).
  11. Karess, R. E. P element mediated germ line transformation of Drosophila. DNA cloning: A practical approach. Glover, D. 2, IRL Press. Oxford. 121-141 (1985).
  12. Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos. Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).
  13. Huang, J. Y., Raff, J. W. The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised. Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).
  14. Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).
  15. Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo. J. Vis. Exp. (31), e1382(2009).
  16. Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (49), e2503(2011).

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GFP SAC

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