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一种简化的技术方法 原位 人眼球角膜切除与视网膜组织剜除

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DOI：

10.3791/3765

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2012年6月12日

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1Fondazione Banca Degli Occhi del Veneto O.N.L.U.S. , 2Telethon Institute for Genetics & Medicine (T.I.G.E.M.)

本文内容

摘要

本文介绍了一种简化技术，用于从人尸体供体的眼球中切除角膜和摘除视网膜组织。此处描述的技术有助于获取高质量的组织，用于移植、手术或研究目的，同时避免损伤眼球的其他组织。

摘要

去核是指从尸体供体中取出眼球，同时保持眼球其余部分不受干扰的过程。摘除是指通过切割将眼组织（尤其是角膜）从眼球上分离并取出的操作。去脏是指移除眼球内部器官（此处指视网膜）的过程。眼球包括角膜、巩膜、玻璃体、晶状体、虹膜、视网膜、脉络膜、肌肉等（补充图1）。当患者出现角膜损伤时，需要将受损角膜切除，并通过角膜移植手术植入健康的角膜。视网膜功能的遗传性疾病或缺陷可能损害视力。人眼眼球可用于多种外科手术，如眼库保存、人角膜或巩膜移植以及眼组织相关研究。然而，关于人角膜和视网膜摘除的信息十分有限，可能是因为人眼组织获取途径受限所致。大多数描述类似操作的研究均在动物模型上进行。科研人员依赖于能够获得经过适当解剖且保存良好的眼组织，以进一步加深对人眼发育、稳态及功能的认识。由于我们接收到大量眼球组织，其中约40%（表1）用于科研目的，因此能够在这些组织上开展大量实验，从而不断定义和完善组织摘除与保存的技术方法。

角膜是一种无血管组织，能够使光线透射到视网膜，因此必须始终保持良好的透明度。在角膜中，位于角膜边缘的角膜缘区域是干细胞的储存库，有助于上皮细胞的重建，并限制结膜过度生长，从而维持角膜的透明性和清晰度。角膜的大小和厚度对清晰视力至关重要，因为其中任一参数的变化都可能导致视力分散或模糊。角膜由五层组成：a）上皮层，b）前弹力层（Bowman层），c）基质层，d）后弹力层（Descemet膜），以及e）内皮层。所有这些层次都必须正常运作，才能确保清晰的视力4,5,6。脉络膜是位于巩膜与视网膜之间的中层被膜，其内侧以Bruch膜为界，负责眼部的血液供应。脉络膜还参与调节眼内温度，并为视网膜外层提供营养5,6。视网膜是一层覆盖在眼球后部的神经组织（补充 图1），由两部分组成：感光部分和非感光部分。视网膜接收来自角膜和晶状体的光线，并将其转化为化学能，最终通过视神经将信号传递至大脑5,6。

本文旨在提供一种从人眼眼球中分离角膜和视网膜组织的实验方案。避免与邻近组织发生交叉污染并保持RNA完整性至关重要，因为这些组织对于以下研究不可或缺：（i）表征眼部组织的转录组；（ii）分离干细胞用于再生医学项目；（iii）评估正常与患病个体组织之间的组织学差异。本文描述了我们目前用于从眼球中去除角膜、脉络膜及视网膜组织的技术。此处提供了一套详细的人眼球解剖及角膜和视网膜组织切除的实验操作流程。配套视频将有助于研究人员掌握一种适当的技术，以获取这些难以常规获得的珍贵人源组织。

方案

1. 原位 眼球角膜的摘除

  1. 使用前约15分钟开启层流空气柜。使用70%异丙醇清洁层流罩。穿戴个人防护装备，如手术帽和口罩。刷洗双手及前臂，并用无菌毛巾擦干。采用无菌技术佩戴无菌手套及无菌手术衣或袖套。
  2. 通过无菌操作放置无菌器械托盘以建立无菌区域。确认器械处于无菌状态。打开无菌器械包，并将其翻转至无菌区域，避免任何污染。
  3. 将所有无菌材料和器械（表2）以及装有眼球的瓶子（眼罐）放置在无菌区域边缘附近，以便于取用。
  4. 根据 表3 所示，用预先准备好的保存/储存液标记各瓶子，并将其与I-PVP（碘-聚乙烯吡咯烷酮）、硫代硫酸钠及无菌生理盐水PBS（磷酸盐缓冲液）一同置于层流空气柜台面上。
  5. 眼部组织和溶液通常保存于4 °C冰箱中，需使其恢复至室温后再使用。避免反复升温/降温循环。将溶液瓶盖及眼罐盖子内面朝上放置于各自对应的瓶子旁边。
  6. 使用无菌镊子从眼罐中取出纱布和海绵。将眼球浸入0.5%无菌I-PVP中2分钟，以去污染眼球表面。将两把镊子置于无菌托盘盖上，位于无菌区域外。使用另一对无菌镊子将眼球转移至0.1%硫代硫酸钠溶液中1分钟。再用同一对镊子将眼球转移至含有无菌生理盐水（PBS）的瓶子中，直至进行下一步操作。对同一供体的另一只眼球重复相同操作。
  7. 在层流罩下操作，用无菌纱布（绷带）包裹眼球，仅暴露角膜及角膜周围约5 mm的巩膜。眼球可直接用手持握，保持适当压力。整个手术过程中应保持组织湿润。
  8. 使用镊子配合剪刀彻底清除结膜残余组织。上述操作所用器械应与其他器械分开使用。使用手术刀片在距角膜缘3-4 mm处做巩膜切口，随后将切口延展至360°，注意避免穿透下方的葡萄膜组织或改变角膜正常曲率。做四个较大的切口，保留四个小间隙，防止玻璃体溢出。四个间隙的切割应确保不切除其他组织。
  9. 若存在小的巩膜斑块可能影响切割，应使用显微手术剪完成巩膜切除。此操作过程中不得损伤脉络膜、视网膜及玻璃体。
  10. 检查切口是否完整。若切口操作正确，角膜-巩膜环仅在对应角膜位置处与睫状体相连。
  11. 将包裹好的眼球置于无菌区域中央附近。使用镊子固定巩膜边缘，另一只手向下并远离角膜-巩膜纽扣方向牵拉睫状体-脉络膜，完成角膜的剥离。
  12. 轻柔分离角膜-巩膜纽扣上任何残留的粘连组织。切勿以可能导致角膜横向张力的方式牵拉角膜-巩膜环，也不允许其回落至前房内。
  13. 使用低渗溶液检测角膜内皮细胞密度，并用台盼蓝染色约1分钟检测细胞死亡率，随后在光学显微镜下计数并以细胞/mm2表示。操作时前房应朝向培养皿盖，后部朝向培养皿底部。可在100倍物镜下借助目镜网格手动计数内皮细胞密度。在意大利，用于移植的最低可接受细胞密度为2200个内皮细胞/mm2。
  14. 使用角膜抓钳将角膜-巩膜环转移至预先准备、保存于室温（RT）的角膜保存液中，如 表3 所示。
  15. 检查后房是否存在天然晶状体。若巩膜已处理完毕，清除眼球上所有葡萄膜和玻璃体残余。小心拆开包裹并以无菌技术将剩余的后部节段放回对应的眼罐中。对另一只眼球使用新器械重复上述操作。用角膜抓钳固定角膜，并在31 °C条件下置于保存液（器官培养）中保存。切除后的角膜，如 图1a 所示，可用于角膜移植或科研。
  16. 将不必要的材料和生物危害性废弃物投入指定的废物容器中。工作完成后，使用70%异丙醇喷雾清洁工作区域。
  17. 若角膜在保存28天后仍保持所有评估参数（如形态、细胞计数、透明度、厚度及微生物学检测——使用Bactec 9240仪器（Becton Dickinson, Milan, Italy）进行细菌和真菌检测）合格，则可使用 表4 所示的运输介质将角膜运送至医院。角膜应于层流空气柜内从保存介质转移至运输介质。
  18. 由于在保存过程中角膜会增厚，超出移植所需正常厚度，眼库通常使用脱水剂降低其厚度。我们使用6%右旋糖酐T500使角膜在运输介质中恢复至正常大小。尽管可使用4-8%右旋糖酐T500，但6%浓度在本机构应用效果最佳。这有助于外科医生在收到角膜后能立即进行移植。

2. 切除角膜后从眼球中摘除视网膜

  1. 切除后，根据角膜的形态和内皮细胞密度选择用于移植或研究的角膜，并将其置于31 °C的保存或保存培养基中。眼球的其余部分则进行进一步处理，例如用于手术目的的巩膜分离、视网膜用于研究等。
  2. 在进行视网膜切除前，确保眼球完整，仅角膜连同部分巩膜已被移除。如果胶状的玻璃体正在渗出，则难以完整取出视网膜组织。
  3. 若供体年龄低于65岁，在血清学检测后将巩膜保存于无菌PBS中以用于外科手术。在此情况下，巩膜不进行切割，仅移除玻璃体，完整保留整个巩膜。
  4. 进行视网膜切除时，使用无菌镊子和剪刀，从巩膜的角膜侧开始做一小切口，朝向视神经方向进行。用镊子夹住巩膜部分，用剪刀沿直线朝视神经方向逐段剪开，避免损伤玻璃体。
  5. 脉络膜斑块应与巩膜分离，因为它们通常粘连在一起。将整个巩膜剪开以暴露脉络膜组织。一旦巩膜完全被剪开，靠近视神经处剪断，使巩膜与残留的玻璃体分离。此时可见一个被脉络膜包裹的完整玻璃体球，如图2a所示。
  6. 使用两把无菌镊子，用其中一把轻轻夹起脉络膜层，另一把将其剥离，从而轻柔地去除脉络膜层。也可使用剪刀去除脉络膜层，但应尽量避免，因其可能损伤视网膜。可先部分去除脉络膜层并进行剪切，以利于完整剥离。
  7. 一旦去除脉络膜层，即可清晰看到一层透明的视网膜，如图2b所示。脉络膜层内侧附有布鲁赫膜（Bruch's membrane），也可一并去除，但肉眼难以识别。
  8. 同样地，使用两把镊子去除视网膜层，如图2c所示。若在视神经附近进行切除，则更容易获得大量视网膜组织。此时，眼球的所有层次结构均可清晰观察，如图2d所示。
  9. 视网膜组织取出后，可根据不同用途进行后续处理，因此所采用的保存步骤和条件可能有所不同。例如，可将视网膜组织置于含有RNA稳定试剂（如RNAlater）的离心管中，或置于裂解缓冲液（用于RNA或DNA提取）、dispase/trypsin酶（用于细胞分离）、固定液（用于组织包埋于石蜡或OCT前的免疫组织化学处理）中。
  10. 清理所有工作区域，并使用70%异丙醇喷雾清洁操作台面。

3. 典型结果

角膜-巩膜缘的外观如图所示 图1a 是一枚切取适当、带有足够巩膜缘且内皮形态符合要求的角膜，此类角膜通常用于穿透性角膜移植术。若切取的角膜前基质受损并伴有混浊，则可用于内皮角膜移植术/后板层角膜移植术（保留内皮及部分基质）。而若内皮层受损或内皮细胞密度降低， < 2200 个细胞/mm2 （意大利标准），若角膜内皮细胞计数低于规定要求，该角膜可用于前部板层角膜移植术（上皮及部分前基质层）或用于科研；若角膜完全受损，则可用于科研，如图所示 图1b、3b和3c 或废弃。损伤可能由组织处理不当、既往白内障手术导致的基质层或后弹力层内皮瘢痕、患者生前发生的物理性损伤等原因引起。因此，有必要先用裂隙灯检查每份组织，再在光学显微镜下观察是否存在细微瘢痕、皱褶或脱离。角膜通常保存在两种不同条件下，如器官培养（约 31 °C）通常在欧洲国家或低温条件下（约 4 °C通常在美国使用。我们采用器官培养法，因为它有助于修复受损的上皮细胞，恢复高死亡后时间角膜内皮细胞的活力，支持长达4周的保存期，为手术安排提供了充足的时间窗口，并为微生物学（细菌和真菌）及血清学检测等提供足够时间。角膜在运输培养基中可良好保存7天。

可逐部分剪切巩膜，以确保轻柔地清除所有脉络膜斑块。当如图4所示锐性切断视神经、脉络膜或视网膜时，玻璃体液可能流出。若摘取视网膜用于RNA分析，应在组织离体后立即保存于RNAlater中。通常切取1×1 cm大小的脉络膜和视网膜组织，置于RNAlater中于4 °C保存24小时后，转移至新的Eppendorf管（安全锁扣管，2 ml）中，在-80 °C长期保存，直至使用或用干冰运输。为避免与其他色素结构污染，应使用两把镊子在视神经附近、远离虹膜或睫状体边缘处摘取视网膜组织，并立即转移至保存容器中，因为视网膜RNA在操作过程中极易降解。

角膜保存效果对比，巩膜边缘及弯曲角膜，生物学实验结果。
图1. 高质量与低质量角膜的比较：a) 正确切除的角膜。此类角膜通常在器官培养条件下保存4周。在运送至医院前，需进行微生物学检测（使用Bactec 9240仪器）和形态学检测（用台盼蓝染色以测定细胞死亡率，并在光学显微镜下以100倍放大倍数观察细胞）（图3a）；b) 弯曲的角膜，由于后弹力层皱褶明显且角膜内皮细胞损伤严重，使用裂隙灯显微镜检查后通常会导致移植排斥。此类角膜通常用于科研或被废弃。

眼球解剖示意图，显示巩膜、脉络膜、视网膜、视神经和玻璃体的结构。
图 2. 用于确保准确切除视网膜组织的方法。a) 使用24 mm刀片，配合95 mm弯曲或钝头无菌剪刀和100 mm、11×2规格、齿宽0.70 mm的无菌镊子，从眼球上分离巩膜。操作时应使用镊子夹住一侧巩膜，用剪刀沿直线朝视神经方向剪开。此时可清晰看到脉络膜层；b) 使用两把100 mm、11×2规格、齿宽0.70 mm的无菌镊子，通过撕开的方式去除脉络膜，从而暴露出下方透明的视网膜层；c) 使用相同的镊子，在靠近视神经处小心切除透明的视网膜层，避免挤出玻璃体液。两把镊子应分别夹住视网膜两侧，从视神经附近开始，轻柔地向角膜方向移除组织，以获取足量的视网膜组织。该组织可切成不同大小，用于后续分析实验；d) 本图展示了去除角膜后眼球的不同层次结构。首先去除脉络膜，随后在不损伤眼球其他部分的前提下分离视网膜。

显微镜图像显示组织样本中内皮细胞脱落及医源性皱褶。
图3. 在光学显微镜100倍放大下观察到的不同类型的细胞密度与形态的比较。a) 良好的角膜内皮细胞密度（>2200 个细胞/mm2）和形态（多形性较低、退变少、无营养不良且细胞死亡率为0%），表明该角膜适合用于移植；b) 角膜内皮细胞密度较差（约1200–1400 个细胞/mm2），形态异常（细胞多形性显著增高、严重退变），并伴有约30–40%的整体细胞死亡率，经台盼蓝染色后可见；c) 在从眼球中取出角膜时，由于内皮层片状脱落，导致部分内皮细胞受损；通过台盼蓝染色区域中细胞死亡的观察可证实这一点；d) 后弹力层皱褶的形成是由于在切除过程中操作不当所致，例如弯曲角膜、造成跨角膜张力、过度使用器械等。图中显示了在角膜周边区与光学区之间形成的明显医源性皱褶。

眼球解剖示意图，标注玻璃体，突出显示解剖结构及污染物检测。
图4. 在切除角膜过程中对脉络膜和视网膜组织造成的损伤，最终会导致玻璃体液的流出。视网膜会因此与玻璃体粘连，使得在无污染的情况下获取高质量组织样本变得困难。

手术活动表；角膜移植术、内角膜移植术数据；2009-2010年趋势分析。
表1. 2009年和2010年在意大利威尼斯眼库基金会（Fondazione Banca Degli Occhi）使用人眼球组织开展的各项活动汇总。约60%的组织用于移植，因此仍有大量眼球组织（约40%）可用于科学研究与医学研究。

眼睛解剖图；标注部分包括角膜、巩膜，展示人眼结构。
补充图1. 人眼的解剖结构5。本图展示了人眼的不同部分，用于确定组织的精确位置。

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讨论

角膜和视网膜组织的正确切除与妥善保存均至关重要，因为微小的缺陷（如内皮损伤或后弹力层皱褶过多）可能导致角膜移植失败，而温度变化或操作不当则可能破坏视网膜组织的完整性。本文旨在展示如何以最佳方式分离角膜和视网膜组织，避免造成可能影响其用于移植或研究的损伤或改变。组织适用于移植的标准包括最低细胞密度（>2200 个细胞/mm2）、良好的形态学特征（如细胞大小、结构完整、细胞间边界退化程度低、无营养不良性改变），以及角膜的良好透明度和适当厚度。若手术刀片使用粗暴或过度使用其他器械，不仅会损伤角膜，还可能损害玻璃体，从而增加其他组织进一步切除的难度（图4）。视网膜为透明组织，若其伴随玻璃体液一同释放，则难以辨认，通常会使视网膜组织的切除更加复杂。若视网膜与玻璃体一同被切除，则所获组织或提取的RNA质量将因其他眼部结构的污染而显著降低。因此，采用适当的技术进行角膜或视网膜的切除，对于获取高质量组织至关重要。

我们过去两年的数据（表1）表明，从眼球中获取的角膜约有60%适用于各种类型的移植手术。这进...

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致谢

本工作部分得到了威尼托大区（Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 和 Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009）资助项目的资助。作者感谢 C. Griffoni 博士提供了关于人眼眼球使用情况的 2009/2010 年汇总数据。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
角膜和视网膜切除所需材料。
带护套一次性手术刀刀片尺寸 15Swann-Morton
无菌敷料5 cm × 5 cm，8 层，5 片Artsana
无菌一次性医用巾35 × 50 cmU.Jet
无菌剪刀刀刃 24 mm / 总长 95 mm，弯曲，钝头e.janach
无菌镊子不锈钢 - 100 mm，11 × 2 齿，齿距 0.70 mme.janach
角膜抓钳 – 一次性医用器械NIIOS (Hippocratech)
PBS100 ml PBS [10x] 加入 900 ml d/w（蒸馏水）中Sigma-Aldrich
硫代硫酸钠1 g 硫代硫酸钠溶于 1 升 PBS [1x] 中Sigma-Aldrich
碘伏聚维酮（I-PVP）5 g I-PVP 溶于 1 升蒸馏水中Sigma-Aldrich
表 2. 本表列出了用于角膜和视网膜切除的材料及其来源公司。
保存液材料（2000 ml）。
MEM (1X) 液体Invitrogen32360-034
丙酮酸钠Invitrogen11360-0391 mM (10 ml/l)
L-谷氨酰胺Invitrogen25030-0322 mM (10 ml/l)
抗生素/抗真菌剂Sigma-AldrichA5955-20ML10 ml/l
新生小牛血清Invitrogen26010-742% (20 ml/l)
表 3. 保存液材料。
保存液的配制
按照上述指定浓度，将所有成分加入容器中并充分混匀。使用蠕动泵和孔径为 0.2 微米的滤器（Millipore，意大利米兰）进行过滤。将配制好的保存液置于瓶中，室温保存。
运输液材料（2000 ml）。
MEM (1X) 液体 Invitrogen32360-034
丙酮酸钠Invitrogen11360-0391 mM (10 ml/l)
L-谷氨酰胺Invitrogen25030-0322 mM (10 ml/l)
新生小牛血清Invitrogen26010-742% (20 ml/l)
右旋糖酐 T500Pharmacosmos5510050040076% (60 g/升)
表 4. 运输液材料。
运输液的配制
将 6% 右旋糖酐加入约 1.5 升 MEM 中，静置过夜。然后加入其余成分，使用真空泵和 0.2 微米滤器（Millipore，意大利米兰）过滤。将运输液分装至瓶中，室温保存。

参考文献

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