一种简化的技术方法 原位 人眼球角膜切除与视网膜组织剜除

摘要

本文介绍了一种简化技术，用于从人尸体供体的眼球中切除角膜和摘除视网膜组织。此处描述的技术有助于获取高质量的组织，用于移植、手术或研究目的，同时避免损伤眼球的其他组织。

摘要

去核是指从尸体供体中取出眼球，同时保持眼球其余部分不受干扰的过程。摘除是指通过切割将眼组织（尤其是角膜）从眼球上分离并取出的操作。去脏是指移除眼球内部器官（此处指视网膜）的过程。眼球包括角膜、巩膜、玻璃体、晶状体、虹膜、视网膜、脉络膜、肌肉等（补充图1）。当患者出现角膜损伤时，需要将受损角膜切除，并通过角膜移植手术植入健康的角膜。视网膜功能的遗传性疾病或缺陷可能损害视力。人眼眼球可用于多种外科手术，如眼库保存、人角膜或巩膜移植以及眼组织相关研究。然而，关于人角膜和视网膜摘除的信息十分有限，可能是因为人眼组织获取途径受限所致。大多数描述类似操作的研究均在动物模型上进行。科研人员依赖于能够获得经过适当解剖且保存良好的眼组织，以进一步加深对人眼发育、稳态及功能的认识。由于我们接收到大量眼球组织，其中约40%（表1）用于科研目的，因此能够在这些组织上开展大量实验，从而不断定义和完善组织摘除与保存的技术方法。

角膜是一种无血管组织，能够使光线透射到视网膜，因此必须始终保持良好的透明度。在角膜中，位于角膜边缘的角膜缘区域是干细胞的储存库，有助于上皮细胞的重建，并限制结膜过度生长，从而维持角膜的透明性和清晰度。角膜的大小和厚度对清晰视力至关重要，因为其中任一参数的变化都可能导致视力分散或模糊。角膜由五层组成：a）上皮层，b）前弹力层（Bowman层），c）基质层，d）后弹力层（Descemet膜），以及e）内皮层。所有这些层次都必须正常运作，才能确保清晰的视力^4,5,6。脉络膜是位于巩膜与视网膜之间的中层被膜，其内侧以Bruch膜为界，负责眼部的血液供应。脉络膜还参与调节眼内温度，并为视网膜外层提供营养^5,6。视网膜是一层覆盖在眼球后部的神经组织（补充 图1），由两部分组成：感光部分和非感光部分。视网膜接收来自角膜和晶状体的光线，并将其转化为化学能，最终通过视神经将信号传递至大脑^5,6。

本文旨在提供一种从人眼眼球中分离角膜和视网膜组织的实验方案。避免与邻近组织发生交叉污染并保持RNA完整性至关重要，因为这些组织对于以下研究不可或缺：（i）表征眼部组织的转录组；（ii）分离干细胞用于再生医学项目；（iii）评估正常与患病个体组织之间的组织学差异。本文描述了我们目前用于从眼球中去除角膜、脉络膜及视网膜组织的技术。此处提供了一套详细的人眼球解剖及角膜和视网膜组织切除的实验操作流程。配套视频将有助于研究人员掌握一种适当的技术，以获取这些难以常规获得的珍贵人源组织。

方案

1. 原位 眼球角膜的摘除

1. 使用前约15分钟开启层流空气柜。使用70%异丙醇清洁层流罩。穿戴个人防护装备，如手术帽和口罩。刷洗双手及前臂，并用无菌毛巾擦干。采用无菌技术佩戴无菌手套及无菌手术衣或袖套。
2. 通过无菌操作放置无菌器械托盘以建立无菌区域。确认器械处于无菌状态。打开无菌器械包，并将其翻转至无菌区域，避免任何污染。
3. 将所有无菌材料和器械（表2）以及装有眼球的瓶子（眼罐）放置在无菌区域边缘附近，以便于取用。
4. 根据 表3 所示，用预先准备好的保存/储存液标记各瓶子，并将其与I-PVP（碘-聚乙烯吡咯烷酮）、硫代硫酸钠及无菌生理盐水PBS（磷酸盐缓冲液）一同置于层流空气柜台面上。
5. 眼部组织和溶液通常保存于4 °C冰箱中，需使其恢复至室温后再使用。避免反复升温/降温循环。将溶液瓶盖及眼罐盖子内面朝上放置于各自对应的瓶子旁边。
6. 使用无菌镊子从眼罐中取出纱布和海绵。将眼球浸入0.5%无菌I-PVP中2分钟，以去污染眼球表面。将两把镊子置于无菌托盘盖上，位于无菌区域外。使用另一对无菌镊子将眼球转移至0.1%硫代硫酸钠溶液中1分钟。再用同一对镊子将眼球转移至含有无菌生理盐水（PBS）的瓶子中，直至进行下一步操作。对同一供体的另一只眼球重复相同操作。
7. 在层流罩下操作，用无菌纱布（....

讨论

角膜和视网膜组织的正确切除与妥善保存均至关重要，因为微小的缺陷（如内皮损伤或后弹力层皱褶过多）可能导致角膜移植失败，而温度变化或操作不当则可能破坏视网膜组织的完整性。本文旨在展示如何以最佳方式分离角膜和视网膜组织，避免造成可能影响其用于移植或研究的损伤或改变。组织适用于移植的标准包括最低细胞密度（>2200 个细胞/mm²）、良好的形态学特征（如细胞大小、结构完整、细胞间边界退化程度低、无营养不良性改变），以及角膜的良好透明度和适当厚度。若手术刀片使用粗暴或过度使用其他器械，不仅会损伤角膜，还可能损害玻璃体，从而增加其他组织进一步切除的难度（图4）。视网膜为透明组织，若其伴随玻璃体液一同释放，则难以辨认，通常会使视网膜组织的切除更加复杂。若视网膜与玻璃体一同被切除，则所获组织或提取的RNA质量将因其他眼部结构的污染而显著降低。因此，采用适当的技术进行角膜或视网膜的切除，对于获取高质量组织至关重要。

我们过去两年的数据（表1）表明，从眼球中获取的角膜约有60%适用于各种类型的移植手术。这进.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
角膜和视网膜切除所需材料。
带护套一次性手术刀	刀片尺寸 15	Swann-Morton
无菌敷料	5 cm × 5 cm，8 层，5 片	Artsana
无菌一次性医用巾	35 × 50 cm	U.Jet
无菌剪刀	刀刃 24 mm / 总长 95 mm，弯曲，钝头	e.janach
无菌镊子	不锈钢 - 100 mm，11 × 2 齿，齿距 0.70 mm	e.janach
角膜抓钳 – 一次性医用器械		NIIOS (Hippocratech)
PBS	100 ml PBS [10x] 加入 900 ml d/w（蒸馏水）中	Sigma-Aldrich
硫代硫酸钠	1 g 硫代硫酸钠溶于 1 升 PBS [1x] 中	Sigma-Aldrich
碘伏聚维酮（I-PVP）	5 g I-PVP 溶于 1 升蒸馏水中	Sigma-Aldrich
表 2. 本表列出了用于角膜和视网膜切除的材料及其来源公司。
保存液材料（2000 ml）。
MEM (1X) 液体	Invitrogen	32360-034
丙酮酸钠	Invitrogen	11360-039	1 mM (10 ml/l)
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-032	2 mM (10 ml/l)
抗生素/抗真菌剂	Sigma-Aldrich	A5955-20ML	10 ml/l
新生小牛血清	Invitrogen	26010-74	2% (20 ml/l)
表 3. 保存液材料。
保存液的配制
按照上述指定浓度，将所有成分加入容器中并充分混匀。使用蠕动泵和孔径为 0.2 微米的滤器（Millipore，意大利米兰）进行过滤。将配制好的保存液置于瓶中，室温保存。
运输液材料（2000 ml）。
MEM (1X) 液体	Invitrogen	32360-034
丙酮酸钠	Invitrogen	11360-039	1 mM (10 ml/l)
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-032	2 mM (10 ml/l)
新生小牛血清	Invitrogen	26010-74	2% (20 ml/l)
右旋糖酐 T500	Pharmacosmos	551005004007	6% (60 g/升)
表 4. 运输液材料。
运输液的配制
将 6% 右旋糖酐加入约 1.5 升 MEM 中，静置过夜。然后加入其余成分，使用真空泵和 0.2 微米滤器（Millipore，意大利米兰）过滤。将运输液分装至瓶中，室温保存。