配对末端标签测序法染色质相互作用分析（ChIA-PET）是一种用于 从头合成 染色质相互作用的检测，以更深入理解转录调控机制。
方法文章
配对末端标签测序染色质相互作用分析（ChIA-PET）用于绘制染色质相互作用图谱及解析转录调控机制
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
基因组以三维结构组织，在微米级的细胞核空间内形成高级构象7, 2, 12。这些结构并非随机形成，而是涉及基因启动子与调控元件之间的相互作用13。转录因子与特定调控序列的结合，形成了转录调控与协调的网络1, 14。
成对末端标签测序法染色质相互作用分析（ChIA-PET）被开发用于鉴定这些高等级染色质结构5,6。首先对细胞进行固定，并通过共价的DNA-蛋白质交联来捕获相互作用的基因组位点。为了最大限度地减少非特异性背景噪音、降低复杂性，并提高染色质相互作用分析的特异性，在邻近连接之前，使用针对特定蛋白因子的染色质免疫沉淀（ChIP）来富集感兴趣的染色质片段。随后，通过含有半连接子的连接反应，在单个染色质复合物内被锚定在一起的DNA片段对之间形成共价连接。半连接子中侧翼的MmeI限制性内切酶位点使得在MmeI消化后能够释放出成对的末端标签-连接子-标签构建体（PETs）。由于半连接子带有生物素标记，这些PET构建体可通过链霉亲和素磁珠进行纯化。纯化后的PETs与下一代测序接头连接，并通过Illumina Genome Analyzer等下一代测序仪生成相互作用片段的目录。随后进行序列比对和生物信息学分析，以鉴定经ChIP富集的结合位点以及经ChIP富集的染色质相互作用8。
我们制作了一段视频，以展示ChIA-PET实验方案中的关键步骤，特别是ChIP的制备过程，因为ChIP的质量对ChIA-PET文库的最终结果具有重要影响。由于整个实验流程非常冗长，视频中仅展示了其中的关键步骤。
方案
A. 染色质免疫沉淀（ChIP）（见图1）
1. 染色质结合蛋白的双重交联及细胞收集
（视频 02:10 处）
染色质免疫沉淀（ChIP）是构建ChIA-PET文库所涉及的第一个关键步骤。该步骤对于降低复杂性、背景噪音并提高特异性至关重要。ChIP的制备需根据细胞类型和目标因子进行优化。本实验方案基于我们实验室构建的MCF-7细胞中RNA聚合酶II的ChIA-PET文库9。为确保最终文库具有足够的复杂性，我们建议使用1 × 108个细胞来制备ChIP材料。根据靶标和细胞系的不同，获得的产量通常在100 ng至300 ng之间。我们建议至少使用100 ng的ChIP材料来构建ChIA-PET文库，并将PCR扩增循环数控制在20个以下，以尽量减少测序过程中的冗余。使用更高量的ChIP材料可进一步降低冗余度，从而提高文库质量。
- 用预热至 37 °C 的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 1 × 108 个 MCF-7 细胞（相当于五个每皿 2 × 107 个细胞的 500 cm2 方形培养皿）两次。
- 在化学通风橱中，用新配制的 1.5 mM 乙二醇双（琥珀酰亚胺基琥珀酸酯）（EGS）于室温（22 °C）旋转孵育 45 分钟，对 MCF-7 细胞进行交联。
- 在化学通风橱中，加入 37% 甲醛至终浓度为 1%，于室温（22 °C）旋转孵育 20 分钟。
- 加入 2 M 甘氨酸至终浓度为 200 mM，以淬灭交联剂。室温（22 °C）下旋转孵育 10 分钟。
- 将淬灭的交联剂弃入废液瓶中，并用预冷的 PBS 洗涤细胞两次。
- 弃去 PBS，用刮棒收集细胞，并将收集的细胞置于冰上。用 5 ml PBS（根据制造商说明添加蛋白酶抑制剂（“+PI”））冲洗培养板，以最大程度回收细胞。
- 在 4 °C 下以 1,800 × g（3,000 rpm）离心 10 分钟，收集细胞沉淀。弃去上清液，进入细胞裂解步骤。或者，可将细胞沉淀于 -80 °C 保存。
2. 细胞裂解
（视频 04:15 处）
- 用移液器将沉淀充分重悬于15 ml 0.1% SDS 裂解缓冲液（50 mM HEPES pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS + PI）中。4 °C 旋转孵育15分钟。
- 在4 °C下以800 × g（2,000 rpm）离心10分钟，沉淀裂解后的细胞。
- 弃去上清液，并按照步骤2.1和2.2再重复一次细胞裂解。
- 所得的细胞核沉淀物可用于后续核裂解。或者，可将沉淀物在-80 °C下保存。
3. 细胞核裂解
（视频 05:00 处）
在染色质片段化之前，需进行细胞核裂解以释放交联的染色质。由于不存在核膜，交联的染色质可在较温和的条件下进行超声处理。有时，超声强度可能不足以破坏核膜，导致获得的染色质量减少，因为在离心后完整的细胞核将被弃去。然而，不同类型的细胞可能需要不同的处理条件。
- 将分离的细胞核沉淀重悬于15 ml 1% SDS裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1% Triton X-100，0.1%脱氧胆酸钠，1% SDS + PI）中。将细胞核悬液转移至高速离心管（Oak Ridge离心管（聚丙烯）），在4 °C下旋转15分钟。
- 在4 °C下以47,810 × g（20,000 rpm）离心30分钟，沉淀裂解后的细胞核。
- 倒去上清液，并用p1000移液器枪头轻轻吹打使沉淀松散。
- 用30 ml 0.1% SDS裂解缓冲液（+PI）洗涤沉淀。
- 在4 °C下旋转15分钟。
- 在4 °C下以47,810 × g（20,000 rpm）离心30分钟，沉淀染色质。
- 弃去上清液，并按照步骤3.4至3.6重复洗涤一次，然后进行染色质片段化。或者，可将染色质沉淀在-80 °C下保存。
4. 染色质片段化
（视频第 07:03 处）
- 将染色质沉淀转移至一个14 ml的聚苯乙烯圆底试管中。
- 向染色质沉淀中加入1 ml 0.1% SDS裂解缓冲液（含PI）。确保混合物中无气泡，因为气泡会影响超声处理的效率。
- 使用Branson Digital Sonifer细胞破碎仪将染色质-DNA剪切至200至600个碱基对的大小（振幅35%，总时长9分钟，工作30秒，间歇30秒），并在整个过程中保持样品低温，防止过热，建议在冷室中进行超声处理（见图2）。
- 取部分染色质进行逆转交联，并按以下步骤检测剪切效率。（以下步骤未在视频中展示）
- 超声处理后，取10 μl染色质样品。
- 在4 °C下，以16,110 × g（13,200 rpm）离心超声处理后的染色质5分钟。
- 将上清液转移至新管中，并加入2 μl蛋白酶K溶液。
- 在50 °C孵育30分钟。
- 将逆转交联后的染色质在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
- 如果DNA片段大小大于预期，则需重复超声处理。
- 将剩余的裂解液在4 °C下以16,110 × g（13,200 rpm）离心30分钟，然后将超声处理后的染色质（上清液）转移至新管中，再进行磁珠预清除。或者，可将超声处理后的染色质在-80 °C保存，直至积累足够的染色质以开始ChIP实验。
5. 抗体的洗涤、预清除及与磁珠的结合
（视频第 08:17 处）
- 染色质预清除
- 每进行一次免疫沉淀（IP），使用 300 μl 磁性蛋白 G 珠。
- 用 5 ml 珠洗涤缓冲液（PBS，0.1% Triton X-100）洗涤珠子三次。此步骤及后续所有涉及磁性蛋白 G 珠的洗涤均包括以下操作。确保磁性珠子不会干燥。
- 使用磁性粒子浓缩器回收珠子。
- 弃去上清液。
- 用缓冲液重悬珠子。
- 在 4 °C 下旋转 5 分钟。
- 在 4 °C 下以 129 × g（800 rpm）离心 1 分钟。
- 使用磁性粒子浓缩器回收珠子。
- 弃去上清液。
- 将超声处理后的染色质与预洗涤的珠子混合，以去除染色质与珠子之间的非特异性结合。
- 保留 10 μl 超声处理后的染色质作为“输入”样本，用于后续通过定量 PCR（qPCR）检测富集情况。置于 4 °C 保存。
- 在 4 °C 下旋转过夜。
- 将超声处理后的染色质在 4 °C 下以 129 × g（800 rpm）离心 1 分钟。
- 将离心管置于磁性粒子浓缩器上。
- 将抗体包被至磁性珠
- 将 300 μl 磁性蛋白 G 珠分装至新的离心管中。
- 用 5 ml 珠洗涤缓冲液（PBS，0.1% Triton X-100）洗涤珠子两次。
- 加入与步骤 5.1.3 相同体积的珠洗涤缓冲液。
- 加入 35 μg RNA 聚合酶 II（8WG16）单克隆抗体。
- 在 4 °C 下旋转过夜。
- 用 5 ml 珠洗涤缓冲液洗涤包被抗体的珠子两次。
- 使用磁性粒子浓缩器回收包被抗体的珠子。
6. 染色质免疫沉淀
（视频第10分03秒）
为了降低复杂程度和背景噪音，在邻近连接之前，使用针对特定蛋白质因子的抗体来富集感兴趣的特定染色质片段6。
本实验中，我们使用了一种小鼠RNA聚合酶II单克隆抗体（8WG16），该抗体可识别该蛋白的起始形式。通过富集与RNA聚合酶II结合的DNA片段，可提高文库的特异性，从而实现对活性启动子与其相应调控区域之间长程染色质相互作用的鉴定9。
- 使用磁性粒子浓缩器弃去抗体包被珠中的洗涤缓冲液。
- 使用磁性粒子浓缩器将超声处理后的染色质（步骤 5.1.6 的上清液）转移至抗体包被珠（来自步骤 5.2.7）中。
- 在 4 °C 下旋转孵育过夜。
7. 免疫沉淀DNA-蛋白质复合物的洗涤与洗脱
（视频第11分13秒）
- 用 5 ml 0.1% SDS 裂解缓冲液洗涤染色质免疫沉淀珠三次。
- 用 5 ml 高盐洗涤缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，350 mM NaCl，1 mM EDTA，1% Triton X-100，0.1% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS）洗涤珠子一次。
- 用 5 ml 氯化锂洗涤缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，250 mM LiCl，1 mM EDTA，0.5% Nonidet P-40，0.5% 脱氧胆酸钠）洗涤珠子一次。
- 弃去洗涤缓冲液，并用 1 ml TE 缓冲液重悬洗涤后的珠子。
- 在 4 °C 下旋转孵育 5 分钟。样品现已准备好进行定量和 ChIP 富集检测。一旦收集到足够的 ChIP 材料，即可开始构建 ChIA-PET 文库。此步骤至关重要，必须完成以确保 ChIA-PET 文库构建成功。ChIP 富集珠可在 4 °C 下储存最多 2 周，期间可进行定量、ChIP 富集检测以及积累足够材料。
- 通过以下步骤洗脱并逆转交联“input”DNA 和 ChIP 富集珠。（以下步骤未在视频中展示。）
- 用 200 μl ChIP 洗脱缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，10 mM EDTA，1% SDS）洗脱 20% 的 ChIP 富集珠。在 37 °C 下旋转孵育 30 分钟。在 4 °C 下以 6,100 × g（800 rpm）离心 1 分钟。借助磁性颗粒浓缩器将洗脱的 ChIP 复合物（上清液）转移至新管中。
- 加入 2 μl 蛋白酶 K（终浓度为 0.2 g/ml），在 50 °C 下孵育 2 小时，以逆转交联“input”样品和洗脱的 ChIP 复合物。
- 将逆转交联的“input”DNA 和洗脱的 ChIP DNA 分别转移至 2 ml MaXtract High Density 管中。在通风橱中向各管加入 200 μl 25:24:1 酚-氯仿-异戊醇（pH 7.9），颠倒混匀。在室温下以 16,110 × g（13,200 rpm）离心 5 分钟。
- 将上层水相转移至新管中，并加入 20 μl 3 M 醋酸钠（pH 5.5）、200 μl 异丙醇和 1 μl 15 mg/ml Glycoblue 沉淀逆转交联的 DNA。在 -80 °C 下孵育 30 分钟，然后在 4 °C 下以 16,110 × g（13,200 rpm）离心 30 分钟收集 DNA 沉淀。
- 异丙醇沉淀 DNA 离心后，用冰冻的 75% 乙醇洗涤 DNA 沉淀两次，并将 DNA 沉淀重悬于 20 μl TE 缓冲液中。
- 通过 PicoGreen 定量法对“input”DNA（来自步骤 5.1.3）和 ChIP DNA 进行定量10。
- 通过定量 PCR（qPCR）进行富集检测。
- 通过以下步骤洗脱并逆转交联“input”DNA 和 ChIP 富集珠。（以下步骤未在视频中展示。）
B. 使用成对末端标签测序进行染色质相互作用分析（ChIA-PET）
视频的后半部分将重点介绍构建 ChIA-PET 文库的关键步骤。
1. ChIP DNA 片段的末端钝化
本视频章节重点介绍两个要点：去除前一步反应中酶和缓冲盐的磁珠洗涤逐步操作步骤（步骤 1.1，视频时间 12:22 至 12:54），以及在反应体系中设置含磁珠的酶促反应的操作流程（步骤 1.2，视频时间 12:54 至 13:25）。
- 用预冷的 TE 缓冲液洗涤 ChIP 富集的磁珠一次。此步骤及后续涉及磁珠的洗涤均包括以下操作：
- 在 4 °C 下以 6,100 × g（800 rpm）离心 1 分钟。
- 使用磁性粒子浓缩器回收磁珠。
- 弃去上清液。
- 向磁珠中加入缓冲液。
- 通过轻弹管壁使磁珠与缓冲液充分混匀。
- 在 4 °C 下以 6,100 × g（800 rpm）离心 1 分钟。
- 使用磁性粒子浓缩器回收磁珠。
- 弃去上清液。
- 为填补超声处理后产生的突出末端，配制主混合液：加入 70 μl T4 DNA 聚合酶 10× 缓冲液、7 μl 10 mM dNTPs 和 615.8 μl 无核酸酶水。充分混匀后，将洗涤后的磁珠重悬于该主混合液中。加入 7.2 μl 浓度为 9.7 U/μl 的 T4 DNA 聚合酶，终体积为 700 μl。混匀后，在 37 °C 下旋转孵育 40 分钟（使用 Palico Biotech Intelli-Mixer RM-2L，F8，30 rpm，U=50，u=60）。所有后续酶促反应均按以下步骤进行：
- 用无核酸酶水稀释反应缓冲液。
- 将除酶以外的所有其他试剂加入稀释后的缓冲液中。
- 充分混匀。 用反应混合液重悬磁珠或沉淀物。
- 将酶加入重悬的磁珠或沉淀物中（酶应始终置于实验台上的冷却盒中，以确保最大酶活性）。
- 用 Parafilm 封口膜密封管口。
- 确保在整个孵育过程中磁珠保持充分混匀。
- 弃去反应混合液，并用预冷的洗涤缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 7.5，1 mM EDTA，500 mM NaCl）洗涤三次，以去除残留的缓冲盐和酶。
2. 将生物素化半连接子连接到 ChIP DNA
本视频章节重点介绍了在 ChIA-PET 构建过程中所使用的半接头寡核苷酸的特性，以及如何利用核苷酸条形码组成来区分非特异性与特异性连接产物（视频时间 13:28 至 14:24）。本章节还展示了半接头连接反应的逐步操作流程（步骤 2.2，视频时间 14:24 至 15:54）。
本方案中引入了两种生物素标记的半接头，其设计包含一个由四个核苷酸组成的内部条形码（TAAG 或 ATGT）以及一个用于 IIS 型限制性内切酶 MmeI（TCCAAC）的识别位点。在 ChIP 富集后，将超声处理的染色质片段均分为两份，分别与过量的半接头 A 或半接头 B 进行首次连接反应5,9。
- 将ChIP富集的磁珠分为两份，分别用于与生物素化半连接子A或半连接子B进行DNA半连接子连接。这两种半连接子的核苷酸序列相同，仅中间四个核苷酸不同（半连接子A为TAAG；半连接子B为ATGT），作为核苷酸条形码。在邻近连接过程中，通过分析含有异源二聚体AB连接子的序列群体，可识别出两个不同ChIP复合物之间的随机和非特异性连接事件；而特异性连接事件则可通过含有同源二聚体AA或BB连接子的序列群体进行识别。
- 将ChIP富集的磁珠与140 μl含PEG的5 x T4 DNA连接酶缓冲液、3.5 μl浓度为200 ng/μl的生物素化半连接子A或B、553.5 μl无核酸酶水以及3 μl浓度为30 U/μl的T4 DNA连接酶混合（T4 DNA连接酶始终置于台面冷却盒中，因为即使在冰上，连接酶也不稳定）。用封口膜密封管子，在16 °C下旋转孵育过夜。
3. ChIP DNA 片段的洗脱与邻近连接
本视频章节解释了在从磁珠中洗脱染色质复合物过程中 Buffer EB、SDS 和 Triton X-100 的作用，并展示了环化反应的逐步操作步骤（视频第 3.9 步，15:54 至 17:10）。
将半连接子连接到染色质片段后，合并两部分并从磁珠上洗脱。在邻近连接过程中，相互作用的DNA片段将通过完整的连接子序列连接在一起。
根据核苷酸条形码组成，可将序列分为三类，即含有异源二聚体AB接头的序列（条形码ATGT / TAAG）和含有同源二聚体AA或BB接头的序列（条形码TAAG / TAAG或ATGT / ATGT），以分别区分非特异性连接产物和特异性连接产物9。
因此，使用带有不同核苷酸条形码的两种半接头 linker 可以区分不同的实验或重复组，同时还能监测不同 ChIP 复合物之间非特异性嵌合连接的发生率5。
- 用预冷的洗涤缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 7.5，1 mM EDTA，500 mM NaCl）将半连接子连接的磁珠洗涤三次。
- 以下列方式合并两管半连接子连接的磁珠。
- 使用磁性颗粒浓缩器回收其中一管半连接子连接的磁珠（“Tube A”）。
- 将另一管半连接子连接的磁珠保持在冰上（“Tube B”）。
- 从Tube A中弃去洗涤缓冲液（来自步骤3.2.1），并在Tube A仍置于磁性颗粒收集器上的情况下，将来自步骤3.2.2的半连接子连接的磁珠从Tube B转移至Tube A。
- 向Tube B中加入700 μl预冷的洗涤缓冲液，以回收任何残留的半连接子连接的磁珠，并确保两管磁珠完全合并。将洗涤液转移至Tube A。弃去空的Tube B。
- 使用70 μl 10×T4 DNA连接酶缓冲液（NEB）、616 μl无核酸酶水和14 μl 10 U/μl T4 DNA多核苷酸激酶对半连接子连接的磁珠进行磷酸化。在37 °C下旋转孵育50分钟。
- 使用磁性颗粒浓缩器回收磷酸化的半连接子连接的磁珠，并弃去反应混合物。
- 用200 μl新鲜配制的洗脱缓冲液（TE缓冲液，1% SDS）洗脱半连接子连接的染色质-DNA复合物。在室温（22 °C）下旋转孵育30分钟。
- 将洗脱液转移至新管中，并用900 μl EB缓冲液冲洗磁珠。将上清液转移至同一管中以合并洗脱液。
- 将收集的洗脱液转移至两个离心过滤管的滤杯中，在室温（22 °C）下以16,110 × g（13,200 rpm）离心1分钟。
- 通过加入90 μl 20% Triton X-100并颠倒混匀以封闭SDS。在37 °C下孵育1小时。
- 环化反应在极稀释条件下进行，以促进单个交联染色质复合物内部的连接事件，同时尽量减少不同染色质复合物之间的连接，从而避免产生不需要的嵌合DNA分子。在冰上操作，将淬灭后的洗脱液转移至50 ml Falcon管中，加入7776 μl无核酸酶水、1000 μl 10×T4 DNA连接酶缓冲液（NEB）和33.33 μl 30 U/μl T4 DNA连接酶。在16 °C下孵育过夜。
4. 反向交联和DNA纯化
本视频章节展示了苯酚:氯仿抽提的逐步操作过程（步骤4.3，17:11至17:59），以及步骤4.4离心后DNA沉淀物的特写画面。
- 通过加入 100 μl 20 mg/ml 蛋白酶K溶液进行逆转交联并降解蛋白质。在 50 °C 下孵育 2 小时。
- 将染色质DNA转移至一个50 ml MaXtract High Density管中，并加入9 ml无核酸酶水，使最终体积达到19 ml。
- 在化学通风橱中向管中加入19 ml 25:24:1 酚-氯仿-异戊醇（pH 7.9），倒置混匀。在室温下以1,800 × g（3,000 rpm）离心5分钟。
- 将上层水相转移至50 ml Oak Ridge离心管（特氟龙FEP），加入1.9 ml 3 M醋酸钠（pH 5.5）、19 ml异丙醇和5 μl Glycoblue沉淀染色质DNA。Glycoblue用于增强沉淀物的可见性。
- 在-80 °C下孵育至少1小时。离心前让冷冻溶液自然解冻，然后在4 °C下以38,720 × g（18,000 rpm）离心30分钟。
- 异丙醇沉淀DNA离心后，用75%冰预冷的乙醇洗涤DNA沉淀两次，并将DNA沉淀重悬于34 μl EB缓冲液中。将DNA混合物转移至1.7 ml DNA LoBind管中。
- 将DNA沉淀重悬于34 μl EB缓冲液中。
- （RNase处理为可选步骤，因为在后续ChIA-PET流程中的洗涤和纯化步骤已可有效去除污染性RNA；我们内部文库的ChIA-PET序列经人工检查后未发现任何污染性RNA痕迹。）
- 加入10 μl RNase ONE 10×反应缓冲液、55 μl无核酸酶水和1 μl 10 U/μl RNase ONE核糖核酸酶进行RNase消化。在37 °C下孵育1小时。
- 将染色质DNA转移至2 ml MaXtract High Density管中。在化学通风橱中向管中加入100 μl 25:24:1 酚-氯仿-异戊醇（pH 7.9），倒置混匀。在室温（22 °C）下以16,110 × g（13,200 rpm）离心5分钟。
- 将上层水相转移至新管中，加入10 μl 3 M醋酸钠（pH 5.5）和100 μl异丙醇沉淀逆转交联的DNA。在-80 °C下孵育30分钟，然后在4 °C下以16,110 × g（13,200 rpm）离心30分钟收集DNA沉淀。
- 异丙醇沉淀DNA离心后，用75%冰预冷的乙醇洗涤DNA沉淀两次，并将DNA沉淀重悬于34 μl EB缓冲液中。
5. 将 ChIA-PET DNA 固定到链霉亲和素磁珠上
本章引言部分介绍了MmeI识别位点以及半连接子寡核苷酸中存在的生物素化T，这些设计有助于提取标签-连接子-标签结构（“PETs”，视频18:02至19:10）。此外，本章视频还简要概述了第5.2步、逐步建立PCR反应的操作流程（第6.1步，视频19:10至20:00），以及切取成功的ChIA-PET DNA片段的过程（第6.9步，视频20:00至20:30）。
半接头A和B含有侧翼的MmeI识别位点，使得这种IIS型限制性内切酶在其靶结合位点下游18/20个碱基对处切割，从而产生染色质片段的短“标签”，形成配对的标签-接头-标签结构（“PETs”）。
为了利用链霉亲和素包被的磁珠纯化PET构建物，两个半连接子A和B均被修饰上生物素，从而实现对ChIA-PET构建物的捕获和纯化。
- 向重悬的 DNA 中加入 5 μl 10 x NEBuffer 4、5 μl 新鲜配制的 500 μM（10 x）S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和 1 μl 2 U/μl MmeI，以释放捕获的 ChIA-PET DNA。通过向反应混合物中加入 5 μl 非生物素化半接头来淬灭过量 MmeI，因为过量 MmeI 可能会自我抑制。在 37 °C 下孵育 2 小时。
- 为捕获释放的 ChIA-PET DNA，将 50 μl 重悬的 M-280 链霉亲和素磁珠转移至一个 DNA LoBind 管中。用 2 x 结合与洗涤缓冲液（2 x B&W：10 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM EDTA，2 M NaCl）洗涤磁珠两次。将磁珠重悬于 50 μl 2 x B&W 缓冲液中，并将 50 μl 消化混合物（来自步骤 5.1）转移至同一管中。充分混匀，并在室温下旋转孵育 45 分钟。
- 使用磁性粒子浓缩器回收磁珠，并弃去上清液。用 150 μl 1 x 结合与洗涤缓冲液（1 x B&W：5 mM Tris-HCl pH 7.5，0.5 mM EDTA，1 M NaCl）洗涤磁珠两次。
- 使用 5 μl 10 x T4 DNA 连接酶缓冲液（注意：本步骤使用的连接酶缓冲液与步骤 3.9 不同，本步骤所用的连接酶缓冲液应与 T4 DNA 连接酶为同一供应商提供）、4 μl 200 ng/μl 454 GS20 接头 A、4 μl 200 ng/μl 454 GS20 接头 B、36 μl 无核酸酶水和 1 μl 30 U/μl T4 DNA 连接酶，将 454 GS20 接头连接至 ChIA-PET DNA。在 16 °C 下旋转孵育过夜。ChIA-PET DNA 也可与 Illumina-NN 接头进行连接，此时建议使用从 Illumina 购买的 PCR 引物 PE1.0 和 PCR 引物 PE2.0 对文库进行 PCR 扩增。
- 使用磁性粒子浓缩器回收磁珠，并弃去上清液。用 150 μl 1 x B&W 缓冲液洗涤磁珠三次。
- 使用 5 μl 10 x NEBuffer 2、2.5 μl 10 mM dNTPs、38.5 μl 无核酸酶水和 4 μl 10 U/μl 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 对 ChIA-PET DNA 进行切口平移。在室温（22 °C）下旋转孵育过夜。
- 使用磁性粒子浓缩器回收磁珠，并弃去上清液。用 150 μl 1 x B&W 缓冲液洗涤磁珠三次。
- 用 50 μl Buffer EB 重悬磁珠。
6. ChIA-PET DNA 的扩增
- 使用 2 μl 磁珠悬浮液、21 μl 无核酸酶水、1 μl 10 μM Illumina 1-454 引物、1 μl 10 μM Illumina 2-454 引物以及 25 μl Phusion High Fidelity Master Mix 配置 PCR 反应体系。
- 为确定生成足够测序量 PCR 产物所需的循环数，设置三个测试 PCR 反应，分别进行 16、18 和 20 个循环。循环数不得超过 20，因为我们发现超过此数值会导致文库复杂度极低。
| 初始步骤 | 30 秒 | 98 °C | （变性） |
| 18 到 25 个循环 | 10 秒 | 98 °C | （变性） |
| 30 秒 | 65 °C | （退火） | |
| 30 秒 | 72 °C | （延伸） | |
| 最终步骤 | 5 分钟 | 72 °C | （最终延伸） |
- 通过在4-20%梯度TBE凝胶上进行PCR反应并用SYBR Green I染色，确定最低可能的循环数，确保出现一条223个碱基对的条带，该长度即为ChIA-PET DNA的长度。
- 对其余结合在链霉亲和素磁珠上的ChIA-PET DNA进行大规模PCR扩增，在获得足够测序产量的前提下，使用尽可能少的PCR循环次数。
- 使用磁性粒子浓缩器回收所有PCR反应中的磁珠，并将上清液合并至两个新的DNA LoBind离心管中。向合并后的反应液中每管加入60 μl 3 M醋酸钠、2 μl GlycoBlue和600 μl异丙醇，对上清液进行沉淀。
- 在-80 °C孵育30分钟。在4 °C下以16,110 × g（13,200 rpm）离心30分钟。
- 异丙醇沉淀DNA离心后，用75%预冷乙醇洗涤DNA沉淀两次，并将DNA沉淀重悬于100 μl TE缓冲液和5 μl 6×上样染料中。
- 将PCR产物均匀地加入6% TBE凝胶的加样孔中。在1× TBE缓冲液中以200 V电压电泳35分钟，并用SYBR Green I染色。使用Dark Reader凝胶成像系统观察凝胶。
- 小心地从凝胶中切下223 bp的条带，并按以下步骤进行“凝胶压碎”DNA提取：
- 将切下的凝胶碎片放入已用21号针头在底部刺孔的0.6 ml微量离心管中。
- 将每个小管放入一个1.5 ml螺口离心管中，在4 °C下以16,110 × g（13,200 rpm）离心5分钟。
- 向每个小管中加入200 μl pH 8.0的TE缓冲液，确保凝胶碎片完全浸没在缓冲液中。
- 在-80 °C冷冻1小时，然后在37 °C孵育过夜。
- 将每个小管中的凝胶碎片连同缓冲液一起转移至离心过滤管的滤杯中，在4 °C下以16,110 × g（13,200 rpm）离心10分钟。
- 用200 μl pH 8.0的TE缓冲液冲洗每个1.5 ml离心管，并在第一次离心完成后将冲洗液转移至相应的滤柱单元中。
- 收集滤过液，并用异丙醇沉淀DNA。
- 用15 μl TE缓冲液重悬DNA沉淀。
7. ChIA-PET DNA 的质控与扩增
- 使用安捷伦 Bioanalyzer 2100 上的 Agilent DNA 1000 Assay 或 Agilent High Sensitivity DNA Assay 进行质量检查。
- 在进行 Illumina Genome Analyzer IIx 测序之前，Agilent DNA 检测的电泳图应仅显示一个峰，并具有平坦的基线。
- 在进行 Illumina Genome Analyzer IIx 测序之前，ChIA-PET DNA 的理想浓度应至少为 10 nM。根据 Illumina qPCR 定量分析方案指南，进行四点定量 PCR，以确定加载到流动池中的样本量。或者，按以下方式执行单点定量 PCR：
- 将对照模板稀释至 100 pM、10 pM 和 1 pM。根据 Illumina qPCR 定量分析方案，对照模板定义为在 Illumina 平台上用于测序的任何文库，其模板大小、GC 含量和文库类型应尽可能相似。
- 将 ChIA-PET DNA 稀释至 10 pM。
- 使用 Roche Applied Science LightCycler 480 实时荧光定量 PCR 系统，为每种稀释液设置三重 PCR 重复，反应体系包含：0.1 μl qPCR 引物 1.1、0.1 μl qPCR 引物 2.1、5 μl LightCycler480 DNA SYBR Green I Master Mix、3.8 μl 无核酸酶水和 1 μl 模板。设置两个阴性对照，以 1 μl 无核酸酶水作为模板。
- 初始变性
- 95 °C 5 分钟 4.8 °C/s
- 扩增
- 95 °C 10 秒 4.8 °C/s
- 60 °C 1 分钟 2.5 °C/s
- 72 °C 30 秒 4.8 °C/s
- 熔解曲线
- 95 °C 5 秒 4.8 °C/s
- 65 °C 1 分钟 2.5 °C/s
- 95 °C 每 °C 采集 5 次
- 冷却
- 40 °C 10 秒 2.0 °C/s
- 初始变性
- 确保阴性对照无扩增信号，且基于对照模板稀释液生成的标准曲线计算文库模板浓度前，Ct 值的标准偏差小于 0.1。
- 根据屏幕提示，将 1.5 pM 样品加载至 Illumina cBot Cluster Generation System，在 Illumina 流动池表面生成簇。
- 使用 Illumina 3-454 测序引物和 Illumina 4-454 测序引物，在单个通道中对 ChIA-PET DNA 进行 Illumina Genome Analyzer IIx 测序，以评估文库质量。将剩余的 ChIA-PET DNA 储存于 -20 °C。若文库数据良好，可根据样本通道结果，准备额外 4 至 8 个通道的测序，以获得 1800 万至 2000 万条唯一序列读段。
- 加载至流动池的 ChIA-PET DNA 量在很大程度上取决于测序数据分析软件 Illumina Sequencing Control Studio 的版本。对于 2.9 版本，加载浓度范围为每个 tile 最大容量的三分之一至二分之一，相当于约 2100 万条通过过滤的读段，其中约 950 万条为 PET 读段。
- 需降低加载浓度，以确保连接子条形码序列的碱基识别准确。当大量相似核苷酸被测序时（例如测序连接子以获取条形码信息），易发生此类错误。若无需条形码信息且不读取连接子序列，则可使用全浓度加载。
- 由离线碱基识别程序转换生成的 qSeq 文件，可依据 ChIA-PET 工具安装手册（版本 4.1）8 使用 ChIA-PET 工具进一步分析。
C. ChIA-PET 实验结果的代表性示例
我们使用MCF-7细胞（CHM160和CHM163）中的RNA聚合酶II抗体（8WG16）成功构建了ChIA-PET文库9，ChIP起始材料用量为672 ng，具体方法如上所述。根据ChIA-PET实验方案第6.2步所述，对该PCR扩增文库进行初步诊断性凝胶电泳，结果显示在所有PCR循环条件下，均在预期的223个碱基对大小处出现明亮且条带清晰的特异性条带（见图4）。
采用16个PCR循环扩增ChIA-PET文库，获得总量为17.1 ng的产物。通过Agilent DNA 1000分析，在预期大小223个碱基对处观察到单一且强烈的电泳峰，如ChIA-PET实验方案第7.1步所述（见图5）。
图 1. 染色质免疫沉淀（ChIP）流程概览。 MCF-7 细胞依次使用 EthylGlycol bis(SuccinimidylSuccinate)（EGS）和甲醛进行双重交联，从而在空间邻近的染色质之间形成共价连接。通过细胞裂解和细胞核裂解从固定的 MCF-7 细胞中获取交联的染色质。随后将染色质片段化至 200–600 个碱基对的大小范围。将超声处理后的染色质用 Protein G 磁珠进行预清除，以去除非特异性 DNA 后，再与抗体包被的磁珠在 4°C 下孵育过夜，以富集目标染色质片段。
图2. 超声处理后染色质片段的凝胶分析。 第一和最后一泳道显示100 bp DNA Ladder，作为大小参照。超声处理后的染色质在200至600 bp范围内显示出强条带信号，此片段大小非常适合捕获远距离染色质相互作用。
图 3. ChIA-PET 概述。 碎片段染色质经末端修复后，与含有侧翼 MmeI 限制性酶切位点的生物素化半接头连接。完整的染色质复合物随后从磁珠上洗脱，并在极低浓度条件下进行邻近连接，使相互作用的 DNA 片段优先彼此连接。经逆转交联去除与 DNA 结合的蛋白质后，进行 MmeI 消化以释放标签-接头-标签（PET）结构，随后通过链霉亲和素磁珠的选择性结合进行纯化。PET 结构随后连接接头，用于高通量测序。
图4. PCR扩增后ChIA-PET文库的凝胶分析。 第1道和第5道显示25 bp DNA标记物，用于大小参照。第2至第4道分别为使用2 μl磁珠固定模板，经16、18和20个PCR循环扩增后获得的PCR产物。该文库构建成功，表现为在预期大小223 bp处出现明亮且清晰的条带。当PCR循环次数增加时，会产生非特异性弥散条带，而每个PCR反应中最下方的小分子量条带则由引物二聚体构成。
图 5. 纯化后的 Illumina-454 接头连接 ChIA-PET 的 Agilent 2100 生物分析仪分析结果。 Agilent 2100 生物分析仪电泳图谱的屏幕截图，显示一个构建成功的文库，在预期大小 223 bp 处出现单一强峰。需注意，Agilent 生物分析仪检测通常报告的大小略高于预期值；本例中，目标峰显示为 237 bp 而非 223 bp，这在 Agilent 检测方法的 10% 误差范围内。
讨论
ChIA-PET 是一种用于鉴定转录调控中远距离相互作用的方法。决定 ChIA-PET 文库质量的关键因素之一是 ChIP 样品的质量。
视频中展示的方案采用了EGS和甲醛对细胞进行交联。使用甲醛并结合另一种具有较长间隔臂的交联试剂，可能有助于捕获仅用甲醛无法交联的蛋白质相互作用。 3,11,15我们已利用该方法构建了文库，这些文库展现出稳定的结合位点和远距离相互作用 9然而，对于每种目标因子，均需优化交联和染色质免疫沉淀（ChIP）条件，且应避免过度交联，因为过度交联会导致超声破碎困难，并可能产生虚假的染色质相互作用。通过ChIA-PET鉴定出的染色质相互作用应采用其他方法进行验证，例如荧光原位杂交 原位 杂交 4.
我们建议染色质材料的起始量至少为 100 ng。尽管我们已成功使用 50 ng 染色质材料构建出高质量的文库，但我们发现，使用较大量的起始材料可使 ChIA-PET 文库构建所需的 PCR 循环数少于 16 个，从而最大限度地减少扩增子和文库冗余。这种较低的冗余度与较高的唯一比对标签数以及较高比例的可用数据相关，因此能够在更少的测序通道下获得更全面的染色质相互作用图谱。每管中磁珠的最终压实体积应分别为：磁性磁珠 50 μl，Sepharose 磁珠 100 μl。如果压实体积低于上述数值，应加入经同样预清除处理的空白磁性磁珠或 Sepharose 磁珠补足至最低压实体积，以减少后续步骤中携带 DNA 的磁珠损失。移液操作 Sepharose 磁珠时，应使用剪切过的吸头或大孔径吸头。
在先前发表的 ChIA-PET 方案5基础上，我们进行了以下改进。首先，采用磁性 G 珠以减少洗涤过程中的样品损失。此外，我们发现大小约为 100 bp 和 138 bp 的非特异性条带来源于自连接的半接头和/或接头的扩增产物。因此，我们降低了生物素化半接头和 454 GS20 接头的浓度，以减少 PCR 扩增过程中非特异性条带的产生。邻近连接反应体系从 50 ml 减少至 10 ml，以降低后续纯化步骤中的样品损失并节约试剂成本。我们还延长了 ChIA-PET DNA 与磁珠结合的孵育时间，以确保链霉亲和素磁珠对 ChIA-PET DNA 的最大捕获效率。
在邻近连接步骤中，不可避免地会以非特异性和随机的方式产生不代表真实体内染色质相互作用的嵌合连接产物。因此，为了评估任何ChIA-PET实验数据的质量，可通过使用两种带有特定核苷酸条形码TAAG和ATGT的半连接子来估算嵌合率5。高通量测序后，首先分析ChIA-PET序列中的连接子条形码组成，从而区分来自特异性连接产物和非特异性连接产物的序列8。我们实验室构建的MCF-7 RNA聚合酶II ChIA-PET文库中已知嵌合体（即异源二聚体AB连接子）所占比例低于15%。
ChIA-PET 序列随后被分为两类，即自连接 PET 和互连接 PET。自连接 PET 来源于染色质片段的自环化连接，而互连接 PET 则来源于两个不同 DNA 片段之间的连接。后者进一步根据同一染色体上两个标签之间的基因组距离（染色体内互连接 PET）或两个标签分别比对到两个不同染色体的情况（染色体间互连接 PET）分为三种不同类别。我们开发了一个 ChIA-PET 工具软件包，用于对这些不同类别的序列进行分类8。分类将基于文库中的 DNA 片段进行。通常情况下，较小的 ChIP 片段可提供更高的分辨率，对于这些 RNA 聚合酶 II ChIA-PET 文库，片段大小的截断值约为 4 kb。
此外，通过计算相互连接簇中成对末端标签（PET）的数量，可以将真实的染色质相互作用与随机噪声区分开来；换句话说，PET数量较高的簇更有可能代表真实的染色质相互作用8。
为了过滤因高度富集的锚点随机形成分子内连接PET而产生的假阳性，还建立了一套统计分析框架，用于评估任意两个锚点之间随机形成分子内连接PET的可能性8。
综上所述，ChIA-PET 技术能够在全球范围内绘制染色质相互作用网络。ChIA-PET 中的 ChIP 步骤可降低文库复杂性和背景噪声。此外，ChIP 能够增强染色质相互作用的特异性，从而实现对特定转录因子相关的染色质相互作用进行分析5。
致谢
作者由新加坡科技研究局（A*STAR）提供支持。此外，M.J.F. 获得新加坡科技研究局国家科学奖学金、欧莱雅女性科学奖国家奖学金以及李光耀博士后奖学金的支持。Y.R. 获得美国国立卫生研究院（NIH）ENCODE 项目资助（资助号：R01 HG004456-01 和 R01 HG003521-01）。作者还感谢新加坡 8 Pixels Productions 摄制团队，特别是 Kelvin Issey 先生、Chang Kai Xiang 先生和 Sherwin Gan 先生负责拍摄工作，Siti Rahim 女士负责视频剪辑，以及 Michelle Teo 女士负责配音工作。
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