早期检测凋亡可识别多种疾病中的高风险细胞群体。本文展示了一种将早期凋亡检测蛋白（Annexin V）与磁共振成像可检测的氧化铁纳米颗粒（SPIO）相连接的方法。该方法可拓展至其他目标蛋白，以构建磁共振成像可检测的分子成像探针。
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本文内容
摘要
摘要
细胞凋亡是多种疾病的显著特征，这种程序性细胞死亡通常发生在疾病临床表现出现之前。若能在凋亡最早期、可逆阶段对其进行检测，将提供一个“窗口期”，在此期间可采取预防或治疗措施，以保护心脏免受永久性损伤。本文介绍一种简单且稳健的方法，将可特异性结合处于凋亡最早期、可逆阶段细胞的人源Annexin V（ANX）蛋白，与超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒偶联，后者可作为磁共振成像（MRI）可检测的对比剂。该偶联方法首先对SPIO纳米颗粒进行氧化处理，以氧化其多糖外壳上的羧基。随后在硼酸钠溶液条件下加入纯化的ANX蛋白，促进ANX在还原性缓冲液中与SPIO发生共价结合。最后通过硼氢化钠进行还原反应，并终止反应。未偶联的ANX蛋白通过微量离心过滤法从混合物中去除。采用动态光散射（DLS）技术验证ANX-SPIO偶联产物的粒径和纯度。该方法无需对多糖SPIO外壳进行添加或修饰，不同于交联氧化铁颗粒偶联方法或生物素标记纳米颗粒方法。因此，该方法是一种简单、稳健的技术，可拓展应用于其他目标蛋白的偶联。
方案
改编自先前研究1。
1. 将膜联蛋白V与超顺磁性氧化铁纳米颗粒偶联
- 将SPIO颗粒（Ocean Nanotech Inc.，5 mg/mL）与0.15 M高碘酸钠（NaIO4）溶液按4:1（质量比）混合，在20 °C避光条件下氧化1小时2。
- 将氧化后的SPIO与纯化的ANX蛋白（1:1，质量比）在0.15 M硼砂（Na2B4O7·10H2O）溶液中于20 °C孵育12小时。
- 在通风橱中加入硼氢化钠（NaBH4）进一步还原反应体系1小时，随后用0.15 M Tris-HCl终止反应。
- 通过离心（14,000 × g，75 μm孔径Microcon滤膜，Millipore，Billerica，MA）将游离的ANX蛋白与ANX-SPIO结合物分离。
- 使用磁性分离装置（Ocean Nanotech, Inc.）进一步去除未结合的杂质，纯化复合物。
- 采用Bradford蛋白定量法测定滤膜截留物（ANX-SPIO）中的蛋白浓度，并将样品溶于含1%血清白蛋白和蛋白酶抑制剂（Halt Protease Inhibitor，Thermo Scientific，1-50 mg/mg ANX）的0.1 M Tris-HCl缓冲液中，浓度调至2 mg/mL，于-80 °C保存。
2. 动态光散射
- 分别将SPIO和ANX-SPIO用PBS稀释至光密度为0.1，并使用Zetasizer Nano DLS仪器（Malvern Inc., Worcestershire, UK）进行动态光散射分析3。
- 应获得该化合物的单峰分布（理想情况下），并测定其Z均粒径和多分散系数（PDI）。将此粒径与单独的氧化铁纳米颗粒的DLS测量粒径进行比较。ANX-SPIO的DLS结果显示，偶联物颗粒的流体动力学直径为78 nm，PDI为0.131，表明ANX-SPIO具有均一性3。
3. 细胞培养、培养条件下细胞凋亡的诱导及培养细胞的磁共振成像
- 在DMEM培养基中培养成年小鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs），培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Invitrogen, Inc.），建议使用第20至30代的细胞4。
- 通过在37 °C下用DOX（Sigma，0.9%生理盐水中1 mM，培养基中终浓度为1 μM）处理不同时间，诱导培养细胞发生凋亡12。
- 使用MRI结合ANX-SPIO（如下文3.4所述）或TUNEL染色后显微镜观察（APO-BrdUTM TUNEL Assay Kit，Molecular Probes/Invitrogen，Eugene, OR）或ANX-FITC染色后显微镜观察（Roche，Switzerland），定量测定培养细胞中的凋亡程度。
- 将细胞与ANX-SPIO（除特别注明外，10 mg蛋白/mL培养基）或等量游离SPIO（5 mg）在37 °C孵育15分钟进行标记。用PBS洗涤4次，并覆盖1 mL的1%琼脂糖以防止SPIO纳米颗粒扩散。对培养皿进行MRI检测（如下文所述）。或者，在DOX和ANX-SPIO标记后洗涤细胞并用胰酶消化，然后使细胞在Eppendorf管中形成细胞沉淀。
4. 体外 磁共振成像
- 使用配备标准膝关节接收线圈的1.5或3特斯拉GE Signa EXCITE扫描仪 体外 MRI分析。
- 将培养皿或试管放入琼脂仿体中，使用梯度回波扰相梯度序列进行成像：重复时间（TR）550 ms，回波时间（TE）10 ms，翻转角 15°矩阵 256 × 256，视野 3 cm × 3 cm，层厚 1.3 mm，平均次数（NEX）2，间距 0 mm5在平板上沿细胞层轴向成像，检测T2*信号丢失，使用固定面积的感兴趣区域（ROI）（例如，0.8 mm）2）。使用琼脂体模的对照ROI信号进行背景校正。通过体模周围空气的信号测量背景噪声。
- 为每个培养皿计算磁共振成像对比度-噪声比（CNR：[样本ROI的信号强度-对照ROI的信号强度]/[背景噪声信号强度的标准差]，其中SI表示信号强度，SD表示标准差）。
5. 代表性结果
T2*信号衰减的测量 体外 需要均匀的琼脂凝胶体模，且不能有气泡，因为气泡会产生信号缺失伪影。该伪影难以与SPIO的真实T2*信号衰减相区分，对结果的可解释性至关重要。请参见 图1 空气伪影以及真正的氧化铁T2*信号丢失的示例。
对于 体外 培养皿成像，向每个培养皿中加入适量的琼脂凝胶，以便获得足够数量的轴向 MRI 层面（厚度约为 1 mm），从而充分覆盖并成像整个培养皿。 图2 展示了琼脂中单个培养皿的预期MRI信号。培养皿边缘通常存在一定的信号变异，因此在分析感兴趣区域时应避开这些不均匀区域。
图1. ANX-SPIO 可检测培养的新生大鼠心肌细胞中的细胞凋亡。 图1A 显示经对照溶液（左管）、ANX-SPIO（中管）和DOX+ANX-SPIO（右管）处理的新生心肌细胞沉淀的照片。注意DOX+ANX-SPIO处理组细胞呈棕褐色，反映出凋亡细胞中ANX-SPIO化合物的滞留增加。 图1B 体外 MRI 图像显示 DOX+ANX-SPIO 细胞存在显著的 T2* 信号丢失。此外，在 4 之间的区域可见一个气泡th 和 5th Eppendorf管（微小的黑色信号缺失），其信号缺失与ANX-SPIO相似，可能影响CNR的分析。
图 2. ANX-SPIO 在培养条件下特异性结合凋亡细胞。图 2A 显示培养皿中凋亡的大鼠新生心肌细胞，经 ANX-FLUOS 染色或 ANX-SPIO 染色处理，ANX-SPIO 浓度分别为低浓度和高浓度（左、右）。注意经荧光 Annexin（ANX-FLUOS）染色的凋亡细胞在低浓度与高浓度 ANX-SPIO 条件下表现出不同的 T2* 信号减弱（黑色信号）。右侧 T2* 信号减弱增强，同时伴随 ANX-FLUOS 信号显著降低，表明高浓度 ANX-SPIO 竞争性取代了 ANX-FLUOS 的结合。图 2B 展示 ANX-SPIO 与 ANX-FLUOS 信号之间的竞争性结合关系及解离常数 Ki。横轴表示 Annexin 蛋白浓度，采用对数刻度。
视频 1. 点击此处查看补充视频。
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讨论
所述将超小超顺磁性氧化铁（SPIO）与膜联蛋白V（Annexin V）连接的偶联方法，利用了膜联蛋白的侧链氨基和SPIO纳米颗粒的羧基部分。通过特定的氧化-还原步骤，可实现这些化合物之间的共价连接，并分离得到功能化的纳米颗粒。该方法可推广应用于其他感兴趣的蛋白质和纳米颗粒。
最关键的步骤是氧化和还原条件，需在适当的温度下并伴随轻柔混匀进行。产率偏低可能是由于氧化或还原不完全所致，这会导致残留的游离Annexin V，在过滤步骤中被去除。当该方法应用于其他目标蛋白时，最佳条件可能与上述描述有所不同。然而，一旦确定了最佳条件，过滤后残留的游离蛋白可能减少至可忽略的水平，因此微型离心过滤步骤可能变得多余。事实上，过度过滤可能因非特异性结合到滤膜本身而降低最终偶联产物的产率。若发生此情况，可预先用1%白蛋白通过滤膜进行预过滤，以减少偶联产物在滤膜上的非特异性结合，从而提高产率。对最终产物进行DLS分析，以及对滤液进行蛋白浓度测定，将有助于判断是否存在残留的游离蛋白。
最终化合物中游离的SPIO也可能是潜在污染物。为此，采用动态光散射（...
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致谢
美国国立卫生研究院，国家心肺血液研究所（RD, PY, PS）。
美国心脏协会 (JL)。
斯坦福大学，本科生研究教育项目资助（JL）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 超顺磁性氧化铁 | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 | |
| 阿霉素 | Sigma | D1515-10MG | |
| SuperMag 分离器 | Ocean Nanotech, Inc. | N/A | |
| Zetasizer Nano DLS 仪器 | Malvern, Inc | N/A |
参考文献
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