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通过过继转移与抗原攻击克服实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）抵抗性小鼠品系的无应答状态

DOI：

10.3791/3778

⸱

2012年4月9日

 ,  , 
1Department of Medicine, Section of Cardiology, St. John-Providence Health System, 2Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

某些小鼠品系能够抵抗以髓鞘碱性蛋白诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。本文介绍了一种简单的免疫接种方案，可逆转这些小鼠品系的无反应状态，并在多种典型的EAE抗性小鼠品系中诱导出麻痹性疾病。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种中枢神经系统（CNS）的炎性疾病，已被用作研究人类脱髓鞘疾病多发性硬化症（MS）的动物模型。EAE的特征是单核细胞病理性浸润中枢神经系统，并出现瘫痪性疾病的临床表现。与MS相似，EAE也受到遗传控制，即某些小鼠品系易感该疾病，而其他品系则具有抗性。通常情况下，用髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫的C57BL/6（H-2b）小鼠不会出现瘫痪症状。这种无反应性显然并非由于MBP抗原加工或抗原呈递缺陷所致，因为本文所描述的一种实验方案已成功用于在C57BL/6小鼠以及其他公认具有抗性的小鼠品系中诱导出严重的EAE。此外，已成功分离并扩增了来自C57BL/6和Balb/c小鼠、对MBP有反应的致脑炎性T细胞克隆。

实验方案涉及使用一种细胞过继转移系统，其中将MBP致敏的（200 μg/小鼠）C57BL/6供体淋巴结细胞分离，并在抗原存在下培养五天，以扩增MBP特异性T细胞群体。培养结束后，通过尾静脉将5000万个活细胞转移至未经处理的同系受体小鼠体内。经此处理的受体小鼠通常不会发生实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），从而再次证实其抵抗表型，且可长期保持正常状态。细胞转移后第10天，受体小鼠在两侧 flank 区域的四个位点接受完全弗氏佐剂（CFA）乳化的MBP攻击。这些小鼠在攻击后10至14天开始出现严重的EAE症状。结果显示，疾病诱导具有抗原特异性，因为使用无关抗原进行攻击不会引发疾病的临床体征。值得注意的是，通过对抗原攻击剂量进行滴定实验表明，低至5 μg/小鼠的剂量仍可诱导疾病。此外，对抗原攻击时间点的动力学研究表明，早在细胞转移后5天或长达445天以上进行抗原攻击，均能有效诱导疾病。这些数据强烈提示存在一个“长寿”的T细胞群体参与维持免疫无应答状态。然而，该系统中调节性T细胞（Tregs）的作用尚未明确。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 准备CFA乳化抗原

  1. 将豚鼠MBP（按照Swanborg1的方法制备，并以冻干形式在4 °C下保存）溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为2 mg/mL。若使用合成的MBP多肽（MBP60-80，S H H A A R T T H Y G S L P Q K S Q R）2，则配制成2 mg/mL的溶液。将适量抗原溶液（每只待免疫小鼠0.1 mL）吸入一支带有鲁尔锁扣的玻璃注射器中。
  2. 在另一支带有鲁尔锁扣的玻璃注射器中，吸入与抗原溶液体积相等的完全弗氏佐剂H37Ra（0.1WT%）（CFA，Difco Laboratories）。
  3. 用一个三通旋塞将两支玻璃注射器连接起来。通过来回推动活塞，将MBP溶液与CFA混合。持续操作，直至形成乳剂。
  4. 为检测乳剂是否形成，将全部混合物推入其中一支注射器中。断开空的注射器，将活塞稍向后拉，挤出一滴残留乳剂至室温下的洁净水杯中。若乳剂滴在水面保持完整不散开，则表明乳剂已形成；若乳剂滴在水中扩散，则需重新连接注射器并继续混合操作。
  5. 使用1 mL塑料注射器进行免疫接种，以确保准确给予抗原剂量。为将抗原乳剂转移至塑料注射器，先拔出活塞，然后将空的塑料注射器插入三通旋塞的开口端，该位置即为步骤1.4中断开的玻璃注射器所在处。
  6. 通过推动玻璃注射器的活塞，将乳剂填充至塑料注射器的顶端。重新插入塑料注射器的活塞，再推动活塞排出多余乳剂，直至塑料注射器上的液面降至1.2 mL刻度处。此操作可确保塑料注射器内无气泡残留。
  7. 从三通旋塞上取下塑料注射器，将一支26号针头连接至塑料注射器上。推动活塞至1 mL刻度处，使乳剂充满针头的空隙体积。

2. 供体小鼠的免疫

注意：通常按照美国国立卫生研究院 McFarlin 研究组最初设计的方法3，在雌性 C57BL/6 小鼠的两侧 flank 区四个位点注射抗原乳剂。对于有经验的研究人员，可由一人独立完成全部操作；对于初学者，可寻求协助，由一人固定小鼠，另一人进行注射。或者，也可在麻醉状态下对小鼠进行注射。

  1. 用一只手牢固地抓住小鼠颈部的皮肤，另一只手将尾巴固定在手指之间th 和 5th 手指张开，使胸腹部易于接触。
  2. 将1 mL塑料注射器的针头置于小鼠右侧腋窝稍上方的胸部位置，皮下注射0.05 mL抗原乳剂。透过浅色皮肤可观察到白色CFA形成的轻微隆起。同样方法重复注射于左侧腋窝稍上方的胸部位置。
  3. 松开尾巴，抓住小鼠的右脚，将其翻转并夹在第4指th和 5th 手指。在右侧肋骨下方的部位定位注射点，注入0.05 mL抗原乳剂。
  4. 松开右脚，将小鼠调转方向，用左手握住小鼠的左脚th 和 5th 手指。在左侧肋缘下方的 flank 部位找到注射位点，注入 0.05 mL 抗原乳剂。
  5. 每注射10只小鼠后更换新针头，或在针头变钝时及时更换。

3. 免疫后7至10天淋巴结细胞的分离用于组织培养

  1. 免疫后7至10天，处死小鼠并取出引流淋巴结。推荐的安乐死方法为CO2吸入法。处死后，将小鼠仰卧于解剖板上，四肢伸展并用图钉固定。用70%乙醇喷雾润湿小鼠体表。
  2. 使用无菌剪刀和镊子，从腹部下端沿中线向上至下颌作一纵向皮肤切口。
  3. 从腹股沟区域向下沿两侧大腿切开腹部皮肤。将皮肤剥离并用图钉固定，暴露腹股沟淋巴结。
  4. 沿前肢（左右两侧）切开皮肤，以便剥离并固定皮肤，暴露腋窝附近的腋下淋巴结。
  5. 使用两对镊子协同操作，分离覆盖和环绕腹股沟淋巴结的结缔组织。清除结缔组织后，将一对镊子置于淋巴结下方，将其从机体分离。将分离的淋巴结放入盛有无菌PBS的35 mm培养皿中。
  6. 使用两对镊子分离覆盖两个腋下淋巴结的结缔组织。分离淋巴结后将其放入培养皿中。操作时需格外小心，避免损伤穿过该区域的血管，以免出血影响淋巴结的识别。
  7. 收集全部淋巴结后，将培养皿转移至生物安全柜中。用两对镊子轻轻撕碎并分散淋巴结组织，相互研磨。也可使用3 mL塑料注射器的推杆平端，在培养皿底部按压淋巴结进行破碎。
  8. 将分散后的淋巴结细胞悬液通过尼龙网筛过滤，以去除膜状物和碎片。
  9. 用无菌PBS将淋巴结细胞悬液补至50 mL。以1000 rpm离心10分钟。弃上清，将沉淀重悬于培养基中。进行活细胞计数，并调整细胞浓度至4 × 106 个/mL。使用含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM MEM丙酮酸钠、0.1 mM MEM非必需氨基酸、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10 mM HEPES缓冲液和5 × 10-5 M 2-巯基乙醇（2-ME）的RPMI 1640培养基。重悬细胞前需预先将培养基温育至适宜温度。
  10. 将细胞接种于24孔培养板中，每孔2 mL（最终细胞浓度为8 × 106 个/孔）。向每孔加入抗原，终浓度为100 μg/mL。将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中，培养5天。

4. 培养开始5天后收获培养的淋巴结细胞

  1. 使用巴斯德玻璃移液管或小体积移液器，通过反复吹打混匀每个孔中的细胞。将细胞收集至50 mL离心管中。
  2. 以1000 rpm离心10分钟。用少量PBS重悬细胞沉淀。
  3. 计数细胞，并用无菌PBS将活细胞浓度调整至2.5 × 108 个细胞/mL。将细胞悬液吸入配有26号针头的注射器中。
  4. 在受体小鼠笼子上方放置加热灯，以帮助扩张尾静脉。
  5. 使用小鼠固定器，将小鼠尾巴从固定器的狭缝中拉出并伸直。牵拉以充分伸展尾巴，定位静脉。
  6. 每只小鼠注射0.2 mL细胞悬液，相当于5 × 107 个细胞。

5. 细胞转移后20天对受体小鼠进行抗原攻击及疾病症状的产生

  1. 对未表现出疾病症状的受体小鼠进行抗原攻击。操作步骤与第2节“供体小鼠免疫”中的方法相同。
  2. 抗原攻击后7至10天观察瘫痪性疾病的发展情况。
    1. 疾病最初表现为尾巴无力。当尾巴变得松弛时，疾病评分为1分；当小鼠一条后肢瘫痪时，评分为2分；当双侧后肢均瘫痪，且小鼠向前爬行时拖动双侧后肢，评分为3分；当小鼠双侧前肢失去功能，导致完全无法移动时，评分为4分；当小鼠处于濒死状态，身体蜷缩时，评分为5分；死亡记为6分4。
  3. 按照本方案在C57BL/6小鼠中诱导的MBP特异性实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）为单相型。小鼠可能从疾病中恢复，但不会发生自发性复发。

6. 典型结果

接受过预先致敏并在体外扩增的供体淋巴结细胞的小鼠未出现实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）疾病症状，表明其对疾病诱导具有抵抗性。然而，在抗原攻击后，小鼠出现了严重疾病（表 I），证明抗原攻击能够逆转这种抵抗机制。抗原攻击诱导疾病时有两个显著特征：抗原剂量以及攻击的时间动力学。如表 III所示，仅需极低剂量的抗原即可诱导疾病。令人意外的是，即使在一年前接受供体细胞的小鼠，经抗原攻击后仍可发展为严重疾病（表 IV）。这两个观察结果强烈提示“长寿”T细胞在维持EAE抵抗性中发挥了作用。本方案适用于多种EAE抵抗性小鼠品系4。

MBP-CFA 诱导 EAE 过程示意图；从淋巴结到体外培养；细胞转移至小鼠。
图 1. 在公认抵抗性小鼠品系中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验设计流程图。

  过继转移后
临床EAE		抗原攻击后
临床EAE
品系抗原 发病率平均疾病评分
（范围）		平均发病时间
（范围）		发病率平均疾病评分
（范围）		平均发病时间
（范围）
SJLMBP21/214.0 (3-5)8.0 (6-10)N.D.N.D.N.D.
C57BL/6MBP0/10- -- -7/73.85 (3-5)9.28 (9-10)
Balb/cMBP0/7- -- -5/53.2 (3-4)7.0 (7)
C3H/HeJMBP0/7- -- -4/43.2 (3-4)8.0 (8)
C57BL/6MBP60-800/4- -- -4/42.75 (2-4)10.2 (9-11)

表 I。MBP介导的C57BL/6小鼠EAE诱导。将致敏并在体外扩增的供体细胞进行过继转移后，未能在C57BL/6小鼠中诱导EAE。细胞转移后进行抗原攻击，使小鼠易于被诱导发病。Av.，平均值。N.D.，未进行。

  抗原攻击后的临床EAE
初始抗原攻击抗原发病率平均疾病评分
（范围）		平均发病时间
（范围）
MBP-CFACFA alone0/3- -- -
MBP-CFAOVA-CFA0/3- -- -
MBP-CFAMBP-CFA3/34.0 (4.0)7.7 (7-9)

表 II. 抗原攻击的特异性。受体小鼠被给予引发抗原以及其他无关抗原进行攻击。只有引发抗原诱导出严重疾病。OVA：鸡卵清蛋白。Av.：平均值。

  抗原攻击后临床EAE表现
攻击抗原剂量（μg/小鼠）发病率平均疾病评分
（范围）		平均发病时间
（天数，范围）
2004/43.75 (3-4)8.25 (7-9)
1004/43.67 (3-4)7.5 (7-8)
504/43.25 (3-4)8.25 (7-10)
254/43.0 (3.0)8.25 (8-9)
104/43.0 (3.0)8.76 (8-9)
54/42.5 (2-3)9.75 (9-10)
12/41.0 (1.0)16 (14-18)
00/4- -- -
    

表 III. 诱导疾病所需的攻毒抗原剂量。测试了用于攻毒受体小鼠的不同浓度的髓鞘碱性蛋白（MBP）。Av.，平均值。

  抗原攻击后临床EAE
攻击抗原攻击日发病率平均疾病评分
（范围）		平均发病时间
（范围）
MBP-CFA53/41.33 (1-2)9.67 (9-10)
MBP-CFA104/43.0 (3.0)8.25 (7-9)
MBP-CFA154/43.75 (3-4)7.25 (7-8)
MBP-CFA254/44.0 (4.0)8.0 (7-9)
MBP-CFA354/43.5 (3-4)7.5 (7-8)
MBP-CFA604/43.75 (3-4)9.0 (8-10)
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
MBP-CFA3433/33.0 (3.0)10.33 (10-11)
MBP-CFA4453/33.0 (3.0)7.0 (7.0)

表 IV. 抗原攻击的动力学。受体小鼠在过继性细胞转移后的不同时间点进行抗原攻击。Av.，平均值。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在小鼠中进行EAE研究时，通常使用神经抗原髓鞘碱性蛋白（MBP）、蛋白脂质蛋白（PLP）或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）。早期的研究主要使用MBP。PLP可在SJL小鼠中诱导强烈且一致的免疫反应。近年来，MOG成为常用的神经抗原，因为B6小鼠对该抗原易感，可成功诱导疾病。许多基因靶向小鼠品系均建立在B6遗传背景上。有趣的是，B6小鼠对MOG诱导的EAE易感，但对MBP诱导的疾病具有抗性。

以往关于阐明实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）机制的研究，主要集中于疾病诱导机制、细胞因子产生效应以及调节性T细胞介导的恢复过程5-7。然而，为何某些公认的EAE抵抗型小鼠能够阻断疾病诱导，这一问题尚未得到广泛研究。这可能是因为难以量化“无应答”状态所致。Arnon8于1981年首次发现，用环磷酰胺处理B6小鼠后，这些小鼠会对髓鞘碱性蛋白（MBP）诱导的EAE产生易感性。其他研究也表明，使用抗γ干扰素处理同样可成功诱导B6和Balb/c小鼠发病9,10。需要注意的是，这些研究均针对非抗原特异性的标志物。相比之下，本文所述方案聚焦于...

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

部分由美国国立卫生研究院（R01 NS37253 和 N01 NS055167）和美国多发性硬化症学会（RG 3288-A6）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
豚鼠脊髓figure-materials-1 Rockland ImmunochemicalsGP-T065 冷冻的
弗伦德’佐剂，完全H37Ra Difco 实验室231131
多功能可互换注射器 figure-materials-2 BD 生物科学512133
RPMI 1640figure-materials-3 Mediatech, Inc.10-040-CM
OVAfigure-materials-4 Sigma-AldrichA5503
小鼠杰克逊实验室B6 小鼠：0000664缅因州巴港

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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