在此，我们介绍一种快速、可靠且简便的方法，用于确定大鼠或小鼠出现伤害性防御行为的最低温度。 即 的 热伤害感受性阈值 （TNT）。该方法施加缓慢递增的热刺激，可对TNT进行精确且可重复的评估，同时对动物造成的应激最小，甚至几乎没有。
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本文内容
摘要
摘要
疼痛性糖尿病神经病变（PDN）的特征是 痛觉过敏，即对有害刺激的敏感性增加，以及 痛觉过敏，即 对通常无害刺激的过度敏感1. 糖尿病性痛觉过敏和异常性疼痛已在多种不同的啮齿类动物糖尿病模型中得到研究2。然而，正如 Bölcskei 所述 等，测定“疼痛在动物模型中具有挑战性，因其具有主观性3此外，用于测定对有害热刺激行为反应的传统方法通常缺乏可重复性和药物敏感性。3例如，通过使用Ankier的热板法4以恒定的高强度热刺激（52–55 °C）诱发动物后肢和/或前肢的退缩、畏缩和/或舔舐行为，并将这些反应的潜伏期作为反射潜伏期进行量化。然而，对热刺激呈现痛觉过敏的动物在使用这些高于阈值的温度时，其反射潜伏期的差异并不具有可重复性。3,5. 作为一种最近描述的方法，Bölcskei 等6此处描述的实验方法可用于快速、灵敏且可重复地测定小鼠和大鼠的热痛觉阈值（TNTs）。该方法主要通过对小鼠或大鼠足底皮肤施加缓慢升高的热刺激来实现。该方法在研究如疼痛性糖尿病神经病变（PDN）等痛觉过敏状态下的抗伤害感受效应时尤为敏感。下述实验步骤基于Almási等人先前详细发表的方法。 等 5 和 Bölcskei 等 3此处所述实验程序已获莱特州立大学实验动物护理和使用委员会（LACUC）批准。
方案
小鼠和大鼠的甩尾潜伏期（TNTs）通过增量式热板镇痛仪 [iHPAM，IITC 公司生命科学（美国加利福尼亚州伍德兰希尔斯）] 测定。该设备由多个部件组成：一块铝制加热板（10 × 20 cm），其下方为加热系统，上方为一个有机玻璃观察室；一个温度控制单元、用于数据采集的软件（IITC 部件号：Soft Series 8）、一台个人计算机（PC）以及一个用于远程启动、停止或重置设备的脚踏开关。加热系统还允许通过设备前方的小键盘手动启动、停止或重置加热过程。iHPAM 可设置多种加热速率以及待机/切断温度。
1. 仪器设置
- 在测试动物之前，目视检查设备，以确认所选的加热速率例如, 6 °C/分钟），初始待机温度和最终截止温度（例如, 28 °C 和 55 °C，分别）。
- 检查所有连接。若需保存结果的电子副本，必须将仪器连接至运行 Software Series 8 的计算机。或者，也可通过仪器的串行端口打印结果的纸质副本。
- 测试设备。踩下脚踏开关一次，以确保软件系列8能够记录数据：初始待机温度、最终截止温度以及达到截止温度所需的时间（秒）。
- 作为进一步的对照测试，参与实验的研究人员可能需要亲自体验该装置。在感知到疼痛的瞬间将手从金属板上移开（46-48 °C)不得对皮肤造成伤害，也不得引起任何后续不适。
- 设定单位后，可记录步骤1.3和1.4的结果并进行比较。这有助于发现可能影响该单位有效性的潜在问题。例如，初始待机/最终关闭温度与设备实际读数之间的差异，和/或设备显示温度与手部撤离所需实际板面温度之间的差异。
2. 正常动物的检测
可使用幼年或成年Wistar大鼠[出生后（p）21-25天]，或任何遗传背景和性别的小鼠（p21-25）。本实验所用小鼠品系为C57BL/6J。
- 实验前一天晚上，将动物笼子放置在安装iHPAM的实验台上，使其适应环境。实验开始前两小时，打开iHPAM设备，使动物熟悉仪器运行时的背景噪音。此时可对iHPAM进行安装和测试，以确认其功能正常见 1). 提供食物和水 随意摄取 测试过程中，除非动物处于观察室内外见 步骤 2.1)
注意： 在行为学实验中，不应默认实验室条件已得到控制。应特别关注可能影响行为学研究结果的遗传和环境因素。经审阅 7). - 将一只正常的大小鼠轻轻放入仪器加热板上方的聚甲基丙烯酸甲酯观察室中。让动物适应预热的表面（设定温度为 28 °C直到动物表现出舒适的行为。
注意： 在此条件下，正常成年大鼠表现出初始的探索行为，偶尔会直立身体朝向观察箱的盖子并嗅探。数分钟后，大鼠可能出现短暂的理毛行为，并呈现放松状态。有时，大鼠以舒展的体态（俯卧伸展）躺卧，同时随意嗅探周围环境。正常小鼠通常比大鼠更活跃，但在观察箱中数分钟后也会表现出放松的探索行为。观察到逃跑行为极为罕见（例如，跳跃，试图逃离观察室）或防御姿态（例如，尖叫声）。还需注意，小鼠之间能够相互传递疼痛信号8因此，对分笼饲养的小鼠进行检测可能十分重要。 - 在观察室后部放置镜子，以便从各个角度进行观察。使用三脚架固定数码摄像机，有助于准确判断伤害性防御行为（避痛行为）发生的具体时刻。
- 一旦动物在观察室内适应后，通过踩下脚踏开关加热载物台。当载物台温度以一定速率升高时 6 °C/分钟，正常动物会表现出伤害性防御行为，通常涉及后肢足垫，温度范围一般为46至 48 °C3,5,9,10因此，动物通常在观察室中放置约3分钟后被移出。
注意： 观察大鼠或小鼠典型的伤害性防御反应 即， 后肢舔舐的同时伴随抖动和/或抬举，即可终止热刺激。此操作通过按压脚踏开关实现。此时，软件会记录加热板的温度，加热板随即迅速降温至待机温度28 °C）时停止（约0.5分钟）。该温度 即引起伤害性防御反应的温度被视为正常（对照）动物的有害热阈值（TNT）。
有时，特别是在小鼠中，对有害温度的伤害性行为可能首先表现为一个或两个前爪的反应例如，坐着时舔舐），通常比后肢反应早几秒钟。然而，前肢舔舐是理毛行为的正常组成部分，因此仅评估后肢反应。有时小鼠也会理毛后肢，但正常的理毛行为持续时间不超过数秒，不涉及剧烈舔舐，通常在清洁爪子后即结束。 - 轻轻地将动物从培养皿中取出，并放入相应的笼子中。随后对其他对照（正常）动物重复进行热阈值测量。
注意： 可在不将动物移出观察室的情况下，每隔1-2分钟对同一只动物进行一次TNT测定。在大鼠或小鼠中，TNT测定可在数天内重复进行多次。该方法特别适用于测定单个动物的平均TNT值及其随年龄变化的波动情况。 - 对照组动物的TNT表示为三个或更多阈值的均值±标准误（SEM）。
- 对获得的数据进行统计学分析，以比较不同处理组的小鼠或大鼠。若数据呈正态分布且处理组间具有方差齐性，则可适当采用参数检验方法，如方差分析；在满足上述条件的情况下，可应用以下分析方法：先进行方差分析，随后采用Newman-Keuls检验以检测多次测量间的差异 即， 重复的单个TNTs，有/无处理或在不同时间点例如， 数据输入 图3）。配对 t 检验 t-检验可用于比较两组数据 即，TNTs 之前 与 药物处理后；未配对的 t-该检测可用于确定药物处理后TNT变化的差异 与 溶媒处理的动物（例如，数据在 图4).
3. 糖尿病动物的检测
链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠是研究糖尿病性神经病变（PDN）机制以及评估镇痛药物和疗法最常用的动物模型11,12通过单次腹腔注射STZ（60 mg/kg）诱导糖尿病的大鼠，可在第3周期间检测其热痛觉过敏情况rd 糖尿病发病后一周11需要注意的是，并非所有糖尿病大鼠都会发展为糖尿病性神经病变（PDN）。然而，那些确实出现痛觉过敏的大鼠（约50%）可被轻易识别，其缩腿神经痛阈值（TNTs）低于正常水平*。
*为测定STZ糖尿病大鼠的热痛阈值（TNTs），起始板温采用15 °C而非28 °C。这种调整的原因在于，大多数患有疼痛性糖尿病神经病变（PDN）的糖尿病动物预期表现为痛觉过敏2,11，因此其有害热刺激的痛阈将低于正常水平（例如，<45 °C）。
- 将糖尿病大鼠放置在测试装置上方的观察箱内。让动物适应板面，直至其表现出舒适的行为。
注意： 通常情况下，糖尿病大鼠不会表现出太多正常行为。这类大鼠通常活动减少、精神萎靡，常出现活动受限和梳理毛发缓慢的现象。观察到其站立朝向观察箱盖的情况较为罕见。数分钟后，糖尿病大鼠可能安静地待在箱角，偶尔嗅探周围环境。 - 一旦糖尿病动物在观察箱内处于舒适状态，即按照步骤2.3加热板面，糖尿病大鼠可能会出现涉及后肢或前肢的伤害性防御行为。这种情况通常发生在非伤害性板温（例如，<45 °C）下，或在温度以6 °C/min上升的条件下进入箱内不超过5分钟时。
注意： 年轻成年糖尿病大鼠的伤害性防御反应与正常大鼠无差异。然而，引发该行为的最低温度显著降低。 - 参见步骤2.4
- 实验当天测得的三次以上阈值的平均值，以°C ± SEM表示，视为该糖尿病动物的伤害性热阈值。
注意： 可采用与正常或糖尿病大鼠所述相似的实验范式，用于评估镇痛药物对热阈值的抗伤害性热效应。
4. 镇痛效果测试
通过使用上述步骤，可以轻松获得药物（例如镇痛药）的抗伤害感受特性以及药理学参数（如最小有效剂量）。预计给予大鼠/小鼠适当剂量的镇痛药会显著延长其热板反应潜伏期（TNTs）。这一效应在具有热痛觉过敏的动物中尤为敏感3。然而，为了避免对实验结果解释产生偏倚，参与动物行为观察的研究人员必须对动物是否接受过处理保持盲态。此外，由观察者注射的药物可由另一位研究人员配制，并标记为A、B、C等。剂量信息以打印形式提供，列出每只已标识动物的个体给药剂量。
根据所测试药物的不同，可在行为学实验前5-15分钟向正常或糖尿病动物给予不同剂量的潜在镇痛药物。必须设置适当的对照组（即， 年龄相匹配的仅注射溶剂的动物和/或未使用泼尼松的糖尿病大鼠，在相同条件下进行检测（例如， 相同的起始温度）。药物的慢性效应也可进行测试。
5. 代表性结果
通过执行步骤2-1至2-6，测定年轻成年正常未处理大鼠或小鼠任一后爪产生伤害性反应的最低板温。如图1所示，正常年轻成年大鼠和小鼠的TNT分别为47.2 ± 0.2 °C和47.5 ± 0.5 °C。
我们未观察到个体间隧道纳米管（TNTs）存在显著的每日变化（图2A），也未观察到同龄个体之间的TNTs有显著差异（图2B）。未发现TNTs因性别而产生的差异（未显示）。
年轻成年STZ糖尿病大鼠的热痛阈值（TNT）测定方法与正常大鼠类似（步骤3.1至3.3）。然而，起始板的温度设置为15 °C，而非28 °C。STZ糖尿病大鼠的伤害性防御行为在STZ注射后第11天开始，每天至少评估三次，每次个体单独进行。如图3所示，STZ糖尿病大鼠的TNT在注射STZ两周后显著下降（p<0.01）。STZ糖尿病大鼠的平均TNT为45.6 ± 0.1 °C（n=16，第14至23天数据合并）。
与正常大鼠相比，TNT 显著降低的糖尿病大鼠被视为具有 PDN。这些大鼠用于测试一种镇痛药（化合物 A）的急性抗伤害性作用。在测试前 5 分钟，向正常和糖尿病大鼠分别注射单剂量的化合物或单独的溶媒，随后测定 TNT。如图 4所示，与仅接受溶媒处理的大鼠相比，单次腹腔注射该化合物显著提高了糖尿病大鼠的 TNT（分别为 45.6 °C vs 47.6 °C）。在正常大鼠中也观察到化合物 A 的抗伤害性效应；尽管具有显著性（p<0.01），但效应较弱（分别为 47.4 °C vs 48.0 °C）。
图 1. 正常年轻成年大鼠或小鼠热伤害性感受阈值（TNT）的测定：根据上述步骤，在iHPAM中检测了年轻成年大鼠（p21-24）和小鼠（p20-21）的TNT。共检测了12只大鼠和25只小鼠。测量在数天内进行，结果合并分析。数据以均值±标准误（SEM）表示。在这些大鼠中记录到的最低和最高TNT值分别为46.2 °C和48.6 °C。对于小鼠，记录到的最高和最低TNT值分别为48.8 °C和44.9 °C。
图 2. 大鼠和小鼠TNT的年龄依赖性：A）显示了4只21日龄正常大鼠（n=4）在5天内每天至少测定三次的TNT值。B）同窝小鼠在指定年龄时单次测定的TNT值。每个测定时间点上方的数字表示所用同窝仔鼠的数量。
图3. 糖尿病大鼠在糖尿病发病后3周出现痛觉过敏：对六只（n=6）年龄匹配的年轻成年STZ糖尿病大鼠，从糖尿病诱导后第11天开始每天测定其热痛阈值（TNT）。图中显示每日TNT平均值（均值±标准误）。STZ注射后11-13天测得的糖尿病大鼠TNT处于正常范围（红线）。注射STZ两周后，TNT显著下降至45.1 ± 0.4 °C（p<0.05）。
图 4. 化合物 B 在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠中的急性抗伤害性效应。 在腹腔注射溶媒（深色柱）或化合物 A（浅色柱）后，使用 iHPAM 检测年轻成年正常大鼠（蓝色组 n=12）和年龄匹配的链脲佐菌素诱导的糖尿病性痛觉过敏大鼠（绿色组 n=6）。图中显示了每种处理（溶媒对照组或化合物 A 处理组）的平均热痛觉阈值（TNT）± 标准误（SEM）。星号表示统计学差异（p<0.05）。
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讨论
与经典的热板法测定热痛觉过敏类似4,13，本文所述的伤害性感受检测方法可快速、可靠地量化大鼠和小鼠的伤害性防御行为。然而，与经典方法不同，渐进式热板法是一种非侵入性且几乎无应激的检测方法。尽管实验过程中需要一定程度的限制（i.e.，动物必须置于观察室内），但大鼠和小鼠通常已适应类似环境（e.g.，饲养笼具）。
在所述条件下，正常的年轻成年大鼠和小鼠在接近 47 °C 的温度下表现出伤害性防御行为。尽管这些阈值略高于其他研究者报道的结果3,5,13，但我们的结果与在人类14、猴子15及其他动物模型10中观察到的 46–48 °C 的热痛觉阈值一致。本研究与已发表研究3,5,13之间热痛觉反应阈值（TNTs）的差异可能与所用动物的年龄有关。事实上，年轻成年大鼠的热痛觉阈值高于 4 周龄或更年长大鼠的阈值16。
综上所述，按照上述步骤操作，渐...
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披露
我们决定不公开本实验中所用镇痛药的身份。此处展示的部分结果已在第71届st 美国糖尿病协会科学会议（加利福尼亚州圣地亚哥）及第47届th 欧洲糖尿病研究学会年度会议（葡萄牙里斯本）
致谢
本研究由美国糖尿病协会（ADA）资助，项目编号 JF1-10-14（MDiF）。我们谨向华盛顿州立大学动物资源实验室的技术人员表示感谢。作者衷心感谢尼尔·帕顿（Neil Paton）博士在数据统计分析方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 渐进式热板镇痛仪 | IITC Inc. Life Science | 部件号 #PE34 | |
| Soft Series 8 | IITC Inc. Life Science | 部件号 # Series8 | |
| 链脲佐菌素 | Calbiochem | 572201 |
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重印与许可
