正常人脑中可溶性与不可溶性PrP寡聚体的分离

摘要

最近利用本文所述方法在未感染的人脑中鉴定出一种新的细胞型朊蛋白（PrP^C）。这些方法可用于分离多种PrP蛋白亚型，其中部分方法还可用于从人脑中分离其他错误折叠的蛋白质聚集体。

摘要

朊病毒疾病发病机制的核心事件是宿主编码的细胞型朊蛋白PrP的构象转变^C 进入其致病性异构体 PrP^{Sc 1}PrP^C 可溶于去垢剂且对蛋白酶K（PK）消化敏感，而PrP^Sc 形成不溶于去垢剂的聚集体，并对蛋白酶K（PK）具有部分抗性^2-6PrP的转化^C 至 PrP^Sc 已知涉及蛋白质从α-螺旋结构向β-折叠结构的构象转变。然而， 体内 通路仍 poorly understood。一种初步的内源性 PrP^Sc，中间产物PrP*或“沉默朊病毒”在未感染的脑组织中尚未被鉴定⁷.

结合生物物理与生化方法，我们鉴定了不溶性 PrP^C 聚集体（指定为 iPrP）^C来自未感染的哺乳动物脑组织和培养的神经元细胞^{8, 9}. 本文详细描述了这些方法的具体操作步骤，包括去污剂缓冲液中的超速离心、蔗糖阶梯梯度沉降、凝胶过滤层析，以及利用基因5蛋白（g5p）富集iPrP（该蛋白可特异性结合结构发生改变的PrP形式）¹⁰，以及PK处理。这些方法的结合不仅可分离不溶性PrP^Sc 和 PrP^C 聚集态和可溶性PrP^C 来自正常人脑的寡聚体。由于此处描述的方案已被用于分离PrP^Sc 来自感染脑组织和iPrP^C 来自未感染脑组织的样本使我们有机会比较两种异构体在理化特性、神经毒性及感染性方面的差异。此类研究将极大增进我们对传染性蛋白质病原体的理解。iPrP 的生理学与病理生理学^C 目前尚不明确。值得注意的是，在一种新近发现的人类朊病毒病——称为可变性蛋白酶敏感性朊病毒病（variably protease-sensitive prionopathy）中，我们发现了一种新的 PrP^Sc 与iPrP具有相同的免疫反应性行为和片段化特征^{C 11, 12}此外，我们最近证明了 iPrP^C 是阿尔茨海默病中与淀粉样蛋白-β相互作用的主要物种¹³在同一项研究中，这些方法被用于分离阿尔茨海默病中的Aβ聚集体和寡聚体¹³，表明其可应用于其他神经退行性疾病中涉及的非朊病毒蛋白聚集体。

方案

1. 脑组织匀浆及去垢剂可溶性（S2）与去垢剂不溶性（P2）组分的制备

1. 取100 mg冷冻的人脑组织，加入100 μl裂解缓冲液（10 mM Tris，150 mM NaCl，0.5% Nonidet P-40 (NP-40)，0.5% EDTA，pH 7.4）。
2. 使用由无线电机驱动的研杵在冰上进行匀浆，随后将样品置于干冰中冷冻5分钟，再先用手动研杵、后用电机驱动研杵重复匀浆，然后加入300 μl或800 μl裂解缓冲液（分别对应20%或10%总脑匀浆液）。
3. 将20%或10%总脑匀浆液在4 °C条件下，以1,000 x g离心10分钟，使用台式离心机收集上清液（S1）。
4. 将10% S1在4 °C条件下，于SW55转子（Beckman Coulter，Fullerton，CA）中以35,000 rpm（100,000 x g）超速离心1小时。将含有去污剂可溶性组分的上清液（S2）转移至洁净离心管中。将含有去污剂不溶性组分的沉淀（P2）用100 μl或200 μl裂解缓冲液重悬，制成10倍或5倍浓缩的样品。
5. 进行蛋白酶K（PK）消化时，将S2和P2组分样品分别在37 °C下与相同量的PK（终浓度50 μg/ml）孵育1小时。加入苯甲基磺酰氟（PMSF），使其终浓度为5 mM，并加入等体积的SDS上样缓冲液（3% SDS，2 mM EDTA，4% β-巯基乙醇，10%甘油，50 mM Tris，pH 6.8），以终止PK消化反应。将样....

讨论

本文报道的方法组合能够从正常人脑中稳定地分离出不溶性PrP^C聚集体和可溶性PrP^C寡聚体。100,000 × g超速离心1小时是一种经典方法，已被广泛用于分离不溶性PrP^Sc与可溶性PrP^{C 14}。尽管该方法效率较高，但需注意避免在离心后吸取上清液（S2）时发生污染。由于iPrP^C的凝胶电泳图谱与PrP^C明显不同，因此P2组分中检测到的PrP不太可能来源于S2的污染。蔗糖梯度沉降分析已被用于根据PrP^Sc不同亚型的密度、大小和形状进行分离¹⁵。我们注意到，第12组分常含有某些颗粒，可能导致该组分结果不可靠。第10组分通常是所收集各组分中PrP聚集体含量最高的组分⁸。为进一步表征不同PrP^C构象体的分子量（MW），我们采用凝胶过滤层析（也称尺寸排阻色谱）进行分析。我们首先使用七种分子质量标记物绘制了标准曲线（数据未显示），随后检测了正常对照组和散发性克雅氏病（sCJD）患者脑组织中PrP的分子量。我们注意到，在制备S1组分.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
苯甲基磺酰氟	Sigma-Aldrich	P7626	72 mM 的 2-丙醇溶液
蛋白酶K	Sigma-Aldrich	P2308	2 mg/ml 的 H2O 溶液
PNGase F	New England Biolabs	MWGF200
超速离心机 LE-80K，SW55 转子	Beckman Coulter	部件编号 365668, 356860
Superdex 200 HR 凝胶	GE Healthcare	17-1088-01
AKTA FPLC 系统	GE Healthcare	18-1900-26
分子量标准蛋白	Sigma-Aldrich	MWGF200	多种规格
Dynabeads M-280 磁珠	Invitrogen	143-01
3F4 抗体	Covance	SIG-39600
1E4 抗体	Cell Sciences	M1840
预制胶 15% Tris-HCl Ready Gel	Bio-Rad	345-0020