正常人脑中可溶性与不可溶性PrP寡聚体的分离

摘要

最近利用本文所述方法在未感染的人脑中鉴定出一种新的细胞型朊蛋白（PrP^C）。这些方法可用于分离多种PrP蛋白亚型，其中部分方法还可用于从人脑中分离其他错误折叠的蛋白质聚集体。

摘要

朊病毒疾病发病机制的核心事件是宿主编码的细胞型朊蛋白PrP的构象转变^C 进入其致病性异构体 PrP^{Sc 1}PrP^C 可溶于去垢剂且对蛋白酶K（PK）消化敏感，而PrP^Sc 形成不溶于去垢剂的聚集体，并对蛋白酶K（PK）具有部分抗性^2-6PrP的转化^C 至 PrP^Sc 已知涉及蛋白质从α-螺旋结构向β-折叠结构的构象转变。然而， 体内 通路仍 poorly understood。一种初步的内源性 PrP^Sc，中间产物PrP*或“沉默朊病毒”在未感染的脑组织中尚未被鉴定⁷.

结合生物物理与生化方法，我们鉴定了不溶性 PrP^C 聚集体（指定为 iPrP）^C来自未感染的哺乳动物脑组织和培养的神经元细胞^{8, 9}. 本文详细描述了这些方法的具体操作步骤，包括去污剂缓冲液中的超速离心、蔗糖阶梯梯度沉降、凝胶过滤层析，以及利用基因5蛋白（g5p）富集iPrP（该蛋白可特异性结合结构发生改变的PrP形式）¹⁰，以及PK处理。这些方法的结合不仅可分离不溶性PrP^Sc 和 PrP^C 聚集态和可溶性PrP^C 来自正常人脑的寡聚体。由于此处描述的方案已被用于分离PrP^Sc 来自感染脑组织和iPrP^C 来自未感染脑组织的样本使我们有机会比较两种异构体在理化特性、神经毒性及感染性方面的差异。此类研究将极大增进我们对传染性蛋白质病原体的理解。iPrP 的生理学与病理生理学^C 目前尚不明确。值得注意的是，在一种新近发现的人类朊病毒病——称为可变性蛋白酶敏感性朊病毒病（variably protease-sensitive prionopathy）中，我们发现了一种新的 PrP^Sc 与iPrP具有相同的免疫反应性行为和片段化特征^{C 11, 12}此外，我们最近证明了 iPrP^C 是阿尔茨海默病中与淀粉样蛋白-β相互作用的主要物种¹³在同一项研究中，这些方法被用于分离阿尔茨海默病中的Aβ聚集体和寡聚体¹³，表明其可应用于其他神经退行性疾病中涉及的非朊病毒蛋白聚集体。

方案

1. 脑组织匀浆及去垢剂可溶性（S2）与去垢剂不溶性（P2）组分的制备

1. 取100 mg冷冻的人脑组织，加入100 μl裂解缓冲液（10 mM Tris，150 mM NaCl，0.5% Nonidet P-40 (NP-40)，0.5% EDTA，pH 7.4）。
2. 使用由无线电机驱动的研杵在冰上进行匀浆，随后将样品置于干冰中冷冻5分钟，再先用手动研杵、后用电机驱动研杵重复匀浆，然后加入300 μl或800 μl裂解缓冲液（分别对应20%或10%总脑匀浆液）。
3. 将20%或10%总脑匀浆液在4 °C条件下，以1,000 x g离心10分钟，使用台式离心机收集上清液（S1）。
4. 将10% S1在4 °C条件下，于SW55转子（Beckman Coulter，Fullerton，CA）中以35,000 rpm（100,000 x g）超速离心1小时。将含有去污剂可溶性组分的上清液（S2）转移至洁净离心管中。将含有去污剂不溶性组分的沉淀（P2）用100 μl或200 μl裂解缓冲液重悬，制成10倍或5倍浓缩的样品。
5. 进行蛋白酶K（PK）消化时，将S2和P2组分样品分别在37 °C下与相同量的PK（终浓度50 μg/ml）孵育1小时。加入苯甲基磺酰氟（PMSF），使其终浓度为5 mM，并加入等体积的SDS上样缓冲液（3% SDS，2 mM EDTA，4% β-巯基乙醇，10%甘油，50 mM Tris，pH 6.8），以终止PK消化反应。将样品煮沸10分钟，室温冷却5分钟，即可用于Western blot检测。

2. 蔗糖阶梯梯度中的速度沉降

1. 将450 μl 20% S1与等体积的2% Sarkosyl溶于H₂O中，冰上孵育30分钟。
2. 分别取0.5 ml的60%、30%、25%、20%、15%和10%蔗糖溶液加入至最大容量为5 ml的Beckman离心管中。
3. 将0.4 ml S1加至10-60%蔗糖阶梯梯度的液面顶部。
4. 在4 °C下，以48,000 rpm（200,000 × g，SW55转子）离心1小时。
5. 从离心管顶部开始，每管收集283 μl组分，共收集12个组分。
6. 取每个组分20 μl转移至新的Eppendorf管中，加入20 μl上样缓冲液，煮沸10分钟。
7. 在通风橱中冷却4分钟，以1,000 × g离心1分钟，涡旋混匀，然后将样品加至预制胶中。

3. 尺寸排阻色谱

1. 使用 Superdex 200 HR 色谱柱填料（Pharmacia，Uppsala，Sweden），在 1 × 30 cm 柱中测定 PrP 分子的寡聚状态。
2. 分别加载七种分子量标记物（Sigma，St. Louis，MI），包括蓝色葡聚糖（2,000 kDa）、甲状腺球蛋白（669 kDa）、脱铁铁蛋白（443 kDa）、β-淀粉酶（200 kDa）、乙醇脱氢酶（150 kDa）、白蛋白（66 kDa）和碳酸酐酶（29 kDa），每种均按 Sigma 推荐浓度溶于 200 μl 样品体积中上样。
3. 以蓝色葡聚糖的洗脱体积确定空体积（V₀ = 8.45 ml），总柱体积（V_t = 24 ml）由产品说明书提供。峰洗脱体积（V_e）由色谱图和分级保留值计算得出。分配系数 K_av（用于定义样品行为）按公式计算：K_av = (V_e - V₀)/(V_t - V₀)。通过将标准蛋白的 K_av 值对其分子量对数（log MW）作图，绘制标准曲线⁸。
4. 根据多种标准品凝胶过滤所得的标准曲线，评估不同 FPLC 组分中回收的各类 PrP 物种的分子量（MW）。
5. 每次运行时，将 200 μl 含 1% Sarkosyl 的裂解缓冲液中的 S1 样品注入色谱柱。
6. 在 FPLC 系统（GE Healthcare）中以 0.25 ml/min 的流速进行层析，使用组分收集器（Amersham Biosciences，RediFrac）收集每管 0.25 ml 的组分。
7. 将每管 0.125 ml 组分与 0.5 ml 预冷甲醇在 -20 °C 下孵育 2 小时。
8. 在台式微量离心机中，4 °C 下以 13,000 × g 离心 30 分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 20 μl 上述 SDS 样品缓冲液中，煮沸 10 分钟，冷却至室温后上样至预制胶中。

4. g5p 对 PrP 的捕获

1. 将 g5p 分子（100 μg）（由英国朴茨茅斯大学的 Geoff Kneale 博士和 John McGeehan 博士惠赠）与 7 x 10⁸ 个甲苯磺酰活化磁珠偶联：在 1 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中，将 100 μg g5p 与 350 μl g5p 磁珠于 37 °C 孵育 20 小时。通过外加磁力将 g5p-磁珠吸附至离心管管壁，随后弃去全部溶液。用含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 1 ml PBS 洗涤磁珠三次。
2. 将偶联 g5p 的磁珠在含 0.1% BSA 的 1 ml 0.2 M Tris-HCl（pH 7.4）中于 37 °C 孵育 5 小时，以阻断非特异性结合，然后如上所述用含 0.1% BSA 的 1 ml PBS 洗涤三次。弃去溶液后向磁珠中加入 1 ml PBS。制备好的 g5p 磁珠在 4 °C 下至少可稳定保存 3 个月。
3. 通过将 100 μl S1 组分或 P2 与 60 μl 偶联 g5p 的磁珠（10 μg 蛋白/6 x 10⁷ 个磁珠）在 1 ml 结合缓冲液（含 3% Tween-20 和 3% NP-40 的 PBS，pH 7.5）中孵育，实现 g5p 对 PrP 的捕获。
4. 室温下持续旋转孵育 3 小时后，通过外加磁力将含有 PrP 的 g5p 磁珠吸附至离心管管壁，从而易于去除溶液中未结合的分子。
5. 用洗涤缓冲液（含 2% Tween-20 和 2% NP-40 的 PBS，pH 7.5）洗涤三次后，收集 g5p 磁珠，并在 SDS 样品缓冲液（3% SDS、2 mM EDTA、10% 甘油、50 mM Tris-HCl，pH 6.8）中 95 °C 加热 5 分钟。
6. 样品在室温下冷却 5 分钟后，在室温下以 1,000 x g 离心 5 分钟。上清液即可用于 Western 印迹分析。

5. 蛋白质印迹

1. 将加入 SDS 样品缓冲液后煮沸的样品上样至 15% Tris-HCl Criterion 预制胶（Bio-Rad），在 150 V 条件下电泳约 80 分钟。
2. 将凝胶中的蛋白质在 70 V 条件下转移至 PVDF 膜，持续 2 小时。
3. 用含 0.01% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水（TBS-T）配制的 5% 脱脂奶粉封闭膜后，室温下与一抗孵育 2 小时，所用一抗包括单克隆或多克隆抗体 3F4（1:40,000）、1E4（1:1,000）、anti-N⁸（1:6,000）或 anti-C⁸（1:6,000），用于检测 PrP 分子。
4. 一抗孵育后，使用 HRP 标记的羊抗小鼠 IgG（1:3,000）或驴抗兔 IgG（1:3,000）进行二抗孵育，随后按照生产商说明书，利用 ECL Plus 在 Kodak 胶片上显影 PrP 条带。

6. 典型结果

与散发性克雅病（CJD）样本相比，在正常脑组织的P2组分中仅检测到少量异常构象的PrP^C，而大部分PrP^C存在于S2组分中（图1）。如先前研究所指出⁸，异常构象的PrP约占总PrP（包括全长型及N端截短型亚型）的5–25%。

利用蔗糖阶梯梯度沉降分析发现，非克雅病（CJD）脑组织中的大部分PrP^C分布在顶部组分1-3中，而在通常含有大分子聚集体的底部组分9-11中也检测到少量PrP⁸（图2）。

通过凝胶过滤法，从克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease）患者脑组织中分离出多种PrP^Sc形式，包括单体、小寡聚体以及较大的聚集体（图3A）。然而，在正常脑组织的不溶性组分中也检测到少量分子量大于2,000 kDa的较大聚集体（图3C）。此外，PrP^C的二聚体和四聚体不仅在不溶性组分中被检测到，也在可溶性组分中被发现（图3B和3C）。

经PK和PNGase处理后，利用g5p捕获的PrP通过针对PrP97-105的1E4抗体进行检测⁸。检测到三个抗PK的核心片段，分别称为PrP*²⁰、PrP*¹⁹和PrP*⁷，其迁移位置分别为约20 kDa、约19 kDa和约7 kDa（图4，左图）。然而，当1E4抗体与一段序列与1E4表位完全相同的合成肽段预先共孵育时，未检测到任何PrP信号（图4，中图），表明1E4抗体检测到的条带确为PrP片段。此外，抗C端抗体除PrP*²⁰外，还检测到两个不同的PrP片段，迁移位置分别为约18 kDa（PrP*¹⁸）和约12–13 kDa（PrP-CTF12/13）（图4，右图）。

图 1. iPrP^C 和 iPrP^Sc 的检测。将正常对照（CTL）和散发性克雅病（sCJD）脑组织样本通过超速离心分离得到的可溶性和不溶性组分（S2 和 P2）中的全长或 N 末端截短型 PrP 蛋白，在总体积 1/10 的条件下经 PNGase F 在 37 °C 处理 1 小时以去除蛋白上的糖链后，使用针对 PrP106-112 的 3F4 抗体（左图）、针对 PrP23-40 的 anti-N 抗体（中图）以及针对 PrP220-231 的 anti-C 抗体（右图）进行检测。在 CTL 样本中，P2 组分中仅检测到少量 PrP，而 S2 组分中含有大量 PrP；相比之下，在 sCJD 样本中，P2 组分中检测到的 PrP 多于 S2 组分。

图 2. PrP 在蔗糖阶梯梯度中的沉降。使用 3F4 抗体通过 Western 印迹检测非克雅氏病（CJD）脑样本 S1 第 1 至第 11 组分中的 PrP。尽管大部分 PrP^C 出现在上层组分 1–3 中，但在底层组分 9–11 中也检测到少量 PrP。此外，来自上层和底层的 PrP 条带模式不同：上层组分中回收的 PrP 以较上方的条带为主，而底层组分中回收的 PrP 则以较下方的条带为主。在印迹右侧加载了经蛋白酶 K（PK）处理的 PrP^Sc 作为对照。

图 3. 可溶性和不溶性 PrP^C 寡聚体的检测。从正常人脑组织中提取的可溶性和不溶性 PrP^C 通过超速离心分离后，分别进行凝胶过滤层析。各组分的分子大小通过一组分子质量标准品测定。（A) 来自散发型克雅病（sCJD）脑样本的 PrP^Sc 物种。检测到两种 PrP 物种群体：凝胶过滤组分 49–65 含有单体和小寡聚体，而组分 27–33 含有大分子聚集体。在正常对照样本的可溶性组分（S2）（B）和不溶性组分（P2）（C）中均检测到 PrP^C 物种。PrP 使用 3F4 抗体进行检测。PrP 的二聚体（组分 55）和四聚体（组分 51）不仅在 P2 中被检测到，也在正常脑样本的 S2 中被检测到（B 和 C）。大分子聚集体仅在正常样本的 P2 中检测到（C）。

图 4. 在来自正常人脑组织的 g5p 富集样品中检测多种抗蛋白酶 K（PK）的异常型 PrP 片段。经 g5p 富集的样品在进行 Western blot 分析前，经 PK 和 PNGase F 处理，并分别使用 1E4 抗体（左图）、预先与合成肽段（该肽段序列与 1E4 表位相同）孵育后的 1E4 抗体（中图）以及抗-C 抗体（右图）进行检测。1E4 抗体检测到三种抗 PK 的 PrP 片段，分别命名为 PrP*²⁰、PrP*¹⁹ 和 PrP*⁷（左图）。当 1E4 抗体被肽段封闭后，未检测到任何 PrP^res 条带（中图），表明 1E4 检测到的条带确为 PrP 片段。抗-C 抗体除检测到 PrP*²⁰ 外，还额外检测到两种抗 PK 的 PrP 片段，分别命名为 PrP*¹⁸ 和 PrP-CTF12/13。

讨论

本文报道的方法组合能够从正常人脑中稳定地分离出不溶性PrP^C聚集体和可溶性PrP^C寡聚体。100,000 × g超速离心1小时是一种经典方法，已被广泛用于分离不溶性PrP^Sc与可溶性PrP^{C 14}。尽管该方法效率较高，但需注意避免在离心后吸取上清液（S2）时发生污染。由于iPrP^C的凝胶电泳图谱与PrP^C明显不同，因此P2组分中检测到的PrP不太可能来源于S2的污染。蔗糖梯度沉降分析已被用于根据PrP^Sc不同亚型的密度、大小和形状进行分离¹⁵。我们注意到，第12组分常含有某些颗粒，可能导致该组分结果不可靠。第10组分通常是所收集各组分中PrP聚集体含量最高的组分⁸。为进一步表征不同PrP^C构象体的分子量（MW），我们采用凝胶过滤层析（也称尺寸排阻色谱）进行分析。我们首先使用七种分子质量标记物绘制了标准曲线（数据未显示），随后检测了正常对照组和散发性克雅氏病（sCJD）患者脑组织中PrP的分子量。我们注意到，在制备S1组分...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
苯甲基磺酰氟	Sigma-Aldrich	P7626	72 mM 的 2-丙醇溶液
蛋白酶K	Sigma-Aldrich	P2308	2 mg/ml 的 H2O 溶液
PNGase F	New England Biolabs	MWGF200
超速离心机 LE-80K，SW55 转子	Beckman Coulter	部件编号 365668, 356860
Superdex 200 HR 凝胶	GE Healthcare	17-1088-01
AKTA FPLC 系统	GE Healthcare	18-1900-26
分子量标准蛋白	Sigma-Aldrich	MWGF200	多种规格
Dynabeads M-280 磁珠	Invitrogen	143-01
3F4 抗体	Covance	SIG-39600
1E4 抗体	Cell Sciences	M1840
预制胶 15% Tris-HCl Ready Gel	Bio-Rad	345-0020