本研究涉及一种有价值的方法学方案的开发与标准化，用于测定化学物质、工业废水或污水以及液态环境样品对盐水枝角类动物Artemia franciscana的长期（14天）致死毒性。
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摘要
摘要
我们的研究活动旨在利用生物学方法评估环境质量，特别针对海水/半咸水及沉积物。生物指示剂的选择必须基于可靠的科学知识，并尽可能依据标准化程序的可用性。本文介绍了一种标准化方案，该方案利用海洋甲壳类动物Artemia来评估化学物质和/或海洋环境基质的毒性。科学家提出，卤虫（Artemia）是建立一种可供全球使用的标准生物测定方法的合适候选物种。已有大量文献报道了各种化学物质和有毒物质对卤虫（Artemia）的毒性效应。该甲壳类动物用于毒性研究的主要优势在于其干燥休眠卵（休眠囊）易于获得，可直接用于测试，无需复杂的培养过程1,2。基于休眠卵的毒性检测方法成本低廉、持续可得、操作简便且结果可靠，因此在工业监测或法规要求下的常规毒性筛查需求中具有重要意义3。本方案以死亡率为终点指标，通过计数存活个体数量并计算死亡百分比来评估毒性。若幼体在数秒观察期间未表现出任何内部或外部运动，则判定为死亡4。本研究采用参考物质十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate）对该方法进行了标准化验证，并报告了部分实验结果。本文附有一段视频，详细展示了毒性测试的操作流程，涵盖该协议所涉及的全部步骤。
方案
1. 方法标准
我们的测试包括将卤虫（Artemia）幼虫暴露于一系列浓度的受试物质或样品中，以确定在14天内导致50%受试生物死亡的浓度或稀释度（LC50），并满足本方法所规定的条件。在必要且可行的情况下，还可确定以下参数：a）导致20%受试生物死亡的浓度（LC20）；b）与阴性对照组相比未引起更高死亡率的最高受试浓度（NOEC）；以及在暴露14天后，与阴性对照组相比引起更高死亡率的最低受试浓度（LOEC）。
2. 测试材料
2.1 Artemia 卵
进行测试时，需要使用孵化不足48小时的Artemia franciscana幼虫（无节幼体），处于II或III期，来源于新孵化的卵5。用于支持测试的认证卵或休眠卵可从商业途径获得，例如美国环境保护局辛辛那提分部质量保证研究处（Quality Assurance Research Division, U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, U.S.A.）或比利时根特大学水生污染生物学研究实验室（Laboratory for Biological Research in Aquatic Pollution, University of Ghent, Belgium）。
2.2 水稀释
可使用人工海水作为稀释用水，其制备方法是将公认分析纯级别的试剂或市售配方溶解于蒸馏水或去离子水中。用于配制理想海水的盐类混合物可从商业途径获得，例如 Instant Ocean 混合盐。建议稀释用水的盐度为35（±2）PSU，溶解氧浓度高于饱和值的80%，温度为25（±2）°C。经48小时曝气并使用孔径至少为0.45 μm的滤膜过滤后，稀释用水可在0–4 °C避光条件下最多保存30天。
2.3 藻类培养
建议试验生物以Dunaliella tertiolecta微藻为食，该微藻呈指数生长，密度可达1.3×106 - 2.0×106 个细胞/ml。环境样品的测试要求微藻培养密度高于2.0×106 个细胞/ml6。建议Dunaliella tertiolecta在含有海水（盐度30 (±2) PSU，温度20 (±1) °C）的培养基中生长，并添加必要的营养物质、矿物质和维生素。附录中提供了藻类培养基组成及配制方法的相关说明。初始细胞密度建议约为105 个细胞/ml。藻类培养物应置于恒温室内，温度保持在20 (±1) °C，使用荧光灯照明，光照强度为3000 (±300) lx，光周期为16小时光照与8小时黑暗交替。
也可使用其他浮游植物种类作为饵料，但需针对这些浮游植物种类开展比较研究，以确定与Dunaliella tertiolecta“等效”的种类，因为不同浮游植物种类的实验条件（如初始细胞密度、光照强度、温度、培养基组成及暴露时间）存在差异。此外，还需考虑微藻对不同污染物的耐受性，因为污染物对浮游植物生长和发育的影响也会间接作用于Artemia。
2.4 参照物质
本试验中的参照物质是十二烷基硫酸钠。
2.5 实验室玻璃器皿
除了常规的实验室设备外，还需要以下材料：
- 测试容器，包括100 ml的硼硅酸盐玻璃烧杯（18个用于测试，18个用于转移溶液）。
- 一个烧瓶（例如500 ml烧瓶），用于配制标准溶液。
- 六个烧瓶（例如200 ml烧瓶），用于配制测试溶液。
- 直径5 cm的玻璃或聚苯乙烯培养皿（带可拆卸盖子），用于激活休眠卵以及将卤虫（Artemia）从孵化皿转移到测试容器中。
- 玻璃巴斯德吸管（尖端经火焰圆化处理），用于转移无节幼体。
- 玻璃毛细管或可剪切的3 ml一次性塑料巴斯德吸管，用于转移卤虫（Artemia）。
- 微量移液器和刻度移液器，用于配制测试溶液。
- 六个量筒（例如50 ml量筒），用于将测试溶液从烧瓶转移至测试容器。
3. 囊肿激活
3.1. 含包囊的培养皿 + 加水
为制备试验生物，于试验前48小时将20 mg休眠卵放入含有12 ml稀释水的培养皿中。
3.2. 光照和黑暗条件下的孵育
培养皿在25（±2）°C温度和4000（±1000）勒克斯（每平方米流明）光照强度下保持一小时。
3.3. 在显微镜下更换培养基
24小时后，将孵化的幼虫转移到装有人工水的新培养皿中。转移过程在显微镜下进行，即利用光源使孵化出的趋光性幼虫向光束方向移动。使用玻璃巴斯德吸管进行转移，确保仅转移新生幼虫，而不转移休眠卵或仍包裹在膜内的幼虫。
3.4. 避光孵育
将含有幼虫的培养皿置于25 (±2) °C的黑暗恒温箱中孵育24小时。
4. 测试溶液的制备
4.1. 称量物质并转移至烧瓶
建议通过将0.5 g待测物质溶解于500 ml容量瓶中来配制标准溶液。用去离子水或蒸馏水定容至刻度，并搅拌溶液直至待测物质完全溶解。除非已知该物质在溶液中不稳定，否则溶液应在使用时新鲜配制。若物质在溶液中稳定，则标准溶液可在测试前最多两天配制。
4.2. 准备阴性对照，使用10 ml移液管加入稀释水和藻类
通过将藻类悬液的等分试样加入稀释水中，使细胞密度达到105个细胞/ml，在烧瓶（例如200 ml体积）中制备阴性对照。
4.3. 配制测试溶液：加入稀释水、藻类和标准溶液
建议在五个200 ml的容量瓶中配制测试溶液，通过向稀释水中加入指定量的标准溶液，以获得测试所需的浓度。为喂养试验生物，可使用一定体积的Dunaliella tertiolecta微藻悬浮液，并添加至测试溶液中，使其藻细胞密度达到105个细胞/ml。推荐的添加顺序为：稀释水、藻类悬浮液和标准溶液。测试溶液配制完成后，应尽快用于试验。
4.4. 将溶液从烧瓶转移至测试容器，再转移至培养皿
使用量筒将等量（50 ml）的测试溶液加入测试容器中。每种浓度设三个重复。每次试验系列均设置一个对照容器，其中加入与测试溶液等体积的稀释水。将等体积（约12 ml）的测试溶液加入培养皿中。每次试验系列均使用一个对照培养皿。
5. 测试前准备
5.1. 第二至第三期无节幼体
囊胚激活后48小时，无节幼体达到II-III期幼虫阶段，即可用于实验。
5.2. 在显微镜下将无节幼体转移至培养皿中
将用于包囊激活的培养皿从恒温箱中取出。用显微镜借助足够大直径的移液管，将少量幼虫转移至含有对照溶液和待测溶液的培养皿中。此操作应使用玻璃巴斯德移液管（尖端经火焰圆化处理）并配合侧向光源，以促使Artemia聚集。
5.3. 在显微镜下将卤虫无节幼体从培养皿转移到测试容器中
将10条幼虫从测试溶液的培养皿转移到测试容器中。此操作也必须使用巴斯德移液管和显微镜进行。建议在转移幼虫时，转移体积不超过1 mL，以免影响测试体系的总体积。
5.4. 用封口膜覆盖的完整容器
测试用烧杯用封口膜覆盖（留出空气流通的缝隙），在整个试验期间保持25（±2）°C的温度，光照强度为900（±100）lx，光周期比为14小时光照与10小时黑暗。
6. 更换培养基和营养补充剂
6.1. 存活率对照
测试开始两天后，以及第5、7、9和12天，将Artemia置于显微镜下观察，以确认存活率，并更换培养基和补充食物。
在每个测试容器中计数活体生物的数量。在显微镜下观察并施加轻微的机械刺激（例如用玻璃巴斯德吸管触碰幼虫）后，若生物体约10秒内未表现出任何运动，则应视为已死亡。
6.2. 使用10 ml移液管采集藻类样品，并使用微量移液器取用待测物质，制备测试溶液。将溶液从烧瓶转移至测试容器中
测试过程中必须定期更换测试溶液，且测试溶液需在使用当天配制。测试溶液由先前配制的标准溶液制备而成。
6.3. 使用剪断的巴斯德吸管将卤虫（Artemia）从旧的测试容器转移至三个新容器中
使用具有足够大直径的移液管进行卤虫（Artemia）的转移，以避免损伤生物体。在此过程中，可使用一支3 ml塑料巴斯德移液管（需剪切）。
6.4. 将幼虫放入含有活体或死亡的Artemia的烧杯中
测试结束时，在暴露14天后，统计并记录存活幼虫的数量。计算并记录14天时的LC50和/或LC20、无观察效应浓度（NOEC）和最低观察效应浓度（LOEC），以及在适用情况下的95%置信区间和计算方法。
7. 典型结果
在试验结束时（第14天），根据以下公式计算每个浓度下的死亡率百分比：
(Ms/N) * 100
其中：
Ms 是所分析样本中死亡个体的平均数量
N 为暴露个体的总数
表1报告了一项测试（14天）的数据示例 卤虫 暴露于十二烷基硫酸钠。
| 浓度 (mg/L) | 每个重复组中死亡个体数 | 死亡率 (%) | ||
| I | II | III | ||
| 阴性对照 | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1.56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3.12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6.25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12.5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
此外，可通过高斯对数图形法或使用适当的统计方法（例如 Spearman-Karber 法或概率单位法）确定 LC50 值。表 1 数据计算得到的 LC50 值为 8.18（7.15–9.37）mg/L。如果所测试的最高浓度导致的死亡率低于 50%，则不应继续计算 LC50 值，因为此时结果不可靠甚至无法计算。在此情况下，应考虑通过扩展测试浓度范围重复实验。或者，更准确的表达方式是将 LC50 值表示为高于所测试的最高浓度，并可能需注明在最高测试浓度下的死亡率百分比以及对应无效应的最高浓度。
如果在测试结束时满足以下条件，则结果被视为有效：
- 对照组的平均死亡率应 ≤ 20%；
- 若使用十二烷基硫酸钠，14 天的 LC50 应包含在 8.0 (±5) mg/L 区间内。
如果上述条件未得到满足，则使用同一批生物体获得的所有数据均应视为无效，需重新进行测试。
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讨论
Artemia 是目前可用于生态毒理学测试和研究的最有价值的试验生物之一，已有研究使我们能够确认，在毒理学和生态毒理学中存在多种与 Artemia 应用相关的可行方案。使其成为生物测定适宜物种的特征包括：广泛的地理分布、对不良环境条件和多样化营养的高适应性、相对简单的实验室培养与维护、耐受操作、生命周期短、后代繁殖量大，以及关于某些物种已有大量信息积累。针对 Artemia 应用的一个批评意见涉及其对化学暴露的敏感性：早期研究指出，在相同实验条件下，与其他试验生物相比，Artemia（暴露24小时的测试）在生态毒理学研究中属于敏感性较低的物种3。在此方面，生态毒理学测试方法的选择至关重要。我们希望标准化一种方法，其起始条件与24小时暴露协议4相同（即使用休眠卵孵化所得的无节幼体作为试验生物），但通过相对较长的暴露时间（14天），能够提供更敏感的响应。该方案确实比急性测试更敏感，但由于14天的暴露时间相对于 Artemia 的估计寿命而言并不充分，因此不能作为慢性测试的替代方法。该方法的终点指标选择已受到广...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
由意大利环境保育与研究研究所（ISPRA-环境质量监测部）的Loredana Manfra和艾米利亚-罗马涅大区环境保育局（意大利）的Federica Savorelli制作。
联合国水质委员会（UNICHIM）生物方法组——海水/半咸水及沉积物分组中卤虫（Artemia）甲壳类亚工作组参考成员——该委员会为化学领域内开展技术标准化工作的机构。
视频拍摄与剪辑由 ISPRA（网络部门）的 Marco Pisapia 完成。
由意大利高等环境研究所（环境质量监测部）的 Anna Maria Cicero 和 Erika Magaletti 负责生产协调。
我们感谢艾米利亚-罗马涅大区环境保护局费拉拉分部、UNICHIM 水质委员会咸水/半咸水及沉积物生物学方法组，以及罗马托尔维加塔大学的 Luciana Migliore 提供的合作支持；感谢意大利环境与国土海洋保护研究所（ISPRA）预防与影响缓解部门的 Rossella Boscolo 和 Massimo Gabellini 提供的经费支持；感谢罗马伦敦语言学校的 Fabio Matassa 提供的语言支持。
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