用于复杂样本中特定蛋白质糖基化多重高通量分析的化学封闭抗体微阵列

摘要

本研究中，我们描述了一种改进的多重高通量抗体微阵列结合凝集素检测方法的实验方案，可用于特定蛋白质的糖基化谱分析。该方案采用了新的可靠试剂，与先前方法相比，显著缩短了实验时间，降低了成本，并减少了对实验室设备的需求。

摘要

本研究描述了一种高效的多重高通量抗体微阵列方法，结合凝集素类糖结合蛋白（GBP）检测，用于特异性蛋白质的糖基化谱分析。蛋白质糖基化是蛋白质中最常见的翻译后修饰，可导致蛋白质在物理、化学及生物学特性上的多样化改变。由于糖基化机制极易受到疾病进展和恶性转化的影响，异常糖基化已被公认为癌症及其他疾病的早期检测生物标志物。然而，目前研究蛋白质糖基化的常用方法通常过于复杂或昂贵，难以在大多数常规实验室或临床环境中广泛应用，因此亟需一种更为实用的技术手段。本研究中介绍的新方法采用化学封闭的抗体微阵列并结合糖结合蛋白（GBP）检测，显著降低了研究蛋白质糖基化所需的时间、成本以及对实验设备的要求。该方法将多种针对糖蛋白的特异性抗体直接点样于微阵列芯片上，并对抗体上的N-糖链进行化学封闭。经过封闭处理并固定于芯片上的糖蛋白特异性抗体，能够直接从复杂样本中捕获并分离目标糖蛋白。随后通过向微阵列芯片施加生物素标记的凝集素及其他GBP进行糖链检测，结合Dylight 549标记的链霉亲和素来测定结合水平。利用一组特异性抗体并使用多种生物素化凝集素进行探查，该方法可有效建立特定人源或动物样本中不同蛋白质的糖基化谱型。

引言

蛋白质糖基化是蛋白质最常见的翻译后修饰，能够改变蛋白质的物理、化学和生物学特性，在多种生物学过程中发挥基础性作用^1-6由于糖基化机制特别容易受到疾病进展和恶性转化的影响，异常糖基化已被视为癌症及其他疾病的早期检测生物标志物。 ^7-12事实上，目前大多数癌症生物标志物，例如甲胎蛋白L3组分 α甲胎蛋白（AFP）用于肝细胞癌 ^13-15以及胰腺癌的CA199 ^{16, 17} 均为糖蛋白上的异常糖链结构。然而，研究蛋白质糖基化的方法一直较为复杂，不适合常规实验室和临床环境。Chen 等 最近发明了一种化学阻断抗体微阵列，结合聚糖结合蛋白（GBP）检测方法，可用于复杂样品中天然糖蛋白糖基化的高通量、多重分析 ¹⁸在此基于亲和力的微阵列方法中，多种固定化的糖蛋白特异性抗体直接在微阵列芯片上捕获并分离复杂混合物中的糖蛋白，随后通过糖结合蛋白（GBPs）检测每种被捕获蛋白上的糖链。由于所有正常的抗体均含有N-糖链，而这些N-糖链可被大多数GBPs识别，因此该方法的关键步骤是化学封闭抗体上的糖链，以阻止其与GBPs结合。在该实验流程中， cis抗体上糖链的二醇基团首先通过使用NaIO氧化为醛基₄ 在避光条件下，使用醋酸钠缓冲液进行反应。随后，醛基与交联剂4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸肼盐酸盐（MPBH）的肼基发生偶联，接着将二肽Cys-Gly连接至MPBH的马来酰亚胺基团。因此，抗体糖链上的顺式二醇基团被转化为体积较大的非羟基基团，从而阻碍了凝集素及其他糖结合蛋白（GBPs）与捕获抗体的结合。该化学封闭步骤确保GBPs和凝集素仅与被捕获蛋白的糖链结合。完成化学封闭后，将血清样本与抗体微阵列孵育，随后使用不同的生物素标记的凝集素和糖结合蛋白检测糖链，并通过Cy3标记的链霉亲和素进行可视化。联合使用抗体阵列与多种凝集素探针，可获得特定样本中多种蛋白质的特异性糖基化谱型 抗体微阵列, 凝集素, 糖基化, 糖结合蛋白, 化学封闭, 顺式二醇, MPBH, Cys-Gly, 醋酸钠缓冲液, Cy3-链霉亲和素 ^18-20该方法已在多个不同的实验室中成功应用 ^{1, 7, 13, 19-31}然而，该方法中MPBH和Cys-Gly的稳定性较差，且操作步骤复杂、耗时较长，影响了方法的可重复性、有效性和效率。在本新方案中，我们用一种更为稳定的试剂谷氨酸酰肼（Glu-hydrazide）替代了MPBH和Cys-Gly，显著提高了方法的可重复性，并简化和缩短了整个操作流程，使其可在一天工作时间内完成。在本新方案中，我们详细描述了该方法的具体操作步骤，可被普通实验室常规用于蛋白质糖基化研究，并介绍了获得可重复和可再现结果所必需的技术要点。

方案

1. 为检测打印抗体微阵列

1. 将所有抗体用磷酸盐缓冲液（pH 7.2，PBS）稀释至 0.5 mg/ml。
2. 将每种抗体各 40 μl 分装至 384 孔源板中。
3. 将 384 孔源板装载到 Scienion sciFLEXARRAYER 微阵列仪上。
4. 将 20 张 PATH 微阵列玻片作为靶标装载到微阵列仪上。
5. 设置微阵列仪打印 48 个相同的子阵列，其中 27 种抗体和对照蛋白以 9×9 的模式三复孔点样（图 1E、1F）。
6. 启动微阵列仪开始打印抗体微阵列玻片。
7. 收集打印完成的抗体微阵列玻片，放入带有干燥剂的玻片盒中，并使用真空封口机（Foodsaver）将玻片盒在塑料袋内真空密封。
8. 将密封的微阵列玻片置于冰箱中 4 °C 保存。

2. 化学封闭抗体微阵列以防止GBP结合捕获抗体

微阵列实验在微阵列芯片经过化学封闭后开始，持续约8小时。一旦开始微阵列实验，必须完成后续所有步骤（步骤2至步骤8）。

1. 从冰箱中取出微阵列玻片，在室温下平衡30分钟。
2. 将玻片从储存盒中取出，在玻片洗涤槽中依次用含0.1% Tween 20的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）（PBST0.1）短暂漂洗一次....

讨论

1. 目标蛋白与捕获抗体的选择

在进行抗体微阵列实验之前，需要考虑并准备一些试剂和材料。为了设计用于聚糖分析或聚糖生物标志物筛选的抗体微阵列，应根据文献报道或先前的研究结果确定一组针对糖蛋白候选分子的特异性抗体。这些抗体通常从不同的供应商（如 R&D Systems 等）购买。优先选择 IgG 作为捕获抗体，因为此前的实验结果表明，某些 IgM 和 IgE 在化学修饰后可能会完全丧失其抗原结合亲和力。

2. 抗体微阵列的设计与制备

抗体微阵列的制备是一个可选步骤，需要专业的昂贵微阵列点样仪以及经过良好培训的操作人员。然而，定制的抗体微阵列制备可方便地通过服务提供商完成，例如 Serome Biosciences Inc.。为了获得可靠的结果，我们推荐使用非接触式微阵列点样仪，例如在本研究中用于抗体微阵列制备的 Scienion sciFLEXARRAYER 超低体积非接触式微阵列点样仪。建议使用高结合容量的微阵列载玻片，例如 PATH（Gentel Bio Inc. WI）或.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物素化刀豆球蛋白A	Vector Laboratories	BK-1000	ConA
生物素标记的欧洲接骨木凝集素	Vector Laboratories	B-1305	SNA
生物素标记的扁豆凝集素	Vector Laboratories	BK-2000	LCA
生物素标记的蓖麻凝集素 I	Vector Laboratories	BK-1000	RCA
生物素标记的橙黄假脐菇凝集素	Vector Laboratories	B-1395	AAL
生物素标记的刺槐凝集素	Vector Laboratories	BK-3000	ECL
生物素标记的扁豆凝集素II	Vector Laboratories	BK-3000	GSL II
生物素标记的小麦胚芽凝集素	Vector Laboratories	BK-1000	WGA
生物素标记的菜豆红细胞凝集素	Vector Laboratories	BK-2000	PHA-E
生物素标记的菜豆白细胞凝集素	Vector Laboratories	BK-2000	PHA-L
生物素标记的花生凝集素	Vector Laboratories	BK-1000	PNA
生物素标记的豌豆凝集素	Vector Laboratories	BK-2000	PSA
生物素标记的双花扁豆凝集素	Vector Laboratories	BK-1000	DBA
生物素标记的曼陀罗凝集素	Vector Laboratories	BK-3000	DSL
生物素标记的槐凝集素	Vector Laboratories	BK-2000	SJA
生物素标记的大豆凝集素	Vector Laboratories	BK-1000	SBA
生物素标记的马铃薯凝集素	Vector Laboratories	BK-3000	STL
生物素标记的扁豆凝集素 I	Vector Laboratories	BK-2000	GSL I
生物素标记的绒毛豌豆凝集素	Vector Laboratories	BK-2000	VVL
生物素标记的番茄凝集素（Biotinylated Lycopersicon esculentum Lectin）	Vector Laboratories	BK-3000	LEL
生物素标记的荆豆凝集素 I	Vector Laboratories	BK-1000	UEA I
生物素标记的茉卡凝集素	Vector Laboratories	BK-3000	JACALIN
山羊F(ab')2片段抗人IgM，Fc5μ 抗体	杰克逊免疫研究公司	109-006-129	IgM
驴F(ab')2片段抗人IgG（H+L）抗体	杰克逊免疫研究公司	709-006-149	AB1
小鼠抗人IgG F(ab')2单克隆抗体	杰克逊免疫研究公司	209-005-097	AB3
山羊抗人α2巨球蛋白多克隆抗体	GeneTex	GTX62924	A2M
兔抗人α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体	Lee Biosiences	CA1T-80A	A1AT
小鼠抗人α1-抗胰蛋白酶单克隆抗体	Sigma-Aldrich	SAB4200198	A1AT
兔抗人α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体	NeoMarkers	RB-367-A1	ACT
兔抗人α-1-抗糜蛋白酶多克隆抗体	Fisher Scientific	RB9213R7	ACT
小鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体	GeneTex	GTX101035	转铁蛋白
兔抗人转铁蛋白多克隆抗体	GeneTex	GTX77130	转铁蛋白
山羊抗人载脂蛋白J多克隆抗体	Abcam	ab7610	ApoJ
小鼠抗人GP73单克隆抗体	雅培实验室	14H4-23	GP73
小鼠抗人GP73单克隆抗体	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC	sc-101275	GP73
兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体	GenWay	GWB-41C966	AFP
小鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体	Fitzgerald	10-A05A	AFP
小鼠抗人血红素结合蛋白单克隆抗体	Assaypro	60190-05011	血红素结合蛋白
小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（1G12）单克隆抗体	Santa Cruz Bio	sc-65443	GPL3
小鼠抗人激肽原（低分子量）单克隆抗体	Assaypro	20333-05011	激肽原
兔抗人MMP-21单克隆抗体	表位组	1955-1	MMP21
小鼠抗人CEACAM-1单克隆抗体	R&D Systems	MAB1180	CEACAM
抗人DPPIV/CD26单克隆抗体（大鼠源）	R&D Systems	MAB22441	DPPIV
小鼠抗人PIVKA II单克隆抗体	晶体化学	8040	PIVICA
小鼠抗癌蛋白–胚胎抗原	美国生物	C1300	癌胚抗原
小鼠抗CA125癌抗原	美国生物学	C0050-01D	CA125
小鼠抗-CA19-9 癌抗原	美国生物学	C0075-18	CA19-9
小鼠抗Lewis x单克隆抗体	Calbiochem	434631	Lewis X
生物素标记的BSA（阳性对照）	自制	N/A	生物
<强>表1. 本方案中使用的凝集素和抗体列表
非接触式微阵列点样仪	BioDot 公司	sciFLEXARRAYER
384 孔板	Fisher Scientific	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
超薄硝酸纤维素包被微阵列载玻片	Gentel	PATH
滑片印迹器（可选）	The Gel Company	WSP60-1
沙克尔	Fisher Scientific	15-453-211
离心	Eppendorf	5804 000.013
带可拆卸架的载玻片清洗槽/载玻片染色皿	Fisher Scientific	08-812
孵育盒/载玻片盒	Fisher Scientific	03-448-5
Brij 35，30 w/v% 水溶液	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Fisher Scientific	P337-100
高碘酸钠（NaIO₄）4)	Sigma-Aldrich	311448
L-谷氨酸 γ-肼	Sigma-Aldrich	G-7257
无水乙酸钠（CH3COONa	Sigma-Aldrich	S2889
牛血清白蛋白（BSA）	Lampire Biological Labs	7500804
磷酸盐缓冲液（PBS）（10倍浓缩液）	Denville Scientific	CP4390-48
Dylight 549 标记的 NeutrAvidin	赛默飞世尔科技公司	22837
蛋白酶抑制剂混合物片剂	罗氏集团	4693159001
ChromPure 人 IgG，Fc 片段	杰克逊免疫研究实验室	009-000-008
ChromPure 人IgG，完整分子	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
ChromPure 小鼠 IgG，全分子	杰克逊免疫研究实验室	015-000-003
ChromPure 小鼠 IgG，Fc 片段	杰克逊免疫研究实验室	015-000-008
ChromPure 兔 IgG，全分子	杰克逊免疫研究实验室	011-000-003
ChromPure 驴IgG，全分子	杰克逊免疫研究实验室	017-000-003
微阵列扫描仪	Tecan集团有限公司	LS 重新加载
<强>表2. 本方案中使用的仪器与试剂清单