方法文章

用于复杂样本中特定蛋白质糖基化多重高通量分析的化学封闭抗体微阵列

DOI：

10.3791/3791

⸱

2012年5月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中，我们描述了一种改进的多重高通量抗体微阵列结合凝集素检测方法的实验方案，可用于特定蛋白质的糖基化谱分析。该方案采用了新的可靠试剂，与先前方法相比，显著缩短了实验时间，降低了成本，并减少了对实验室设备的需求。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究描述了一种高效的多重高通量抗体微阵列方法，结合凝集素类糖结合蛋白（GBP）检测，用于特异性蛋白质的糖基化谱分析。蛋白质糖基化是蛋白质中最常见的翻译后修饰，可导致蛋白质在物理、化学及生物学特性上的多样化改变。由于糖基化机制极易受到疾病进展和恶性转化的影响，异常糖基化已被公认为癌症及其他疾病的早期检测生物标志物。然而，目前研究蛋白质糖基化的常用方法通常过于复杂或昂贵，难以在大多数常规实验室或临床环境中广泛应用，因此亟需一种更为实用的技术手段。本研究中介绍的新方法采用化学封闭的抗体微阵列并结合糖结合蛋白（GBP）检测，显著降低了研究蛋白质糖基化所需的时间、成本以及对实验设备的要求。该方法将多种针对糖蛋白的特异性抗体直接点样于微阵列芯片上，并对抗体上的N-糖链进行化学封闭。经过封闭处理并固定于芯片上的糖蛋白特异性抗体，能够直接从复杂样本中捕获并分离目标糖蛋白。随后通过向微阵列芯片施加生物素标记的凝集素及其他GBP进行糖链检测，结合Dylight 549标记的链霉亲和素来测定结合水平。利用一组特异性抗体并使用多种生物素化凝集素进行探查，该方法可有效建立特定人源或动物样本中不同蛋白质的糖基化谱型。

引言

蛋白质糖基化是蛋白质最常见的翻译后修饰，能够改变蛋白质的物理、化学和生物学特性，在多种生物学过程中发挥基础性作用1-6由于糖基化机制特别容易受到疾病进展和恶性转化的影响，异常糖基化已被视为癌症及其他疾病的早期检测生物标志物。 7-12事实上，目前大多数癌症生物标志物，例如甲胎蛋白L3组分 α甲胎蛋白（AFP）用于肝细胞癌 13-15以及胰腺癌的CA199 16, 17 均为糖蛋白上的异常糖链结构。然而，研究蛋白质糖基化的方法一直较为复杂，不适合常规实验室和临床环境。Chen 等 最近发明了一种化学阻断抗体微阵列，结合聚糖结合蛋白（GBP）检测方法，可用于复杂样品中天然糖蛋白糖基化的高通量、多重分析 18在此基于亲和力的微阵列方法中，多种固定化的糖蛋白特异性抗体直接在微阵列芯片上捕获并分离复杂混合物中的糖蛋白，随后通过糖结合蛋白（GBPs）检测每种被捕获蛋白上的糖链。由于所有正常的抗体均含有N-糖链，而这些N-糖链可被大多数GBPs识别，因此该方法的关键步骤是化学封闭抗体上的糖链，以阻止其与GBPs结合。在该实验流程中， cis抗体上糖链的二醇基团首先通过使用NaIO氧化为醛基4 在避光条件下，使用醋酸钠缓冲液进行反应。随后，醛基与交联剂4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸肼盐酸盐（MPBH）的肼基发生偶联，接着将二肽Cys-Gly连接至MPBH的马来酰亚胺基团。因此，抗体糖链上的顺式二醇基团被转化为体积较大的非羟基基团，从而阻碍了凝集素及其他糖结合蛋白（GBPs）与捕获抗体的结合。该化学封闭步骤确保GBPs和凝集素仅与被捕获蛋白的糖链结合。完成化学封闭后，将血清样本与抗体微阵列孵育，随后使用不同的生物素标记的凝集素和糖结合蛋白检测糖链，并通过Cy3标记的链霉亲和素进行可视化。联合使用抗体阵列与多种凝集素探针，可获得特定样本中多种蛋白质的特异性糖基化谱型 抗体微阵列, 凝集素, 糖基化, 糖结合蛋白, 化学封闭, 顺式二醇, MPBH, Cys-Gly, 醋酸钠缓冲液, Cy3-链霉亲和素 18-20该方法已在多个不同的实验室中成功应用 1, 7, 13, 19-31然而，该方法中MPBH和Cys-Gly的稳定性较差，且操作步骤复杂、耗时较长，影响了方法的可重复性、有效性和效率。在本新方案中，我们用一种更为稳定的试剂谷氨酸酰肼（Glu-hydrazide）替代了MPBH和Cys-Gly，显著提高了方法的可重复性，并简化和缩短了整个操作流程，使其可在一天工作时间内完成。在本新方案中，我们详细描述了该方法的具体操作步骤，可被普通实验室常规用于蛋白质糖基化研究，并介绍了获得可重复和可再现结果所必需的技术要点。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 为检测打印抗体微阵列

  1. 将所有抗体用磷酸盐缓冲液（pH 7.2，PBS）稀释至 0.5 mg/ml。
  2. 将每种抗体各 40 μl 分装至 384 孔源板中。
  3. 将 384 孔源板装载到 Scienion sciFLEXARRAYER 微阵列点样仪上。
  4. 将 20 张 PATH 微阵列玻片作为靶标装载到微阵列点样仪上。
  5. 设置微阵列点样仪打印 48 个相同的子阵列，每个子阵列中 27 种抗体和对照蛋白以 9×9 排列方式三复孔点样（图 1E、1F）。
  6. 启动微阵列点样仪开始打印抗体微阵列玻片。
  7. 收集打印完成的抗体微阵列玻片，放入带有干燥剂的玻片盒中，并使用真空封口机（Foodsaver）将玻片盒在塑料袋内真空密封。
  8. 将密封的微阵列玻片置于 4 °C 冰箱中保存。

2. 化学封闭抗体微阵列以防止GBP结合捕获抗体

微阵列实验在微阵列芯片经过化学封闭后开始，持续约8小时。一旦开始微阵列实验，必须完成全部步骤（步骤2至步骤8）。

  1. 从冰箱中取出微阵列芯片，于室温下平衡30分钟。
  2. 将芯片从储存盒中取出，在玻片洗涤槽中依次用含0.1% Tween 20的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）（PBST0.1）短暂漂洗一次，再用含0.1% Tween的15 mM醋酸钠缓冲液（pH 5.0）（CBT0.1）进行漂洗。随后将芯片置于CBT0.1中，在玻片洗涤槽中孵育10分钟。
  3. 配制新鲜的150 mM NaIO4溶于15 mM醋酸钠缓冲液（pH 5.0）（CB）中，并在使用前将其置于冰箱中避光保存于玻片洗涤槽内。
  4. 将芯片从CB中取出，放入盛有新鲜NaIO4溶液的洗涤槽中，确保抗体面朝上。用铝箔覆盖洗涤槽以避光，并在4 °C冰箱中轻轻振荡孵育2小时。
  5. 配制300 mL含10 mM酰肼基谷氨酸（封闭剂）的CB缓冲液。
  6. 将芯片从洗涤槽中取出，在玻片洗涤槽中用CB缓冲液漂洗3次，每次5分钟。
  7. 将芯片放入洗涤槽中的封闭剂溶液中，在室温下轻轻振荡孵育2小时。
  8. 将芯片从洗涤槽中取出，用PBST0.1缓冲液洗涤3分钟。

3. 使用牛血清白蛋白（BSA）封闭微阵列的非特异性结合位点

  1. 在载玻片洗涤槽中配制 300 ml 含 0.5% Tween 的 1% BSA 磷酸盐缓冲液（pH 7.2，PBST0.5），将微阵列载玻片放入槽中，在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。
  2. 用 PBST0.1 漂洗载玻片，每次 3 分钟，共漂洗 3 次。
  3. 将载玻片置于载玻片架上，在 1,200 × g 离心机中离心 2 分钟以干燥微阵列载玻片。

4. 将石蜡网格压印到微阵列芯片上以分隔每个子阵列

  1. 将蜡印仪预热至 70 °C，持续 5 分钟。
  2. 将已封闭的微阵列芯片装入蜡印仪中，抗体面朝向蜡膜。轻轻拉动把手，使蜡均匀地印在芯片上。

5. 将血清样本施加到微阵列芯片上

  1. 在步骤 2.4 期间，准备血清样本用于单个样本的糖基谱分析实验（5.1.1），或用于多个样本中的单一糖基表位检测（5.1.2）。
    1. 在使用多种 GBP 对单个血清样本中的多种血清糖蛋白进行糖链谱型分析的实验中（参见示例实验 1），将同一样本应用于所有子阵列。此时，将 40 μl 血清样本稀释至 360 μl 含有 0.1% Tween-20、0.1% Brij 35、100 μg/mL 小鼠 IgG、100 μg/mL 大鼠 IgG、100 μg/mL 兔 IgG、100 μg/mL 山羊 IgG 和 100 μg/mL 驴 IgG 的 PBS 溶液中。该体积足以在每个子阵列上加样 6 μl 稀释后的血清溶液。
    2. 在使用单一 GBP 检测多个血清样本中多种血清蛋白的单一糖链结构的实验中（参见示例实验 2），将 1 μl 血清样本稀释至 9 μl 含有 0.1% Tween-20、0.1% Brij 35、100 μg/mL 小鼠 IgG、100 μg/mL 大鼠 IgG、100 μg/mL 兔 IgG、100 μg/mL 山羊 IgG 和 100 μg/mL 驴 IgG 的 PBS 溶液中。该体积足以在每个子阵列上加样 6 μL 稀释后的血清溶液。
  2. 在步骤 4 完成蜡印后，小心地将 6 μL 稀释样本或对照样本（PBST0.1）加至玻片的每个子阵列上。将玻片置于加湿盒中，盒内放置湿润的纸巾，于室温孵育 1 小时。
  3. 用 PBST0.1 漂洗玻片三次，每次 3 分钟。
  4. 以 1200 × g 离心 2 分钟干燥玻片。

6. 将生物素标记的GBP（凝集素或抗聚糖抗体）加到载玻片上

  1. 在步骤 2.4 中，用 PBST0.1 配制浓度为 10 μg/mL 的生物素化凝集素/GBPs 溶液。
    1. 在使用多种凝集素探针检测一个样本的糖链谱分析实验中（示例实验 1），配制 350 μL 生物素化凝集素溶液，足以用于所有子阵列。
    2. 在使用多种凝集素对多个样本进行单个糖表位/生物标志物筛选时，每种生物素化凝集素配制 10 μL，足以用于一个子阵列。
  2. 将 6 μL 稀释后的生物素化凝集素溶液分别加至芯片的每个子阵列上，置于加湿的载片盒中（内含湿润的纸巾），室温孵育 1 小时。
  3. 用 PBST0.1 漂洗芯片，每次 3 分钟，共漂洗 3 次。
  4. 将芯片在离心机中以 1200 × g 转速离心 2 分钟，使其干燥。

7. 应用染料标记的NeutrAvidin进行荧光检测

  1. 准备 350 μL Dylight 549 标记的 NeutrAvidin，足以用于所有亚阵列。
  2. 向每个亚阵列上加 6 μL Dylight 549 标记的 NeutrAvidin，并将玻片置于湿盒中，室温孵育 1 小时。
  3. 用 PBST0.1 漂洗玻片三次，每次 3 分钟。
  4. 将玻片放入离心机中，以 1200 × g 转速离心 2 分钟，使其干燥。

8. 通过扫描芯片获取微阵列芯片图像

  1. 使用荧光微阵列扫描仪以 10 μm 分辨率扫描玻片。激光和 PMT 设置应尽可能强，但不得出现饱和信号点。

9. 数据提取与分析

  1. 在 ArrayPro 3.2 中打开图像。
  2. 根据显示抗体点位置的阵列图设置阵列模板。仔细将每个模板圆圈对准图像中相应的点。
  3. 将每个点的强度提取到 Excel 文件中以进行进一步分析。

10. 代表性结果

示例实验 1

利用化学封闭的抗体微阵列联合多种凝集素检测，对中国肝细胞癌患者血清样本中多种血清糖蛋白进行糖基化谱分析。

本实验旨在利用化学封闭的抗体微阵列结合凝集素检测技术，分析肝细胞癌（HCC）患者血清样本中20种糖蛋白的个体糖基化谱。如步骤1所述，设计并制备了一种包含48个相同子阵列的抗体微阵列，每个子阵列包括26种抗体和生物素标记的BSA。这26种抗体靶向20种血清糖蛋白，这些糖蛋白此前通过基于凝集素的免疫沉淀联合质谱蛋白质鉴定方法被确认为HCC患者早期诊断的潜在标志物12, 32，如表1所示。一个代表性子阵列中抗体点样重复打印的排列模式分别如图1E和1F所示。使用两张相同的微阵列玻片进行相同的糖基化谱分析实验，其中一张未进行化学封闭（图1A），另一张则进行了化学封闭（图1B），以展示化学封闭步骤对分析的重要性。对于化学封闭的玻片（图1B），实验从步骤2开始；而对于未化学封闭的玻片（图1A），实验则从步骤3开始。实验按照方案中描述的所有步骤进行，但不包括步骤5.1.2和6.1.2。在步骤5.2中，将PBST0.1对照样本分别加至第1列和第3列的子阵列，将混合HCC血清样本分别加至第2列和第4列的子阵列（如图1G所示）。该对照用于评估化学封闭后实验流程的有效性、效率以及抗体对抗原的结合亲和力。将22种生物素标记的凝集素（如表1所示）特异性识别不同糖链结构18, 20，按图1G所示加至每个子阵列，用于糖基化谱分析。图示为按照实验方案完成糖基化谱检测后，经化学封闭（图1B）与未化学封闭（图1A）的微阵列图像。如未化学封闭微阵列的第1列和第3列子阵列（图1A和图1C）所示，仅加入PBST0.1的区域，大多数凝集素与捕获抗体发生结合，背景信号非常高，与加入血清样本的第2列和第4列子阵列信号相当。因此，无法从此类微阵列玻片获得有效的糖链谱信息。相反，在化学封闭的抗体微阵列玻片上进行相同实验时，仅加入PBST0.1的第1列和第3列子阵列中，大多数凝集素几乎不结合或仅有极低水平结合捕获抗体；而在加入血清样本的第2列和第4列子阵列中，仍可观察到强烈的抗原结合信号（图1B和1D）。这些结果表明，化学封闭步骤是准确检测抗体捕获糖蛋白上糖链的关键环节。按照本实验方案，可获得HCC血清中22种糖蛋白的糖基化谱。

实验 2

筛选特定血清糖蛋白上岩藻糖基化的改变，作为区分肝硬化与肝细胞癌患者的生物标志物。

本实验旨在筛选肝硬化和肝细胞癌（HCC）患者血清中特定糖蛋白岩藻糖基化的改变，以寻找可用于区分两者的生物标志物。与实验1不同，本实验并非在每个子阵列上仅应用一份血清样本并用多种凝集素进行探查，而是将来自HCC和肝硬化患者共40份不同的血清样本分别点样到每个子阵列上，并使用一种凝集素（AAL）进行探查。通过t检验、受试者工作特征（ROC）曲线等统计分析方法，评估每份血清样本中各单个蛋白上的糖链表位/生物标志物的分布情况或诊断性能。本研究中使用的抗体微阵列与实验1相同，但未包含抗CA19-9和抗Lewis X抗体。实验步骤从第2步至第9步，但不包括第5.1.1和6.1.1步。总共40份血清样本（其中20份来自肝硬化患者，20份来自HCC患者）被随机点样至48个子阵列中的不同位置，同时加入PBS对照样本作为阴性对照。随后，利用生物素标记的特异性识别岩藻糖的凝集素检测各被捕获蛋白的岩藻糖基化水平。如图1所示，凝集素AAL仅结合微阵列上被捕获的血清蛋白（图2D），而不结合被捕获的抗体（图2E）。提取所有点的AAL结合信号强度，并通过t检验和ROC曲线分析，评估每种血清蛋白的岩藻糖基化（即AAL结合强度）在区分HCC组与肝硬化组中的表现。结果显示，GP73蛋白的岩藻糖基化在两组间的区分能力最佳，其p = 0.03，ROC曲线下面积为0.72。本实验表明，该方法是一种快速、高效的多蛋白、多样本糖链表位/生物标志物筛选策略。

编号试剂名称缩写公司目录号
L1生物素化刀豆蛋白AConAVector LaboratoriesBK-1000
L2生物素化黑接骨木凝集素SNAVector LaboratoriesB-1305
L3生物素化扁豆凝集素LCAVector LaboratoriesBK-2000
L4生物素化蓖麻凝集素IRCAVector LaboratoriesBK-1000
L5生物素化橙黄阿耶洛霉凝集素AALVector LaboratoriesB-1395
L6生物素化鸡冠花凝集素ECLVector LaboratoriesBK-3000
L7生物素化长蒴黄耆凝集素IIGSL IIVector LaboratoriesBK-3000
L8生物素化麦胚凝集素WGAVector LaboratoriesBK-1000
L9生物素化菜豆红细胞凝集素PHA-EVector LaboratoriesBK-2000
L10生物素化菜豆白细胞凝集素PHA-LVector LaboratoriesBK-2000
L11生物素化花生凝集素PNAVector LaboratoriesBK-1000
L12生物素化豌豆凝集素PSAVector LaboratoriesBK-2000
L13生物素化双花扁豆凝集素DBAVector LaboratoriesBK-1000
L14生物素化曼陀罗凝集素DSLVector LaboratoriesBK-3000
L15生物素化槐凝集素SJAVector LaboratoriesBK-2000
L16生物素化大豆凝集素SBAVector LaboratoriesBK-1000
L17生物素化马铃薯凝集素STLVector LaboratoriesBK-3000
L18生物素化长蒴黄耆凝集素IGSL IVector LaboratoriesBK-2000
L19生物素化毛苕子凝集素VVLVector LaboratoriesBK-2000
L20生物素化番茄凝集素LELVector LaboratoriesBK-3000
L21生物素化荆豆凝集素IUEA IVector LaboratoriesBK-1000
L22生物素化刺毛黧豆凝集素JACALINVector LaboratoriesBK-3000
A1山羊F(ab')2片段抗人IgM、Fc5μ抗体IgMJackson Immuno Research109-006-129
A2驴F(ab')2片段抗人IgG（H+L）抗体AB1Jackson Immuno Research709-006-149
A3小鼠抗人IgG F(ab')2单克隆抗体AB3Jackson Immuno Research209-005-097
A4山羊抗人α2巨球蛋白多克隆抗体A2MGeneTexGTX62924
A5兔抗人α-1-抗胰蛋白酶多克隆抗体A1ATLee BiosiencesCA1T-80A
A6小鼠抗人α-1-抗胰蛋白酶单克隆抗体A1ATSigma AldrichSAB4200198
A7兔抗人α-1-抗胰蛋白酶多克隆抗体ACTNeoMarkersRB-367-A1
A8兔抗人α-1-抗糜蛋白酶多克隆抗体ACTFisher ScientificRB9213R7
A9小鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体转铁蛋白GeneTexGTX101035
A10兔抗人转铁蛋白多克隆抗体转铁蛋白GeneTexGTX77130
A11山羊抗人载脂蛋白J多克隆抗体ApoJAbcamab7610
A12小鼠抗人GP73单克隆抗体GP73Abbott14H4-23
A13小鼠抗人GP73单克隆抗体GP73SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INCsc-101275
A14兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体AFPGenWayGWB-41C966
A15小鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体AFPFitzgerald10-A05A
A16小鼠抗人血红素结合蛋白单克隆抗体血红素结合蛋白Assaypro60190-05011
A17小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(1G12)单克隆抗体GPL3Santa Cruz Biosc-65443
A18小鼠抗人激肽原（低分子量）单克隆抗体激肽原Assaypro20333-05011
A19兔抗人MMP-21单克隆抗体MMP21Epitomic1955-1
A20小鼠抗人CEACAM-1单克隆抗体CEACAMR&D SystemsMAB1180
A21大鼠抗人DPPIV/CD26单克隆抗体DPPIVR&D SystemsMAB22441
A22小鼠抗人PIVKA II单克隆抗体PIVICACrystal chem8040
A23小鼠抗癌胚抗原CEAUS biologicalC1300
A24小鼠抗CA125肿瘤抗原CA125US biologicalC0050-01D
A25小鼠抗CA19-9肿瘤抗原CA19-9US biologicalC0075-18
A26小鼠抗Lewis x单克隆抗体Lewis XCalbiochem434631
bio生物素化牛血清白蛋白（阳性对照）Bio自制N/A

表1. 本方案中使用的凝集素和抗体列表。

试剂/设备名称公司目录编号
非接触式微阵列点样仪BioDot IncsciFLEXARRAYER
384 孔微孔板Fisher14-230-243
FoodSaverFoodSaverV3835
超薄硝酸纤维素包被微阵列载玻片GentelPATH
载玻片印片仪（可选）The Gel CompanyWSP60-1
摇床Fisher15-453-211
离心机Eppendorf5804 000.013
载玻片清洗槽/带可拆卸架的载玻片染色皿Fisher08-812
载玻片孵育盒/显微镜载玻片盒Fisher03-448-5
Brij 35，水中 30 w/v% 溶液Acros OrganicsAC32958-0025
Tween-20FisherP337-100
高碘酸钠 (NaIO4)Sigma311448
L-谷氨酸 γ-酰肼SigmaG-7257
无水乙酸钠 (CH3COONa)SigmaS2889
牛血清白蛋白 (BSA)Lampire Biological Labs7500804
磷酸盐缓冲液 (PBS) (10X)Denville ScientificCP4390-48
Dylight 549 标记的 NeutrAvidinThermo22837
蛋白酶抑制剂混合片剂Roche4693159001
ChromPure 人 IgG，Fc 片段Jackson Immunoresearch009-000-008
ChromPure 人 IgG，完整分子Jackson Immunoresearch009-000-003
ChromPure 小鼠 IgG，完整分子Jackson Immunoresearch015-000-003
ChromPure 小鼠 IgG，Fc 片段Jackson Immunoresearch015-000-008
ChromPure 兔 IgG，完整分子Jackson Immunoresearch011-000-003
ChromPure 驴 IgG，完整分子Jackson Immunoresearch017-000-003
微阵列扫描仪TecanLS Reloaded

表2. 本实验方案中使用的仪器和试剂列表。

figure-protocol-1
示意图 1. 基于凝集素抗体微阵列的糖链生物标志物发现流程示意图。1（步骤 2 至 4）：使用阻断剂（Glu-肼）和 BSA 封闭抗体微阵列；2（步骤 5）：加入血清样本，利用特异性抗体捕获特定糖蛋白；3（步骤 6）：加入生物素标记的凝集素；4（步骤 7）：使用 Dylight 549 标记的 NeutrAvidin 探测生物素化的 AAL，进行微阵列成像。

figure-protocol-2
图1. 利用化学封闭抗体微阵列结合多种凝集素检测，对肝细胞癌（HCC）患者血清样本中多种血清糖蛋白进行糖基化谱分析的样本实验1微阵列图像。两张相同的微阵列玻片，(A) 未经化学封闭，或 (B) 按步骤2所述进行化学封闭，均经历了从步骤2到步骤9的全部糖基化谱分析流程，并用于比较目的。(A) 和 (B) 为在步骤8中以10微米分辨率扫描得到的微阵列图像；(C) 为未经化学封闭的微阵列玻片 (A) 前两行的放大图像；(D) 为化学封闭的微阵列玻片 (B) 前两行的放大图像；(E) 每个亚阵列内抗体排列示意图；(F) 阵列图谱：各抗体在亚阵列中的位置，每个抗体名称代表3个点；(G) 血清样本与凝集素位置示意图：显示各血清样本和凝集素所施加的亚阵列位置。

figure-protocol-3
图2. 样本实验2的微阵列图像，用于筛选血清中特定糖蛋白岩藻糖基化的改变，作为区分肝硬化与肝细胞癌（HCC）患者的生物标志物。微阵列实验按照样本实验2部分所述方法进行。（A）第8步所得微阵列玻片的整张玻片图像；（B）每个子阵列内抗体排列示意图；（C）阵列图谱：各抗体在子阵列中的位置，每个抗体名称代表3个点；（D）与血清样本孵育的子阵列局部放大图像；（E）与PBS对照孵育的子阵列局部放大图像。

figure-protocol-4
图3. 样品实验1的聚糖分析结果。每个条形图代表20种被测蛋白质中某一种的凝集素结合谱（或聚糖谱）。共使用22种不同的凝集素来分析每种蛋白质的聚糖谱。请点击此处查看此图的放大版本。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 目标蛋白与捕获抗体的选择

在进行抗体微阵列实验之前，需要考虑并准备一些试剂和材料。为了设计用于聚糖分析或聚糖生物标志物筛选的抗体微阵列，应根据文献报道或先前的研究结果确定一组针对糖蛋白候选分子的特异性抗体。这些抗体通常从不同的供应商（如 R&D Systems 等）购买。优先选择 IgG 作为捕获抗体，因为此前的实验结果表明，某些 IgM 和 IgE 在化学修饰后可能会完全丧失其抗原结合亲和力。

2. 抗体微阵列的设计与制备

抗体微阵列的制备是一个可选步骤，需要专业的昂贵微阵列点样仪以及经过良好培训的操作人员。然而，定制的抗体微阵列制备可方便地通过服务提供商完成，例如 Serome Biosciences Inc.。为了获得可靠的结果，我们推荐使用非接触式微阵列点样仪，例如在本研究中用于抗体微阵列制备的 Scienion sciFLEXARRAYER 超低体积非接触式微阵列点样仪。建议使用高结合容量的微阵列载玻片，例如 PATH（Gentel Bio Inc. WI）或...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由肝炎与病毒学研究所资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物素化刀豆球蛋白AVector LaboratoriesBK-1000ConA
生物素标记的欧洲接骨木凝集素Vector LaboratoriesB-1305SNA
生物素标记的扁豆凝集素Vector LaboratoriesBK-2000LCA
生物素标记的蓖麻凝集素 IVector LaboratoriesBK-1000RCA
生物素标记的橙黄假脐菇凝集素Vector LaboratoriesB-1395AAL
生物素标记的刺槐凝集素Vector LaboratoriesBK-3000ECL
生物素标记的扁豆凝集素IIVector LaboratoriesBK-3000GSL II
生物素标记的小麦胚芽凝集素Vector LaboratoriesBK-1000WGA
生物素标记的菜豆红细胞凝集素Vector LaboratoriesBK-2000PHA-E
生物素标记的菜豆白细胞凝集素Vector LaboratoriesBK-2000PHA-L
生物素标记的花生凝集素Vector LaboratoriesBK-1000PNA
生物素标记的豌豆凝集素Vector LaboratoriesBK-2000PSA
生物素标记的双花扁豆凝集素Vector LaboratoriesBK-1000DBA
生物素标记的曼陀罗凝集素Vector LaboratoriesBK-3000DSL
生物素标记的槐凝集素Vector LaboratoriesBK-2000SJA
生物素标记的大豆凝集素Vector LaboratoriesBK-1000SBA
生物素标记的马铃薯凝集素Vector LaboratoriesBK-3000STL
生物素标记的扁豆凝集素 IVector LaboratoriesBK-2000GSL I
生物素标记的绒毛豌豆凝集素Vector LaboratoriesBK-2000VVL
生物素标记的番茄凝集素（Biotinylated Lycopersicon esculentum Lectin）Vector LaboratoriesBK-3000LEL
生物素标记的荆豆凝集素 IVector LaboratoriesBK-1000UEA I
生物素标记的茉卡凝集素Vector LaboratoriesBK-3000JACALIN
山羊F(ab')2片段抗人IgM，Fc5μ 抗体杰克逊免疫研究公司109-006-129IgM
驴F(ab')2片段抗人IgG（H+L）抗体杰克逊免疫研究公司709-006-149AB1
小鼠抗人IgG F(ab')2单克隆抗体杰克逊免疫研究公司209-005-097AB3
山羊抗人α2巨球蛋白多克隆抗体GeneTexGTX62924A2M
兔抗人α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体Lee BiosiencesCA1T-80AA1AT
小鼠抗人α1-抗胰蛋白酶单克隆抗体Sigma-AldrichSAB4200198A1AT
兔抗人α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体NeoMarkersRB-367-A1ACT
兔抗人α-1-抗糜蛋白酶多克隆抗体Fisher ScientificRB9213R7ACT
小鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体GeneTexGTX101035转铁蛋白
兔抗人转铁蛋白多克隆抗体GeneTexGTX77130转铁蛋白
山羊抗人载脂蛋白J多克隆抗体Abcamab7610ApoJ
小鼠抗人GP73单克隆抗体雅培实验室14H4-23GP73
小鼠抗人GP73单克隆抗体SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INCsc-101275GP73
兔抗人甲胎蛋白多克隆抗体GenWayGWB-41C966AFP
小鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体Fitzgerald10-A05AAFP
小鼠抗人血红素结合蛋白单克隆抗体Assaypro60190-05011血红素结合蛋白
小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（1G12）单克隆抗体Santa Cruz Biosc-65443GPL3
小鼠抗人激肽原（低分子量）单克隆抗体Assaypro20333-05011激肽原
兔抗人MMP-21单克隆抗体表位组1955-1MMP21
小鼠抗人CEACAM-1单克隆抗体R&D SystemsMAB1180CEACAM
抗人DPPIV/CD26单克隆抗体（大鼠源）R&D SystemsMAB22441DPPIV
小鼠抗人PIVKA II单克隆抗体晶体化学8040PIVICA
小鼠抗癌蛋白–胚胎抗原美国生物C1300癌胚抗原
小鼠抗CA125癌抗原美国生物学C0050-01DCA125
小鼠抗-CA19-9 癌抗原美国生物学C0075-18CA19-9
小鼠抗Lewis x单克隆抗体Calbiochem434631Lewis X
生物素标记的BSA（阳性对照）自制N/A生物
<强>表1. 本方案中使用的凝集素和抗体列表
非接触式微阵列点样仪BioDot 公司sciFLEXARRAYER
384 孔板Fisher Scientific14-230-243
FoodSaverFoodSaverV3835
超薄硝酸纤维素包被微阵列载玻片GentelPATH
滑片印迹器（可选）The Gel CompanyWSP60-1
沙克尔Fisher Scientific15-453-211
离心Eppendorf5804 000.013
带可拆卸架的载玻片清洗槽/载玻片染色皿Fisher Scientific08-812
孵育盒/载玻片盒Fisher Scientific03-448-5
Brij 35，30 w/v% 水溶液Acros OrganicsAC32958-0025
Tween-20Fisher ScientificP337-100
高碘酸钠（NaIO₄）4)Sigma-Aldrich311448
L-谷氨酸 γ-肼Sigma-AldrichG-7257
无水乙酸钠（CH3COONaSigma-AldrichS2889
牛血清白蛋白（BSA）Lampire Biological Labs7500804
磷酸盐缓冲液（PBS）（10倍浓缩液）Denville ScientificCP4390-48
Dylight 549 标记的 NeutrAvidin赛默飞世尔科技公司22837
蛋白酶抑制剂混合物片剂罗氏集团4693159001
ChromPure 人 IgG，Fc 片段杰克逊免疫研究实验室009-000-008
ChromPure 人IgG，完整分子Jackson ImmunoResearch009-000-003
ChromPure 小鼠 IgG，全分子杰克逊免疫研究实验室015-000-003
ChromPure 小鼠 IgG，Fc 片段杰克逊免疫研究实验室015-000-008
ChromPure 兔 IgG，全分子杰克逊免疫研究实验室011-000-003
ChromPure 驴IgG，全分子杰克逊免疫研究实验室017-000-003
微阵列扫描仪Tecan集团有限公司LS 重新加载
<强>表2. 本方案中使用的仪器与试剂清单

参考文献

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