化学阻断抗体芯片复用高通量的复杂样品中特定蛋白糖基化的剖析

Summary

在这项研究中，我们描述了一个复用高通量抗体芯片与外源凝集素的检测方法，可以在特定的蛋白质糖基化分析改进协议。该协议提供了新的可靠的试剂和显着降低，相比以前的程序的时间，成本和实验室设备的要求。

Abstract

在这项研究中，我们描述了一个用于在复用高通量抗体芯片与糖结合蛋白检测，允许特定蛋白质的糖基化分析的有效协议。蛋白质糖基化是最常见的翻译后修饰，对蛋白质的发现，导致多元化的修改的物理，化学，生物学特性和蛋白质。由于糖基化机制是特别容易受到疾病的进展和恶性转化，异常糖基化已被确认为癌症和其他疾病的早期检测标志物。然而，目前的方法来研究蛋白糖基化通常是在最普通的实验室或临床的设置和使用更实用的方法来研究蛋白糖基化需要过于复杂或昂贵。在这项研究中所描述的新的协议，使得与糖结合使用的化学阻断抗体芯片蛋白（GBP）检测，并显着减少的时间，成本和实验室设备，需要研究蛋白糖基化的要求。在此方法中，多个固定的糖蛋白特异性抗体直接打印到芯片的幻灯片和抗体的N-糖链被封锁。受阻，固定糖蛋白特异性抗体能够捕获和隔离从一个复杂的样品，直接应用到芯片幻灯片糖蛋白。聚糖检测，然后可以进行生物素标记的凝集素和其他Gbps的芯片幻灯片的应用，而具有约束力的水平可以决定使用Dylight 549-链霉。通过使用多个生物素标记的凝集素抗体面板和探测，这种方法可以有效的发展，在一个特定的人或动物样品中发现的不同的蛋白质糖基化的文件。

介绍

蛋白糖基化，这是我S的 ​​最普遍的对蛋白质翻译后的修改，修改的物理，化学，生物特性的一种蛋白质，在^1-6各种生物过程中起着根本性的作用。由于糖基化机制是特别容易受到疾病的进展和恶性转化已被公认为早期发现癌症和其他疾病的^7-12生物标志物，异常糖基化。事实上，目前大多数肿瘤标志物，如三级分数的α-1，甲胎蛋白（法新社^）13-15肝癌，胰腺癌¹⁶ CA199检测^，有^17个是所有异常的糖蛋白的糖基。然而，研究蛋白糖基化的方法已经复杂，不适合常规实验室和临床设置。 Chen 等最近发明了一种化学阻断抗体芯片1糖结合蛋白（GBP），高吞吐量的检测方法在一个复杂的样品¹⁸届复轮廓本土糖蛋白的糖基化。多个固定的糖蛋白特异性抗体的亲和力在此基础芯片的方法，捕捉和隔离从复杂的混合物，直接对芯片的幻灯片的糖蛋白，对每一个人捕获的蛋白聚糖GBPS测量。因为所有正常的抗体含有N-糖链最Gbps的，可以确认，这种方法的关键步骤是化学阻断抗体聚糖结合英镑。在此过程中，CI S-二醇组抗体聚糖被首先氧化成醛基使用醋酸钠缓冲液避光NAIO _4。醛基肼组的交联剂，4 - （4 N-MaleimidoPhenyl的）丁酸盐酸肼（MPBH），随后的二肽，半胱氨酸，甘氨酸，酰亚胺组，共轭共轭MPBH。从而被转换成笨重没有羟基，这阻碍了外源凝集素和其他Gbps的绑定捕获抗体，聚糖对抗体的顺式二醇组。这堵过程使Gbps和外源凝集素结合，只捕获蛋白聚糖。阻断后，这个化学，血清标本聚糖检测，通过使用不同的生物素标记的凝集素和Gbps的抗体芯片孵育，用Cy3-链霉亲和观察。抗体面板和探测多个外源凝集素的并行使用提供了在一个给定的样本^18-20离散多种蛋白质糖基化型材。该方法已成功地应用于多个不同的实验室^{1，7，13，19-31。}然而，影响稳定MPBH和半胱氨酸，甘氨酸，复杂性和扩展的过程，在这个方法的重复性，该方法的有效性和效率。在这个新的协议，我们更换一个更加稳​​定MPBH和半胱氨酸，甘氨酸试剂谷氨酸肼（GLU-肼），从而显着提高了简化的方法，重现性和缩短整个程序，以便它可以在一个工作日内完成。在这个新的协议，我们描述的详细程序的协议，可以很容易地通过正常的实验室常规蛋白糖基化研究和技术，这是要获得可重复性和可重复的结果。

Protocol

1。打印检测抗体芯片

1. 所有的抗体稀释至0.5毫克/毫升磷酸盐缓冲液，pH值7.2（PBS）的。
2. 40μl每个抗体的分装成384井源板。
3. ，Scienion sciFLEXARRAYER的微阵列加载到384井源板。
4. 20 PATH芯片幻灯片加载到微阵列为目标。
5. 设置打印48个相同的子阵发现在一个9x9的模式（ 图1E，1F）一式三份，其中27个抗体和控制蛋白质微阵列。
6. 启动微阵列打印抗体芯片的幻灯片。
7. 收集的抗体芯片的幻灯片，在幻灯片与干燥剂的录像带和存储。真空密封在一个塑料袋，用真空封口机（Foodsaver）录像带。
8. 在4°C冰箱中保存的密封芯片的幻灯片。

2。化学座抗体芯片，以防止英镑捕获抗体结合

基因芯片检测开始后的芯片幻灯片化学堵塞，持续约8小时。一旦启动芯片分析已完成（步骤2至8）。

1. 采取的芯片滑出冰箱，，和室温平衡30分钟。
2. 从储物箱中取出的幻灯片，并简要磷酸盐缓冲液pH值7.2 0.1％吐温20（PBST0.1）在洗手盆幻灯片冲洗一次，然后在15毫米醋酸钠缓冲液pH值5.0与0.1％吐温（CBT0 .1）在一个连续的方式。在CBT0.1孵育的幻灯片，在幻灯片洗手盆10分钟。 ....

Discussion

1。目标蛋白质和捕获抗体的选择

抗体芯片检测之前，一些试剂和材料都需要考虑和准备。聚糖分析或聚糖的生物标志物的筛选，抗体的特定糖候选人的面板设计的抗体芯片，根据文献，或从先前的结果，应确定。购买来自不同厂商，如R＆D系统等的IgG，这些抗体通常是首选，因为我们以前的测试表明，一些IgM和IgE可能完全失去了化学修饰后，其抗原的亲和力捕获抗体。

2。抗体芯片的设计和制造

抗体芯片制造是一个可选的步骤，这需要专业和昂贵的微阵列，和训练有素的操作人员。然而，定制抗体芯片制造TURE可以很容易地做了一个健壮的结果，如Serome Biosciences公司的服务提供商，我们建议一种非接触式的微阵列，如Scienion sciFLEXARRAYER超低量非接触微阵列，这是在我们的抗体芯片制造使用。高结合能力芯片的幻灯片，如路径（Gentel生物公司WI）或幻灯片的H（索特，PA）。

3。选择和准备聚糖结合蛋白（Gbps）的糖基化分析

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
编号	试剂名称	缩写	公司	产品编号
母语	生物素伴刀豆球蛋白A	刀豆	媒介实验室	BK-1000
二级	接骨木黑质凝集素生物素	国民核算体系	媒介实验室	B - 1305
三级	生物素镜头扁豆凝集素	LCA的	媒介实验室	BK-2000
L4	生物素蓖麻凝集素我	的RCA	媒介实验室	BK-1000
腰	Aleuria Aurantia凝集素生物素	AAL的	媒介实验室	的B-1395
L6	刺桐Cristagalli凝集素生物素	的ECL	媒介实验室	BK-3000
L7的	生物素加纳（Bandeiraea）的Simplicifolia凝集素二	吉斯达二	媒介实验室	BK-3000
八楼	生物素小麦胚芽凝集素	WGA的	媒介实验室	BK-1000
采用L9	生物素绿豆寻常Erythroagglutinin	PHA-E的	媒介实验室	BK-2000
L10	生物素绿豆寻常Leucoagglutinin	PHA-L的	媒介实验室	BK-2000
L11	生物素标记的花生凝集素	巴勒斯坦民族权力机构	媒介实验室	BK-1000
L12	生物素豌豆凝集素	变压吸附	媒介实验室	BK-2000
L13号	Dolichos Biflorus凝集素生物素	DBA的	媒介实验室	BK-1000
L14	生物素曼陀罗曼陀罗凝集素	的DSL	媒介实验室	BK-3000
L15	生物素苦参粳稻凝集素	SJA	媒介实验室	BK-2000
L16号	生物素标记的大豆凝集素	校本评核	媒介实验室	BK-1000
L17	生物素化的马铃薯（土豆）凝集素	STL的	媒介实验室	BK-3000
L18的	生物素加纳（带eiraea）Simplicifolia凝集素我	吉斯达我	媒介实验室	BK-2000
第19课	蚕豆簇毛麦凝集素生物素	VVL	媒介实验室	BK-2000
L20的	生物素化的番茄（番茄）凝集素	LEL的	媒介实验室	BK-3000
为L21	生物素标记的荆豆凝集素我	UEA的我	媒介实验室	BK-1000
L22的	生物素Jacalin	JACALIN	媒介实验室	BK-3000
A1的	山羊F（下AB'）2片段的抗人IgM，Fc5μ抗体	IgM抗体	杰克逊免疫研究	109-006-129
A2的	驴F（AB'）2破片抗人IgG（H + L）tibody	AB1类	杰克逊免疫研究	709-006-149
A3的	鼠抗人IgG F（AB'）2单克隆抗体	AB3	杰克逊免疫研究	209-005-097
A4纸	羊抗人α2巨球蛋白的多克隆抗体	A2M开发	GeneTex	GTX62924
A5的	兔抗人α-1-抗胰蛋白酶多克隆抗体	A1AT	李Biosiences	CA1T-80A
A6的	鼠抗人α-1-抗胰蛋白酶单克隆抗体	A1AT	Sigma Aldrich公司	SAB4200198
A7的	兔抗人α-1-抗胰蛋白酶多克隆抗体	法	NeoMarkers	RB-367-A1的
A8的	兔抗人α-1-抗糜蛋白酶多克隆抗体	法	Fisher Scientific则	RB9213R7
A9的	鼠抗人转铁蛋白的单克隆抗体	转	GeneTex	GTX101035
A10的	兔抗人转铁蛋白的多克隆抗体	转	GeneTex	GTX77130
A11	羊抗人载脂蛋白J多克隆抗体	ApoJ	abcam	ab7610
A12往	鼠抗人GP73单克隆抗体	GP73	雅培	14H4-23
A13号	鼠抗人GP73单克隆抗体	GP73	圣克鲁斯生物技术公司	SC-101275
A14高速公路	兔抗人α-1 fetoprotein多克隆抗体	法新社	建屋	幸福感的41C966
A15	鼠抗人的α-1单克隆抗体甲胎蛋白	法新社	菲茨杰拉德	10-A05A
A16	鼠抗人单克隆抗体hemopexin	hemopexin	assaypro	60190-05011
A17中	鼠抗人的glypican，3（1G12）单克隆抗体	GPL3	圣克鲁斯生物	SC-65443
A18	鼠抗人激肽原（低分子量）单克隆抗体	激肽原	assaypro	20333-05011
A19中	兔抗人MMP-21单克隆抗体	MMP21	epitomic	1955-1
A20的	鼠抗人CEACAM-1单克隆antibod的Ÿ	CEACAM	R＆D系统	MAB1180
A21号	鼠抗人DPPIV/CD26单克隆抗体	DPPIV	R＆D系统	MAB22441
A22号	鼠抗人PIVKA第二单克隆抗体	PIVICA	晶体化学	8040
A23座	鼠标防癌胚抗原	东航	美国生物	C1300
A24的	小鼠抗血清CA125癌抗原	CA125的	美国生物	C0050-01D
A25	鼠标反CA19-9癌抗原	CA19-9	美国生物	C0075-18
A26	鼠标反刘易斯x的单克隆抗体	刘易斯X	Calbiochem公司	434631
生物	生物素标记的牛血清白蛋白（阳性对照）	生物	自制	N / A

试剂小号/设备名称	公司	目录编号
非接触微阵列	BioDot公司	sciFLEXARRAYER
384微孔板	费舍尔	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
超薄硝化棉coate芯片滑	gentel	路径
幻灯片印记（可选）	凝胶公司	WSP60-1
沙克尔	费舍尔	15-453-211
离心分离	Eppendorf公司	5804 000.013
洗手盆/幻灯片幻灯片可拆卸支架染色菜	费舍尔	08-812
幻灯片孵化室/显微镜幻灯片中	费舍尔	03-448-5
布里杰35 W / V，30％水溶液	Acros Organics公司	AC32958-0025
吐温20	费舍尔	P337-100
高碘酸钠（NAIO 4）	西格玛	311448
L-谷氨酸γ-肼	西格玛	G - 7257
无水醋酸钠（CH 3 COONa）	西格玛	S2889
牛血清白蛋白（BSA）	lampire生物实验室	7500804
磷酸盐缓冲液（PBS）（10X）	丹维尔科学	CP4390-48
dylight 549共轭NeutrAvidin	热	22837
蛋白酶抑制剂鸡尾酒片	罗氏公司	4693159001
ChromPure人IgG，Fc片段	杰克逊Immunoresearch	009-000-008
ChromPure人IgG，整个分子	杰克逊Immunoresearch	009-000-003
ChromPure小鼠IgG，整个分子	杰克逊Immunoresearch	015-000-003
ChromPure小鼠IgG，Fc片段	杰克逊Immunoresearch	015-000-008
ChromPure兔IgG，整个分子	杰克逊Immunoresearch	011-000-003
ChromPure驴抗体，整个分子	杰克逊Immunoresearch	017-000-003
微阵列扫描仪	Tecan公司	的LS重装上阵