本文描述了一种通过逆转录病毒介导的OCT4、SOX2、KLF4和MYC异位表达来生成人诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法。同时还讨论了一种基于GFP表达识别人iPSC克隆的实用方法。
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摘要
摘要
人类胚胎干细胞（hESCs）具有多能性，是细胞治疗和再生医学中极为宝贵的细胞来源 体外 疾病建模与再生医学1. 既往研究已表明，通过异位表达四种转录因子，可将人类体细胞重编程为多能性状态（Oct4、Sox2、Klf4 和 Myc）并重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）2-4 与人类胚胎干细胞（hESCs）类似，人类诱导多能干细胞（iPSCs）具有多能性，是自体细胞移植的潜在来源。本文描述了利用包含绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒载体，将四种重编程因子导入人类成纤维细胞以实现重编程的实验方案。4采用以下方案，在人胚胎干细胞培养条件下，可在3-4周内生成人诱导性多能干细胞（iPSCs）。人iPSC克隆在形态上与人胚胎干细胞（hESCs）极为相似，并因逆转录病毒转基因沉默而表现出绿色荧光蛋白（GFP）荧光信号的消失。在荧光显微镜下通过机械法分离的iPSC克隆，其生长特性与hESCs相似。在这些细胞中，我们检测到多种多能性基因及表面标志物的表达。
方案
1. 通过表达重编程因子的逆转录病毒进行重编程
- 在成纤维细胞培养基（含10%胎牛血清及青霉素/链霉素的DMEM）中培养人成纤维细胞。
- 感染前一天，将1×105个人成纤维细胞接种至6孔板的一个孔中。
- 吸除培养基以去除死细胞，加入2 ml新鲜成纤维细胞培养基，并加入硫酸鱼精蛋白至终浓度为5 μg/ml。
- 小心加入适量的表达GFP的病毒，使感染复数（MOI）为55。
- 感染后一天，移除病毒上清液，用2 ml PBS洗涤三次，然后加入2 ml成纤维细胞培养基。
- 感染后三天，观察GFP荧光，并补充2 ml成纤维细胞培养基。
- 感染后四天，将经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层细胞以1×104 /cm2的密度接种于已涂有0.1%明胶的10 cm培养皿中，使用成纤维细胞培养基，37 °C过夜培养。
- 感染后五天，用1 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA在37 °C消化5分钟，使感染的人成纤维细胞脱落，200 g离心5分钟。吸除上清液，用10 ml成纤维细胞培养基重悬细胞，转移至预先包被的10 cm培养皿中。
- 24小时后，更换为hESC培养基（含20% Knock-Out血清替代物、DMEM/F12、0.1 ml非必需氨基酸、4 ng/ml bFGF、青霉素/链霉素/谷氨酰胺、β-巯基乙醇），每日更换培养基。感染后第20至27天开始出现类似胚胎干细胞的克隆。
2. 诱导多能干细胞的分离与扩增
- 在荧光显微镜下检查具有类似人胚胎干细胞形态的克隆是否无GFP荧光。
- 使用10 μl移液器挑取单个诱导多能干细胞克隆，并将其放入经明胶和小鼠胚胎成纤维细胞包被的12孔板中的一个孔内，加入人胚胎干细胞培养基。每日更换培养基。
- 传代时，用1 ml DMEM/F12洗涤孔板，然后加入0.5 ml胶原酶，在37 °C孵育10分钟。
- 用DMEM/F12洗涤细胞两次。
- 加入2 ml新鲜人胚胎干细胞培养基。使用细胞刮将克隆消化成小块，并使残留细胞从孔板上脱落。
- 将重悬的克隆小块转移至经明胶和小鼠胚胎成纤维细胞包被的6孔板中的一个孔内。
3. 多能性标志物的免疫荧光分析
- 用 PBS 洗涤细胞三次，室温下用 4% 多聚甲醛固定 20 分钟。
- 用 PBS 轻柔洗涤细胞三次，加入含 0.2% Triton X-100 的 PBS 室温孵育 30 分钟以进行通透处理。
- 用含 3% BSA 的 PBS 室温孵育细胞 2 小时，以封闭非特异性结合位点。
- 加入一抗，4 °C 条件下孵育过夜。
- 用 PBS 洗涤细胞三次，避光条件下加入特异性二抗，室温孵育 1 小时。
- 用 PBS 洗涤细胞三次，在最后一次洗涤时加入 DAPI，室温孵育 5 分钟。
- 使用荧光显微镜检测染色结果。
4. 多能性标志物的定量实时 PCR 检测
- 使用Qiagen的RNeasy试剂盒从人成纤维细胞来源的人诱导多能干细胞（iPSCs）中提取总RNA。
- 使用SuperScript II逆转录酶合成第一链cDNA。
- 采用先前报道的引物进行qPCR检测多能性基因。6
5. 代表性结果
- 重编程过程中的形态学变化
我们使用携带OCT4、SOX2、KLF4和MYC的逆转录病毒混合物感染人成纤维细胞BJ1和Detroit 551，并能够观察到重编程过程中的形态学变化（图1）。感染后21天，我们可通过类似人胚胎干细胞（hESC）的形态识别出小型iPSC克隆。此外，我们还可通过GFP荧光来识别iPSC。多能干细胞（如ESCs和iPSCs）具有抑制前病毒基因表达的分子机制7-9。我们独特的逆转录病毒载体通过逆转录病毒LTR同时表达GFP和重编程基因。因此，持续表达GFP的细胞被认为存在转基因表达且未发生前病毒基因沉默。成功重编程并获得多能性分子网络的iPSC克隆则表现为无GFP表达（图2）10。 - 人iPSC多能性的表征
我们通过免疫组织化学方法，使用Tra-1-81、Tra-1-60、SSEA-4、SSEA-3、OCT4和NANOG抗体对来自Detroit-551成纤维细胞的克隆进行了分析（表2）。成功重编程的iPSC表达所有这些标志物（图3A）。我们还通过定量RT-PCR分析检测了基因表达。结果显示，与亲代成纤维细胞相比，OCT4、SOX2、KLF4、MYC和NANOG的表达显著升高，并与H9人胚胎干细胞（hESCs）的表达水平相当（图3B）。
图1. 感染逆转录病毒的人成纤维细胞的形态学变化。 （A-D）感染重编程因子的 Detroit-551 成纤维细胞克隆中逐步发生的形态学变化。第5天（A），第10天（B），第14天（C），第21天（D）。21天后，细胞呈现出类似人胚胎干细胞（hESC）的形态。
图 2. 细胞重编程过程中代表性 GFP 荧光表达。 BJ 和 Detroit 551 成纤维细胞被表达四种重编程因子的逆转录病毒感染4，并在 hESC 培养基中培养四周。BJ 成纤维细胞（A, B）和 Detroit 551（C, D）表现出相似的形态学特征。从第 21 天开始，出现 GFP 阴性克隆，代表真正的诱导多能干细胞（iPSCs）10。（E, F）显示未完成正确重编程的转化 Detroit 551 细胞。（A, C, E）为相差显微镜下的克隆图像。（B, D）为正确重编程后显示 GFP 沉默的细胞。（F）为转化克隆中强烈的 GFP 荧光表达。
图 3. 人诱导性多能干细胞的表征。 (A) 人 551-iPS-K1 细胞克隆表达多能细胞常见的标志物。DAPI 染色显示每个视野中的总细胞含量。(B) 对亲代成纤维细胞、551-iPS-K1 诱导性多能干细胞（iPSCs）以及 H9 人胚胎干细胞（hESCs）中 OCT4、SOX2、KLF4 和 MYC 的表达进行定量实时 PCR（RT-qPCR）分析。数据以 β-actin 看家基因为内参进行标准化，并相对于亲代成纤维细胞中的表达水平进行绘图4。
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讨论
表达四种转录因子可将人类成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）。为获得临床应用安全的iPSCs，研究人员已多次尝试采用非整合性或非遗传学方法来生成人类iPSCs。然而迄今为止，这些方法的效率极低，仍需进一步优化以提高可重复性11-14逆转录病毒或慢病毒方法常用于人iPSC的衍生与应用 体外 疾病模型，这类模型对病毒整合所引起的安全问题依赖性较低。本文所述的重编程方法可用于高效获得人诱导多能干细胞（iPSCs）。人iPSCs的筛选主要依据其克隆形态，该形态类似于人胚胎干细胞（ESCs）。更重要的是，本方法利用了逆转录病毒长末端重复序列（LTR）在多能干细胞中发生沉默的特性7,15本方案中使用的逆转录病毒载体包含通过内部核糖体进入位点（IRES）与重编程因子相连的GFP基因，以及5GFP 表达由前病毒 LTR 驱动。被这些病毒转导的成纤维细胞最初会表现出强烈的 GFP 表达。一旦重编程完成，诱导性多能干细胞（iPSCs）将失去 GFP 表达，这一变化可在荧光显微镜下清晰观察到。在本方案中，我们描述了从胎儿和新生儿成纤维细胞（Detroit 551 和...
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披露
我们无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由耶鲁医学院和查尔斯·胡德基金会的儿童健康研究奖资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330057 | 80% |
| 无血清替代物 | Invitrogen | 10828-028 | 20% |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Invitrogen | 25030081 | 2 mM |
| 非必需氨基酸（10 mM） | Invitrogen | 11140050 | 0.1 mM |
| β巯基–乙醇（14.3 M）或 MTG | Invitrogen | M-6250 | 0.1 mM |
| bFGF-2 10 μg/ml | GIBCO，隶属于 Life Technologies | GF003AF | 4 ng/ml |
| 青霉素/链霉素 | EMD Millipore | 15140-122 | 1% |
| DMEM | Invitrogen | 11965118 | 90% |
| FBS | Invitrogen | 10407028 | 10% |
| 青霉素/链霉素 | EMD Millipore | 15140-122 | 1% |
| <强>表1. 培养基 | |||
| OCT4 | Abcam | Ab19857 | 1:500 |
| SSEA3 | EMD Millipore | MAB4303 | 1:100 |
| SSEA4 | BD 生物科学 | BD560218 | 1:100 |
| Tra-1-81 | BD 生物科学 | BD560173 | 1:100 |
| Tra-1-60 | BD 生物科学 | BD560174 | 1:100 |
| NANOG | Abcam | Ab21624 | 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | 1:1000 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:5000 |
| pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
| pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
| pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
| pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
| IV型胶原酶 | Invitrogen | 17104019 | 1 mg/ml |
| 明胶，猪源 | Sigma-Aldrich | G 1890 | 0.1% |
| Triton | Sigma-Aldrich | X100-500ML | 0.2% |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 47608 | 4% |
| BSA | American Bioanalytical | AB01800 | 3% |
| MEF 饲养层细胞 | EMD Millipore | PMEF-N | |
| 细胞刮刀 | 康宁 | 3008 | |
| 荧光显微镜：配备GFP滤光片的倒置显微镜 | |||
| <强>表2. 试剂与仪器 |
参考文献
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