利用携带GFP的逆转录病毒载体将人类体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）

摘要

本文描述了一种通过逆转录病毒介导的OCT4、SOX2、KLF4和MYC异位表达来生成人诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法。同时还讨论了一种基于GFP表达识别人iPSC克隆的实用方法。

摘要

人类胚胎干细胞（hESCs）具有多能性，是细胞治疗和再生医学中极为宝贵的细胞来源 体外 疾病建模与再生医学¹. 既往研究已表明，通过异位表达四种转录因子，可将人类体细胞重编程为多能性状态（Oct4、Sox2、Klf4 和 Myc）并重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）^2-4 与人类胚胎干细胞（hESCs）类似，人类诱导多能干细胞（iPSCs）具有多能性，是自体细胞移植的潜在来源。本文描述了利用包含绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒载体，将四种重编程因子导入人类成纤维细胞以实现重编程的实验方案。⁴采用以下方案，在人胚胎干细胞培养条件下，可在3-4周内生成人诱导性多能干细胞（iPSCs）。人iPSC克隆在形态上与人胚胎干细胞（hESCs）极为相似，并因逆转录病毒转基因沉默而表现出绿色荧光蛋白（GFP）荧光信号的消失。在荧光显微镜下通过机械法分离的iPSC克隆，其生长特性与hESCs相似。在这些细胞中，我们检测到多种多能性基因及表面标志物的表达。

方案

1. 通过表达重编程因子的逆转录病毒进行重编程

1. 在成纤维细胞培养基（含10%胎牛血清及青霉素/链霉素的DMEM）中培养人成纤维细胞。
2. 感染前一天，将1×10⁵个人成纤维细胞接种至6孔板的一个孔中。
3. 吸除培养基以去除死细胞，加入2 ml新鲜成纤维细胞培养基，并加入硫酸鱼精蛋白至终浓度为5 μg/ml。
4. 小心加入适量的表达GFP的病毒，使感染复数（MOI）为5⁵。
5. 感染后一天，移除病毒上清液，用2 ml PBS洗涤三次，然后加入2 ml成纤维细胞培养基。
6. 感染后三天，观察GFP荧光，并补充2 ml成纤维细胞培养基。
7. 感染后四天，将经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层细胞以1×10⁴ /cm²的密度接种于已涂有0.1%明胶的10 cm培养皿中，使用成纤维细胞培养基，37 °C过夜培养。
8. 感染后五天，用1 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA在37 °C消化5分钟，使感染的人成纤维细胞脱落，200 g离心5分钟。吸除上清液，用10 ml成纤维细胞培养基重悬细胞，转移至预先包被的10 cm培养皿中。
9. 24小时后，更换为hESC培养基（含20% Knock-Out血清替代物、DMEM/F12、0.1 ml非必需氨基酸、4 ng/ml bFGF、青霉素/链霉素/谷氨酰胺、....

讨论

表达四种转录因子可将人类成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）。为获得临床应用安全的iPSCs，研究人员已多次尝试采用非整合性或非遗传学方法来生成人类iPSCs。然而迄今为止，这些方法的效率极低，仍需进一步优化以提高可重复性^11-14逆转录病毒或慢病毒方法常用于人iPSC的衍生与应用 体外 疾病模型，这类模型对病毒整合所引起的安全问题依赖性较低。本文所述的重编程方法可用于高效获得人诱导多能干细胞（iPSCs）。人iPSCs的筛选主要依据其克隆形态，该形态类似于人胚胎干细胞（ESCs）。更重要的是，本方法利用了逆转录病毒长末端重复序列（LTR）在多能干细胞中发生沉默的特性^7,15本方案中使用的逆转录病毒载体包含通过内部核糖体进入位点（IRES）与重编程因子相连的GFP基因，以及⁵GFP 表达由前病毒 LTR 驱动。被这些病毒转导的成纤维细胞最初会表现出强烈的 GFP 表达。一旦重编程完成，诱导性多能干细胞（iPSCs）将失去 GFP 表达，这一变化可在荧光显微镜下清晰观察到。在本方案中，我们描述了从胎儿和新生儿成纤维细胞（Detroit 551 和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
无血清替代物	Invitrogen	10828-028	20%
L-谷氨酰胺（200 mM）	Invitrogen	25030081	2 mM
非必需氨基酸（10 mM）	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β巯基–乙醇（14.3 M）或 MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO，隶属于 Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
青霉素/链霉素	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
青霉素/链霉素	EMD Millipore	15140-122	1%
<强>表1. 培养基
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD 生物科学	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD 生物科学	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD 生物科学	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
IV型胶原酶	Invitrogen	17104019	1 mg/ml
明胶，猪源	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF 饲养层细胞	EMD Millipore	PMEF-N
细胞刮刀	康宁	3008
荧光显微镜：配备GFP滤光片的倒置显微镜
<强>表2. 试剂与仪器