分离Toxoplasma gondii宿主细胞逸出突变体的遗传筛选方法

摘要

正向遗传学是一种强大的方法，可用于揭示Toxoplasma从宿主细胞中逸出的分子机制。本文提供了化学诱变寄生虫、富集诱导逸出缺陷突变体以及验证克隆突变体表型的实验方案。

摘要

广泛存在的专性胞内原虫寄生虫Toxoplasma gondii可导致免疫功能低下患者发生机会性感染，并在先天性感染时引发出生缺陷。其裂殖复制周期包括三个阶段：1. 主动侵入有核宿主细胞；2. 在宿主细胞内进行复制；3. 主动从宿主细胞逸出。目前，逸出机制正逐渐被认识到是一种独特且高度调控的过程，但其在分子水平上的机制仍知之甚少。通过使用作用于不同信号通路环节的药理学试剂，研究人员已对介导逸出的信号通路进行了表征^1-5。由此，已鉴定出多个独立的逸出触发因素，它们均汇聚于细胞内Ca²⁺的释放，而该信号也对宿主细胞的侵入至关重要^6-8。这一认识推动了候选基因策略的应用，从而鉴定出一种类植物钙依赖性蛋白激酶（CDPK），其参与了逸出过程⁹。此外，近年来通过（化学）遗传学方法在理解逸出机制方面取得了一系列重要突破^10-12。为了将丰富的药理学信息与Toxoplasma日益增强的遗传可操作性相结合，我们近期建立了一种筛选方法，可用于富集具有宿主细胞逸出缺陷的寄生虫突变体¹³。尽管长期以来化学诱变剂如N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）或甲基磺酸乙酯（EMS）已被用于Toxoplasma生物学研究^11,14,15，但直到最近，对表型背后突变位点的遗传定位才成为常规手段^16-18。此外，通过构建温度敏感型突变体，可对必需生命过程进行解析，并直接鉴定出相关基因。这类突变体在允许温度（35 °C）下表现正常，与野生型相似，但在限制温度（40 °C）下由于特定突变的存在而无法增殖。本文介绍了一种新的表型筛选方法，用于分离具有温度敏感型逸出表型的突变体¹³。逸出筛选面临的主要挑战在于区分已逸出与未逸出的寄生虫，而这因寄生虫快速再侵入以及其普遍粘附于宿主细胞的特性而变得复杂。此前建立的一种逸出筛选方法依赖一系列繁琐的生物素标记步骤，以分离胞内与胞外寄生虫¹¹，但该方法也无法获得导致弱表型的条件性突变体。本文所述方法通过添加糖类竞争性抑制剂右旋糖酐硫酸钠（DS），克服了逸出寄生虫强烈粘附宿主细胞的问题，从而阻止寄生虫与宿主细胞结合¹⁹。此外，胞外寄生虫可被吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）特异性杀灭，而胞内寄生虫则不受影响²⁰。因此，借助这一新型表型筛选方法，可特异性分离出诱导逸出功能缺陷的寄生虫突变体，从而充分发挥遗传学手段的优势，深入揭示宿主细胞逸出背后的分子机制。

方案

概述

首先提供实验方案以确定诱变剂的剂量，使其导致70%的寄生虫死亡（方案1）。接下来的步骤用于从经诱变处理的寄生虫群体中富集诱导性逸出突变体（方案2，图2）。随后提供一个方案，用于检测富集群体中逸出突变体的发生率，或验证单个突变体的逸出表型（方案3）。最后，提供一个通过有限稀释法从富集群体中获得单个寄生虫克隆的方案（方案4）。

1. 诱变剂的滴定

处理高诱变性化合物和液体时，应格外小心，例如佩戴双层手套。液体废物应单独收集，以便妥善处理。

1. 在含有汇合人包皮成纤维细胞（HFF）的T25细胞培养瓶中加入1 ml新鲜裂解的速殖子，于37 °C、5% CO₂条件下，在Ed1培养基（DMEM补充1%热灭活胎牛血清、0.2 mM L-谷氨酰胺、50 U/ml青霉素、50 μg/ml链霉素和0.25 μg/ml两性霉素B）中培养18–25小时。HFF细胞及寄生虫的一般培养与培养基信息参见Roos et al.²¹。
2. 更换为10 ml含0.1%胎牛血清的培养基（将Ed1用DMEM稀释10倍），置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中（下文简称“37 °C培养箱”）孵育10分钟。
3. 每瓶分别加入0、12.5、25、50或100 μl ENU（....

讨论

本方案提供了一种高效分离具有逸出缺陷的Toxoplasma突变株的方法。我们已成功分离出在逸出通路不同阶段存在缺陷的突变株，其中部分突变株同时表现出双重侵袭表型¹³。可通过所谓的红绿染色实验（red-green assay）检测对侵袭能力的潜在影响，该实验通过差异性抗体染色区分已侵入与未侵入的寄生虫^23,24。在侵袭和逸出实验中，可在寄生虫胞质中表达一种自荧光蛋白标记以方便检测^13,22。然而，若正在进行诱变的寄生虫已表达荧光蛋白，则可能干扰后续通过免疫荧光进行的其他表型鉴定。在突变株分离后，始终可以选择添加荧光标记。如文中所述，一种简单且非荧光的逸出实验替代方法是采用Diff-Quick染色。

历史上，诱变剂 ENU 已被应用于Toxoplasma的遗传学研究¹⁴。然而，ENU 优先靶向 AT 碱基对²⁵，我们在Toxoplasma中也验证了这一点（Farrell, Marth, Gubbels et al

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M 储存液（DMSO 配制），-20 °C 保存
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M 储存液（DMSO 配制），-20 °C 保存
硫酸葡聚糖	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM 储存液（PBS 配制）
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
滤器支架	Cole-Parmer	540100
3 μm 聚碳酸酯滤膜	Whatman Schleicher Schuell	110612
血细胞计数板	Hausser Scientific	1475
CO2 培养箱	多个厂家		加湿环境，5% CO2，温度分别为 35、37 和 40 °C
荧光显微镜	多个厂家		建议使用倒置宽场显微镜，配备 63x 或 100x 油镜
HBSSc（根据 Black et al.11）：
98.0 ml Hanks 平衡盐溶液（Hyclone 货号 SH30588） 100 μl 1M MgCl2（终浓度 100 mM） 100 μl 1M CaCl2（终浓度 100 mM） 2.0 ml 1M Hepes（pH 7.3，终浓度 20 mM） 84 mg NaHCO3（终浓度 10 mM）