分离Toxoplasma gondii宿主细胞逸出突变体的遗传筛选方法

摘要

正向遗传学是一种强大的方法，可用于揭示Toxoplasma从宿主细胞中逸出的分子机制。本文提供了化学诱变寄生虫、富集诱导逸出缺陷突变体以及验证克隆突变体表型的实验方案。

摘要

广泛存在的专性胞内原虫寄生虫Toxoplasma gondii可导致免疫功能低下患者发生机会性感染，并在先天性感染时引发出生缺陷。其裂殖复制周期包括三个阶段：1. 主动侵入有核宿主细胞；2. 在宿主细胞内进行复制；3. 主动从宿主细胞逸出。目前，逸出机制正逐渐被认识到是一种独特且高度调控的过程，但其在分子水平上的机制仍知之甚少。通过使用作用于不同信号通路环节的药理学试剂，研究人员已对介导逸出的信号通路进行了表征^1-5。由此，已鉴定出多个独立的逸出触发因素，它们均汇聚于细胞内Ca²⁺的释放，而该信号也对宿主细胞的侵入至关重要^6-8。这一认识推动了候选基因策略的应用，从而鉴定出一种类植物钙依赖性蛋白激酶（CDPK），其参与了逸出过程⁹。此外，近年来通过（化学）遗传学方法在理解逸出机制方面取得了一系列重要突破^10-12。为了将丰富的药理学信息与Toxoplasma日益增强的遗传可操作性相结合，我们近期建立了一种筛选方法，可用于富集具有宿主细胞逸出缺陷的寄生虫突变体¹³。尽管长期以来化学诱变剂如N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）或甲基磺酸乙酯（EMS）已被用于Toxoplasma生物学研究^11,14,15，但直到最近，对表型背后突变位点的遗传定位才成为常规手段^16-18。此外，通过构建温度敏感型突变体，可对必需生命过程进行解析，并直接鉴定出相关基因。这类突变体在允许温度（35 °C）下表现正常，与野生型相似，但在限制温度（40 °C）下由于特定突变的存在而无法增殖。本文介绍了一种新的表型筛选方法，用于分离具有温度敏感型逸出表型的突变体¹³。逸出筛选面临的主要挑战在于区分已逸出与未逸出的寄生虫，而这因寄生虫快速再侵入以及其普遍粘附于宿主细胞的特性而变得复杂。此前建立的一种逸出筛选方法依赖一系列繁琐的生物素标记步骤，以分离胞内与胞外寄生虫¹¹，但该方法也无法获得导致弱表型的条件性突变体。本文所述方法通过添加糖类竞争性抑制剂右旋糖酐硫酸钠（DS），克服了逸出寄生虫强烈粘附宿主细胞的问题，从而阻止寄生虫与宿主细胞结合¹⁹。此外，胞外寄生虫可被吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）特异性杀灭，而胞内寄生虫则不受影响²⁰。因此，借助这一新型表型筛选方法，可特异性分离出诱导逸出功能缺陷的寄生虫突变体，从而充分发挥遗传学手段的优势，深入揭示宿主细胞逸出背后的分子机制。

方案

概述

首先提供实验方案以确定诱变剂的剂量，使其导致70%的寄生虫死亡（方案1）。接下来的步骤用于从经诱变处理的寄生虫群体中富集诱导性逸出突变体（方案2，图2）。随后提供一个方案，用于检测富集群体中逸出突变体的发生率，或验证单个突变体的逸出表型（方案3）。最后，提供一个通过有限稀释法从富集群体中获得单个寄生虫克隆的方案（方案4）。

1. 诱变剂的滴定

处理高诱变性化合物和液体时，应格外小心，例如佩戴双层手套。液体废物应单独收集，以便妥善处理。

1. 在含有汇合人包皮成纤维细胞（HFF）的T25细胞培养瓶中加入1 ml新鲜裂解的速殖子，于37 °C、5% CO₂条件下，在Ed1培养基（DMEM补充1%热灭活胎牛血清、0.2 mM L-谷氨酰胺、50 U/ml青霉素、50 μg/ml链霉素和0.25 μg/ml两性霉素B）中培养18–25小时。HFF细胞及寄生虫的一般培养与培养基信息参见Roos et al.²¹。
2. 更换为10 ml含0.1%胎牛血清的培养基（将Ed1用DMEM稀释10倍），置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中（下文简称“37 °C培养箱”）孵育10分钟。
3. 每瓶分别加入0、12.5、25、50或100 μl ENU（1 M 储存液，溶于DMSO）或EMS（1 M 储存液，溶于DMSO）（终浓度分别为1.25、2.5、5和10 mM）。每瓶补加DMSO至总体积100 μl。在37 °C培养箱中孵育4小时。
4. 室温下用10 ml冷PBS（预冷至4 °C）冲洗单层细胞，每次10秒，共洗涤三次。
5. 加入5 ml PBS，用橡胶刮刀（细胞刮）轻轻刮下细胞层，将刮下的细胞通过26.5 G针头反复吹打，以物理方式使寄生虫从成纤维细胞中释放（使用厚刃剪刀剪去针头外部的针管部分，避免针头暴露）；随后用3.0 μm聚碳酸酯滤膜过滤。多次通过针头可提高寄生虫从宿主细胞中释放的效率。
6. 使用血细胞计数板测定寄生虫浓度。计数前让寄生虫在血细胞计数板中静置5分钟，使其沉降。
7. 将寄生虫用Ed1培养基稀释至每3 ml含10,000个寄生虫（配制10 ml需33,333个寄生虫）。
8. 取3 ml稀释后的寄生虫接种至6孔板中的一个孔（含10,000个寄生虫）。将该孔中的寄生虫悬液转移300 μl至下一个含2.7 ml Ed1且已长满HFF细胞的孔中，进行10倍系列稀释，共稀释3个孔。将6孔板置于37 °C培养箱中静置培养7天。
9. 吸除培养基，每孔加入3 ml 100%乙醇固定15分钟；每孔加入3 ml结晶紫染液（将12.5 g结晶紫溶于125 ml乙醇，再与500 ml 1%草酸铵混合）染色15分钟；每孔用3 ml PBS冲洗1分钟，然后自然晾干。所有步骤均在室温下进行。
10. 计数空斑数量，并确定使30%暴露寄生虫存活（即70%杀灭剂量）所需的诱变剂浓度（见图1）。历史上通常采用70%杀灭剂量¹⁴，该剂量可在全基因组中诱导少于100个点突变（Farrell, Marth, Gubbels et al.，稿件已提交）。

2. 逸出突变体的富集（图 2）

1. 按照上述方法进行诱变，使用可诱导70%杀灭率的诱变剂剂量。将诱变后的虫体群体在新的宿主细胞培养瓶中传代培养一次。
2. 用10 ml Ed1培养基中含有120,000个新裂解释放的虫体（来自诱变后的群体）感染一个T25规格、成纤维细胞（HFF）已达到汇合状态的组织培养瓶。在35 °C、5% CO₂及湿润环境中孵育2小时（此后简称“35 °C培养箱”）。
3. 吸除培养基，用10 ml冷PBS冲洗10秒，然后加入10 ml Ed1培养基，其中添加25 mg/ml硫酸葡聚糖（DS）¹³。在40 °C、5% CO₂及湿润环境中孵育26小时（此后简称“40 °C培养箱”）。
4. 配制裂解增强剂的工作液。在含有10 ml HBSSc并补充25 mg/ml DS的15 ml Falcon管中，将所选的裂解诱导剂稀释至工作浓度。将稀释液在37 °C水浴中预热30分钟。工作浓度详见表1。
5. 吸除感染虫体的培养瓶中的培养基，加入预热的裂解诱导剂溶液。根据表1所示时间，在37 °C培养箱中继续孵育。
6. 吸除培养基，用10 ml冷PBS冲洗10秒，然后加入10 ml Ed1培养基，其中补充25 mg/ml DS和50 μM吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC：在PBS中加入5 μl 100 mM PDTC储备液）¹³。在35 °C培养箱中孵育5小时。
7. 吸除培养基，用10 ml室温PBS冲洗一次，持续10秒，然后加入10 ml Ed1培养基。将培养瓶放回35 °C培养箱中，直至虫体破坏单层细胞：每天轻轻摇动培养瓶。此恢复过程约需7天。

3. 通过逸出实验验证突变表型

在完成富集筛选并在HFF细胞中将富集后的群体传代培养一次后，需要通过出胞实验^11,13来确认表型。该实验也应用于第4步方案后对单克隆进行验证。

1. 将20,000个寄生虫接种到含有在盖玻片上生长的融合人胎儿成纤维细胞（HFF）的24孔板中（每孔1 ml Ed1培养基）。在35 °C培养箱中孵育8小时，然后转移至40 °C培养箱中继续孵育24小时。
2. 用1 ml/孔PBS洗涤（室温下10秒）。加入1 ml裂胞诱导剂（包括仅含DMSO的阴性对照），用HBSSc预热并稀释后，按照表1所述时间孵育。
3. 吸去培养基，并用1 ml/孔100%甲醇在室温下固定15分钟。
4. 若用于诱变的亲本寄生虫表达自荧光蛋白，则进行步骤#3.5¹³；若使用的亲本株为非荧光蛋白表达寄生虫，则用Diff-Quick染色剂在室温下对固定的盖玻片染色1分钟¹¹。
5. 在24孔板中用1 ml/孔PBS于室温下洗涤5分钟。
6. 对于表达荧光蛋白的寄生虫：将盖玻片在ddH₂O中快速漂洗（浸入式），然后置于载玻片上，使用凝胶封片剂封片以保护荧光信号。对于经Diff-Quick染色的寄生虫，先用100%乙醇洗涤10秒，晾干后再封片。
7. 使用配备40–60倍物镜的（荧光）显微镜，统计裂胞的空泡百分比与仍保留在细胞内的空泡百分比（见图4）。

4. 通过有限稀释法克隆逸出突变体

在使用方案3验证富集的逸出突变体群体的表型后，需要对多克隆群体进行克隆，以获得单个寄生虫克隆。

1. 使用血细胞计数板计数寄生虫数量，并用Ed1培养基将浓度稀释至每毫升500个寄生虫。
2. 在含有HFF细胞完全单层的384孔板中，使用多通道移液器将每孔培养基更换为40 μl的Ed1培养基。如图5所示，每块板可同时克隆四个多克隆群体，具体操作如下：将稀释后的突变株1以每孔40 μl加入C3-C12孔，突变株2加入C13-C22孔，突变株3加入H3-H12孔，突变株4加入H13-H22孔（此时各孔终体积为80 μl）。使用多通道移液器将溶液上下吹打5次，然后将40 μl转移至起始行的下一行（从C行转移至D行，或从H行转移至I行）。继续进行2倍系列稀释，直至G行（突变株1和2）或N行（突变株3和4）。将最后一行多余的40 μl弃去。将板置于35 °C培养箱中培养7-10天，期间避免扰动。
3. 使用倒置显微镜配合10-20倍物镜检查各孔，观察单个空斑（表现为单层细胞中的“孔洞”）的存在情况。
4. 每种突变株挑选4个含有单个空斑的孔，将寄生虫转移至已长满HFF细胞并加满Ed1培养基的组织培养瓶中。在35 °C培养箱中培养寄生虫，每天轻轻摇动培养瓶以分散细胞外寄生虫。此过程通常需要7天。

5. 典型结果

诱变剂 ENU 和 EMS 在长期储存时不稳定，因此测试其储存液的诱变活性对于获得可重复的结果至关重要。图1展示了 ENU 和 EMS 的典型滴定结果及杀伤曲线。然而，建议在每次诱变实验中均进行噬斑测定，以确认使用了适当的剂量。为了保持诱变后寄生虫群体的多样性，应尽快开展逸出突变体筛选。通常，在进行筛选前会将寄生虫传代至新的培养瓶中一次，以使存活的寄生虫恢复生长。需要注意的是，这一操作将导致突变体发生分裂，因此不能排除在完成整个流程后分离到的多个克隆突变体可能具有完全相同的基因型。为避免多次分离到同一突变体，建议每次诱变仅分离一个逸出突变体，除非它们的表型（例如对不同逸出诱导剂的敏感性差异）明显不同。另一方面，并非每一次筛选都能获得具有目标表型的突变体。特别是对 Ca²⁺-离子载体 A23187 抗性表型较为罕见，需要进行多次诱变实验和筛选才能分离到一个逸出突变体。因此，建议并行开展 5–10 次诱变及筛选实验。

通过将已知的逸出突变体与野生型寄生虫以不同比例混合，检测了筛选方法的富集能力。将这些混合物进行筛选，并评估富集后群体中突变表型的出现频率。利用表达胞质RFP的野生型寄生虫和表达胞质YFP的突变株，可通过流式细胞术快速确定各表型的比例（图3）¹³。结果表明，当起始比例为每10,000个野生型寄生虫中含有1个逸出突变体时，突变表型通常可被富集至80%的纯度¹³。然而，当逸出突变体与野生型寄生虫的起始比例为1:100,000时，所获得的群体中仅含有1–2%（即1:100）的逸出突变体。因此，该筛选方法的富集能力为1,000倍。由于筛选起始接种量为120,000个寄生虫，其中通常约70%具有活力，因此我们通常进行两轮富集。在两轮富集之间，将分离得到的寄生虫进行扩增培养。该流程可实现100%的突变体群体，即使起始比例低至1:1,000,000（逸出突变体:野生型寄生虫）。

为了验证和表征表型，出胞实验需要采用多重感染复数感染宿主细胞，以便区分单个空泡。当分析出胞比例较高的条件时，这一点尤为关键，因为单个寄生虫会分散分布。如图4所示，如果出胞的群体未充分分离，则容易将两个出胞的空泡误计为一个空泡，从而低估出胞百分比。由于出胞和入侵是相关联的过程，且某些温度敏感型表型在较低温度下仅表现出轻微表型，因此并非所有突变体都具有相似的入侵效率。因此，必须以数倍更高的接种剂量感染这类突变体，以获得足够高的空泡密度，从而准确评估其出胞表型。此外，某些出胞诱导剂不能有效刺激含有四个或更少寄生虫的空泡发生出胞。因此，在开始出胞实验时，空泡中应至少含有八个或更多的寄生虫。在本实验室中，我们将通过特定出胞增强剂筛选获得的突变体与其他出胞增强剂进行交叉测试。通过分析其交叉反应性，可将这些突变体归类为不同的类别。最后，并非所有出胞突变体都表现为温度敏感型。特别是那些通过在细胞内Ca²⁺释放之前触发步骤的出胞诱导剂筛选获得的突变体，更倾向于呈现非温度敏感型表型。这是因为在信号汇聚于细胞内Ca²⁺释放之前，存在可导致出胞的平行通路。

图1. 化学诱变剂剂量滴定。A. 在6孔板中使用不同浓度的EMS以及每孔不同数量的寄生虫进行蚀斑实验，如图所示。白色斑点为寄生虫在HFF单层细胞上形成的蚀斑。B, C. 寄生虫在不同剂量EMS（B）和ENU（C）处理下的存活曲线。通过蚀斑实验评估存活率。选择可诱导70%杀伤率的剂量用于诱变实验。数据表示三次独立实验的平均值±标准差。

图2. 逸出突变体富集筛选的示意图。 纵轴表示温度，横轴表示时间进程。绿色寄生虫代表逸出突变体寄生虫，红色寄生虫代表野生型寄生虫。条件变化及逸出诱导剂刺激的时间点在图顶部标出，并由反映温度变化曲线的蓝线上的箭头标记。改编自 Eidell et al.¹³。

图3. 出胞突变表型的典型富集结果。 将出胞突变体以不同比例（x轴）混入野生型寄生虫后的富集结果，通过流式细胞术检测筛选后群体中出胞突变表型所占百分比（y轴）（出胞突变寄生虫表达细胞质YFP，野生型寄生虫表达细胞质RFP）。三个独立实验的结果分别以红色、蓝色和绿色数据点表示。改编自Eidell et al.¹³。

图4. 逸出实验的典型结果。A. 箭头标记了四个含有4-8个寄生虫的完整空泡。 B. 箭头标记了四组分散的寄生虫，代表四个独立逸出的空泡。逸出由A23187诱导（B），或以DMSO作为阴性对照（A）。寄生虫表达细胞质YFP²²。

图 5. 克隆寄生虫株的连续稀释。 四个多克隆种群（红色、蓝色、黄色、绿色）在单个384孔板中进行连续稀释，该孔板已长满HFF细胞。C行和I行每孔加入10个寄生虫，并分别进行2倍稀释（40 μl + 40 μl），直至H行和N行。灰色的深浅表示每孔中寄生虫数量的递减。通常，单克隆可在D-F行和J-L行中获得。

化合物	储存液浓度	工作浓度	配制T25培养瓶（10 ml）所需体积（μl）	孵育时间（分钟）
DTT	1 M in DMSO	5 mM	50	15
乙醇	190 Proof	5%	500	30
A23187	2 mM in DMSO	1 μM	5	5
nigericin*	2 mM in DMSO	10 μM	50	30

*不能在富集筛选中使用nigericin，因为寄生虫无法在nigericin刺激下存活；仅在裂解突变体的验证实验中使用nigericin。

表1. 实验中使用的逸出诱导剂。在筛选实验中，用含25 mg/ml DS的10 ml HBBSc稀释；在突变体验证（逸出实验）中，则使用不含DS的10 ml HBBSc稀释。所有化合物均来自Sigma-Aldrich。

讨论

本方案提供了一种高效分离具有逸出缺陷的Toxoplasma突变株的方法。我们已成功分离出在逸出通路不同阶段存在缺陷的突变株，其中部分突变株同时表现出双重侵袭表型¹³。可通过所谓的红绿染色实验（red-green assay）检测对侵袭能力的潜在影响，该实验通过差异性抗体染色区分已侵入与未侵入的寄生虫^23,24。在侵袭和逸出实验中，可在寄生虫胞质中表达一种自荧光蛋白标记以方便检测^13,22。然而，若正在进行诱变的寄生虫已表达荧光蛋白，则可能干扰后续通过免疫荧光进行的其他表型鉴定。在突变株分离后，始终可以选择添加荧光标记。如文中所述，一种简单且非荧光的逸出实验替代方法是采用Diff-Quick染色。

历史上，诱变剂 ENU 已被应用于Toxoplasma的遗传学研究¹⁴。然而，ENU 优先靶向 AT 碱基对²⁵，我们在Toxoplasma中也验证了这一点（Farrell, Marth, Gubbels et al

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M 储存液（DMSO 配制），-20 °C 保存
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M 储存液（DMSO 配制），-20 °C 保存
硫酸葡聚糖	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM 储存液（PBS 配制）
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
滤器支架	Cole-Parmer	540100
3 μm 聚碳酸酯滤膜	Whatman Schleicher Schuell	110612
血细胞计数板	Hausser Scientific	1475
CO2 培养箱	多个厂家		加湿环境，5% CO2，温度分别为 35、37 和 40 °C
荧光显微镜	多个厂家		建议使用倒置宽场显微镜，配备 63x 或 100x 油镜
HBSSc（根据 Black et al.11）：
98.0 ml Hanks 平衡盐溶液（Hyclone 货号 SH30588） 100 μl 1M MgCl2（终浓度 100 mM） 100 μl 1M CaCl2（终浓度 100 mM） 2.0 ml 1M Hepes（pH 7.3，终浓度 20 mM） 84 mg NaHCO3（终浓度 10 mM）