胆固醇检测到定量,从培养细胞的胆固醇流出率和血浆受体的能力,接受从细胞释放的胆固醇。该法由标记细胞内池和胆固醇释放到细胞外受体之间的胆固醇,胆固醇平衡。
方法文章
胆固醇检测到定量,从培养细胞的胆固醇流出率和血浆受体的能力,接受从细胞释放的胆固醇。该法由标记细胞内池和胆固醇释放到细胞外受体之间的胆固醇,胆固醇平衡。
细胞中胆固醇的含量必须保持在非常紧张的限制,过多或过少的胆固醇在一个细胞在细胞膜破坏,细胞凋亡和坏死1。细胞可以从细胞内合成和血浆脂蛋白胆固醇,这两个来源是足够充分满足细胞胆固醇的要求。胆固醇的合成和吸收的过程中,严格监管和胆固醇的不足之处是罕见的2。过多的胆固醇是比较常见的问题3。细胞与肝细胞的异常和肾上腺皮质细胞在一定程度上,都无法降低胆固醇。细胞有两种选择,以降低他们的胆固醇含量:转换成胆固醇酯,能力有限的选项中的胆固醇,胆固醇酯细胞超载也是有毒,和胆固醇流出,潜在的无限容量的选择。胆固醇外流是一个规范的IFIC过程中,细胞内的转运,如三磷酸腺苷结合盒转运蛋白体A1(ABCA1)和G1(ABCG1的)和清道夫受体B1型监管。血浆中的胆固醇的天然受体是高密度脂蛋白(HDL)和载脂蛋白AI。
胆固醇外流试验设计定量从培养细胞的胆固醇流出率。它测量的能力,以维持细胞胆固醇流出和/或血浆受体的能力,接受从细胞释放的胆固醇。该法包括以下步骤。步骤1:标记细胞内胆固醇含血清培养基中加入标记的胆固醇,并与细胞孵育24-48小时。这一步,可装载细胞与胆固醇结合。第2步:在无血清培养基培养细胞之间的所有细胞内胆固醇池标记的胆固醇平衡。此阶段可结合激活细胞CHolesterol转运。第三步:培养细胞与胞外受体和定量标记的胆固醇从细胞受体的运动。如果胆固醇的前体被用来标记新合成的胆固醇,第四步,胆固醇的净化,可能需要。
该法提供了以下信息:(i)一个特定的治疗(一个突变,敲下来,过度或治疗)如何影响细胞的能力流出胆固醇和(ii)如何接受胆固醇血浆受体的能力受疾病或治疗。这种方法通常用于研究心血管,代谢和神经退行性疾病,传染病和生殖系统疾病方面。
1。 [3H]胆固醇的制备
2。的电镀细胞和标签细胞内胆固醇
该协议已通过测试,使用以下类型的细胞:人单核细胞4,5,THP-1人单核细胞-巨噬细胞6,7,8的RAW 264.7巨噬细胞5,9,10,11,12 HeLa细胞,人脐静脉内皮细胞(HUVEC),BHK-21细胞9,人类和小鼠成纤维细胞13,14,肝癌人肝癌细胞15,在修改后的形式,从血小板 16。
3。平衡育成
5。加工萨mples
6。分析结果


7。时间轴

8。代表结果
如图胆固醇流出实验结果的一个例子。 1。在这个实验中THP-1人单核细胞分化成巨噬细胞和胆固醇流出到不同的受体测试。没有受体(“空白”)介质的胆固醇流出为0.79%,此值被视为一个非特定的外流,并从其他值中减去。胆固醇外流的人载脂蛋白A-Ⅰ(终浓度为30微克/毫升)为4.75%。本实验参考的血浆样品被纳入监测实验间变异。参考样本,可用于跨越大量的实验数据正常化,但我们发现它审慎的重复检测,如果是高变异。测试之前和之后的病人药物治疗的病人的血浆(终浓度为2%)。得出的结论是,在这个病人服药有一个对血浆容量支持胆固醇外流的负面影响。
外排实验结果的另一个例子是在图所示。 2。在这个实验中,RAW 264.7巨噬细胞被激活或不激活LXR激动剂TO-901317过夜培养(终浓度加入1μmol/ L)和胆固醇流出的人类血浆相同的样本(2%)进行了测试。得出的结论是LXR激动剂激活细胞表达ABC转运增加胆固醇释放到细胞外受体细胞的能力。

图1。从THP-1细胞的各种受体的胆固醇流出胆固醇流出的百分比(即标记胆固醇的比例从指定的受体细胞)。后显示空白值的加减。平均值±SD一式四份决定,* P <0.05。

图2。从细胞胆固醇流出的RAW 264.7激活或不激活LXR激动剂对人体血浆胆固醇流出的百分比(即标记胆固醇的比例。指定受体)后显示空白值的加减。平均值±SD一式四份决定,* P <0.001。
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所描述的方法,测量胆固醇流出是用来衡量运动的胆固醇从细胞到细胞外的胆固醇受体。了解这种方法有几个关键因素。
标签和平衡
中所述的方法被添加到标记的胆固醇血清含药血清。虽然从来没有详细调查,这是假设纳入血清脂蛋白胆固醇和他们采取由细胞组成。重要的是让脂蛋白足够的时间采取了从脂蛋白胆固醇移动到细胞膜。一般24小时的标签是足够的,但48小时的标签达到较高的细胞内胆固醇的具体活动。它需要考虑到,如果[14]胆固醇用来代替[3H]胆固醇(如双标记实验),具体行政行为前ivity是非常低,加上足够的标记的胆固醇达到目的的具体活动可能改变细胞中胆固醇含量,从而影响了结果。同样重要的是,( 我 )没有任何标记的胆固醇或细胞表面上的非特异性被困脂蛋白胆固醇会被迅速纳入受体通过非特异性转移;及(ii)标记的胆固醇之间的各种细胞内的平衡池。虽然平衡的无血清培养基培养24小时,在我们的经验是不足以实现这些目标,通常48 h后使用。许多类型的细胞不存活48小时,甚至24小时无血清培...
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有关这项研究的作者声明没有利益冲突。
这项工作得到了国家健康与医学研究委员会(NHMRC)澳大利亚(526615和545906)和部分赠款,由维多利亚州政府的OIS计划。 DS是NHMRC研究员。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 试剂\细胞 | HeLa细胞 | THP-1 | 未处理 | 人脐静脉内皮细胞 | 的BHK-21 | 卵泡液 |
| 完整的媒体 | 的RPMI - 10%FCS - 1%L-谷氨酰胺 - 0.2%,笔链球菌 | M199 - 5%FCS - 1%L-谷氨酰胺 - 1%钢笔链球菌 - 2%肝素钠(1M) - 7%的内皮细胞生长添加物(ECGS) | DMEM培养液 - 10%FCS - 1%L-谷氨酰胺 - 0.2%,笔链球菌 | |||
| 无血清 | 的RPMI - 1%L-谷氨酰胺 - 0.2%,笔链球菌 | M199 - 1%L-谷氨酰胺 - 1%钢笔链球菌 - 2%肝素钠(1M) - 7%的内皮细胞生长日补充(ECGS) | DMEM培养液 - 1%L-谷氨酰胺 - 0.2%,笔链球菌 | |||
| 通过方法 | 1 x胰蛋白酶 | 悬挂 | 刮 | 1 x胰蛋白酶 | ||
| 通过比 | 3:10 | 1:3 | 1:20 | 1:3 | 1:3 | |
| 细胞活化(可选) | TO-901317 - 的LXR激动剂 - 终浓度。 4μM的 | |||||
| 其他试剂 | 佛12豆蔻13酯(PMA) - 细胞分化 - 终浓度。 0.1μg/ml | |||||
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