胆固醇外流实验

摘要

胆固醇测定旨在定量测定培养细胞中胆固醇流出的速率，以及血浆受体接受细胞释放胆固醇的能力。该测定包括用胆固醇标记细胞、细胞内胆固醇池间的平衡，以及胆固醇向细胞外受体的释放。

摘要

细胞内的胆固醇含量必须维持在非常严格的范围内，细胞内胆固醇过多或过少都会导致细胞膜结构破坏、细胞凋亡和坏死¹。细胞可通过细胞内合成和血浆脂蛋白摄取两种途径获得胆固醇，这两种来源均足以完全满足细胞对胆固醇的需求。胆固醇的合成与摄取过程受到严格调控，因此胆固醇缺乏的情况较为罕见²。相比之下，胆固醇过多则更为常见³。除肝细胞和一定程度上的肾上腺皮质细胞外，大多数细胞无法降解胆固醇。细胞降低胆固醇含量有两种途径：一是将胆固醇转化为胆固醇酯，但该途径能力有限，因为胆固醇酯过度积累同样具有细胞毒性；二是胆固醇外流，这一途径具有潜在的无限容量。胆固醇外流是一个由多种细胞内转运蛋白调控的特异性过程，例如ATP结合盒转运蛋白A1（ABCA1）、G1（ABCG1）以及清道夫受体B1型（SR-B1）。血浆中胆固醇的天然受体是高密度脂蛋白（HDL）和载脂蛋白A-I。

胆固醇外流实验旨在定量测定培养细胞中胆固醇外流的速率。该实验可评估细胞维持胆固醇外流的能力，和/或血浆受体接受细胞释放胆固醇的能力。该实验包括以下步骤：第一步，在含血清的培养基中加入标记的胆固醇并与细胞共同孵育24-48小时，以标记细胞内的胆固醇。此步骤可与胆固醇负荷细胞的过程同时进行。第二步，将细胞在无血清培养基中孵育，使标记的胆固醇在所有细胞内胆固醇池之间达到平衡。此阶段可同时激活细胞内的胆固醇转运蛋白。第三步，将细胞与细胞外受体共同孵育，并定量测定标记的胆固醇从细胞向受体的转移量。如果使用胆固醇前体来标记新合成的胆固醇，则可能需要第四步，即胆固醇的纯化。

该检测可提供以下信息：(i) 特定处理（如突变、基因敲低、过表达或某种处理）对细胞外排胆固醇能力的影响，以及 (ii) 疾病或某种处理对血浆受体接受胆固醇能力的影响。该方法常用于心血管研究、代谢性疾病和神经退行性疾病，以及传染性和生殖系统疾病的研究中。

方案

1. [³H]-胆固醇的制备

1. 在通风橱中，分装所需的 [³将[H]胆固醇加入1.5 ml微量离心管中（0.5 μCi 每孔需要 19 kBq 才能满足典型检测的要求。
2. 如果 [³[3H]-胆固醇溶于甲苯后，用氮气完全干燥，再用100%乙醇重新悬浮，终浓度为 1 μCi (37 kBq/μl涡旋并充分混匀。

2. 细胞铺板与细胞胆固醇标记

本方案已使用以下细胞类型进行测试：人单核细胞^4,5、THP-1人单核-巨噬细胞^6,7,8、RAW 264.7小鼠巨噬细胞^5,9,10,11、HeLa细胞¹²、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、BHK-21细胞⁹、人和小鼠成纤维细胞^13,14、HepG2人肝癌细胞¹⁵，以及经修改后从血小板中提取¹⁶。

1. 重悬细胞并进行计数。将细胞以每孔0.9 ml完全培养基、终密度为0.2×10⁶ 个细胞的条件接种至12孔板中。细胞将继续生长，并在进行外排实验时达到每孔0.8×10⁶ 个细胞。对于不分裂的细胞（如已分化的THP-1细胞），接种密度应为每孔0.8×10⁶ 个细胞。若使用6孔板或24孔板，则每孔细胞数量相应加倍或减半。实验所需孔数应足以满足每种实验条件下设置四重复测定。
2. 若需诱导THP-1细胞分化，向培养基中加入PMA（终浓度0.1 μg/ml），作用48–72小时。
3. 取少量培养基加入含有[³H]胆固醇的微量离心管中。
4. 在将[³H]胆固醇加入另一份完全培养基（100 μl/孔）之前，先用培养基冲洗管壁。
5. 将含[³H]胆固醇的培养基加入含细胞的孔中（每孔终体积为1 ml）。若标记前无需对细胞进行处理，可直接将细胞接种于含[³H]胆固醇的培养基中。
6. 将细胞置于细胞培养箱中孵育48小时（37 °C，5% CO₂）。

3. 平衡孵育

1. 孵育48小时后，在显微镜下观察细胞，确保细胞状态良好且融合度约为80%。
2. 移除含有[³H]胆固醇的培养基，用PBS轻轻洗涤细胞，重复洗涤3次。
3. 制备无血清培养基。如需激活细胞，可向无血清培养基中加入LXR激动剂（如TO-901317，浓度为1–4 μMol/L）或cAMP（0.3 mMol/L；仅适用于小鼠来源的细胞）。
4. 向每孔加入500 μl无血清培养基。
5. 将细胞置于细胞培养箱中孵育18小时（37 °C，5% CO₂）。

4. 胆固醇外流孵育

1. 在无血清培养基中孵育18小时后，在显微镜下检查细胞，确保细胞状态良好且融合度达到80%以上。
2. 在无血清培养基中配制胆固醇外流受体溶液。受体示例包括：
   载脂蛋白A-I（apoA-I）（终浓度10 μg/ml）
   高密度脂蛋白（HDL）（终浓度20 μg/ml）
   环糊精（终浓度200 μg/ml）
   血浆（终浓度1-2%）
3. 用PBS轻轻洗涤细胞。
4. 每孔加入250 μl含受体的无血清培养基。
5. 保留一组孔用于测定背景外流量（即仅加入不含受体的无血清培养基）。
6. 将细胞在细胞培养箱中孵育2小时（37 °C，5% CO₂）。根据需要，外流孵育时间可在30分钟至8小时之间调整。

5. 样品处理

1. 孵育2小时后，在显微镜下观察细胞。
2. 收集培养基至1.5 ml离心管中，在室温下以14,000 rpm离心1–10分钟，以去除细胞碎片。
3. 转移 100 μl 将培养基转移至7 ml 闪烁瓶中。加入5 ml Insta-gel Plus（PerkinElmer），涡旋混匀。其余样品储存于 4 °C.
4. 将培养皿放入冰箱冷冻30分钟。加入 500 μl dH₂O，每孔加入。在显微镜下观察细胞，确保所有细胞均已从孔底脱落。若仍有细胞贴壁，可继续将培养板置于dH₂O at 4 °C 过夜培养或刮取孔内细胞。
5. 待所有细胞脱落后，用移液器反复吹打以分散细胞团块。转移 100 μl 分装至7 ml 闪烁瓶中。加入5 ml Insta-gel Plus（PerkinElmer），涡旋混匀。将剩余的培养板储存于 4 °C.
6. 将闪烁瓶置于闪烁计数器上。设置计数器计数时间为[³以 dpm 单位表示的 [H]

6. 结果分析

1. 胆固醇流出速率通常表示为从细胞转移到受体的胆固醇所占的比例。使用以下公式计算：

2. 特异性外排率计算为存在受体与不存在受体（空白）时外排量的差值。

7. 时间线

8. 代表性结果

图1展示了一项胆固醇流出实验的结果示例。在本实验中，THP-1人单核细胞被分化为巨噬细胞，并检测了胆固醇向不同受体的流出情况。向不含任何受体的培养基（“空白”）中的胆固醇流出率为0.79%，该值被视为非特异性流出，并从其他数值中扣除。向人载脂蛋白A-I（终浓度30 μg/ml）的胆固醇流出率为4.75%。本实验中包含一个参考血浆样本，用于监测实验间的变异情况。参考样本可用于对大量实验的数据进行标准化处理，但我们发现若变异较大时，应重复实验。在患者用药前后分别检测了其血浆（终浓度2%）的胆固醇流出能力。结论表明，在该患者中，药物治疗对血浆支持胆固醇流出的能力产生了负面影响。

图2展示了流出实验结果的另一个示例。在本实验中，RAW 264.7巨噬细胞经LXR激动剂TO-901317（终浓度1 μmol/L）过夜孵育后被激活或未被激活，并检测其向同一样本人血浆（2%）的胆固醇流出情况。结果表明，通过LXR激动剂激活细胞内ABC转运蛋白的表达可增强细胞向细胞外受体释放胆固醇的能力。

图1. THP-1细胞向不同受体的胆固醇流出。 图示为扣除空白值后的胆固醇流出百分比（即从细胞转移至指定受体的标记胆固醇比例）。数据为四次重复测定的平均值±标准差，*p<0.05。

图 2. RAW 264.7 细胞在有或无 LXR 激动剂激活条件下向人血浆的胆固醇外流。 胆固醇外流百分比（即从细胞转移至指定受体的标记胆固醇比例）已减去空白值。数据为四次重复测定的平均值 ± 标准差，*p<0.001。

讨论

所述的胆固醇流出测定方法旨在测量胆固醇从细胞向细胞外胆固醇受体的转运过程。理解该方法学时需考虑若干关键因素。

标记与平衡

在所述方法中，将标记的胆固醇加入含血清的培养基中。尽管该过程尚未被详细研究，但通常认为胆固醇会掺入血清脂蛋白中，并被细胞摄取。必须给予足够时间，以确保脂蛋白被充分摄取，并使胆固醇从脂蛋白转移至细胞膜。通常24小时的标记时间已足够，但延长至48小时可提高细胞内胆固醇的比活性。需要注意的是，如果使用[¹⁴C]胆固醇代替[³H]胆固醇（例如在双重标记实验中），前者的比活性非常低，为达到预期比活性而加入足量的标记胆固醇可能改变细胞内的胆固醇含量，从而影响实验结果。此外，还需注意以下两点：（i）细胞表面不能有非特异性滞留的标记胆固醇或脂蛋白，因为这类胆固醇可通过非特异性转移被受体迅速摄取；（ii）标记胆固醇应在细胞内不同池之间达到平衡。根据我们的经验，在无血清培养基中孵育24小时通常足以实现上述目标，但一般采用48小时孵育。许多细胞类型在无血清...