小鼠胚胎干细胞高效分化为运动神经元

摘要

我们开发了一种新方案以提高效率 体外 小鼠胚胎干细胞向运动神经元的分化。通过免疫组织化学技术检测到神经元及运动神经元标志物的表达，表明已分化的胚胎干细胞具备运动神经元的特征。

摘要

将胚胎干细胞（ES细胞）直接分化为功能性运动神经元，为研究疾病机制、筛选新药物化合物以及开发运动神经元疾病（如脊髓性肌萎缩症（SMA）和肌萎缩侧索硬化症（ALS））的新疗法提供了有前景的资源。目前许多方案采用视黄酸（RA）与音猬因子（Shh）联合使用，以诱导小鼠胚胎干细胞（mES细胞）向运动神经元分化^1-4。然而，mES细胞向运动神经元的分化效率迄今仅达到中等水平。我们开发了一种两步分化方案⁵，与现有成熟方案相比，显著提高了分化效率。第一步是通过添加Noggin和成纤维细胞生长因子（FGFs）来增强神经化过程。Noggin是一种骨形态发生蛋白（BMP）拮抗剂，根据神经发生的“默认模型”，其参与神经诱导，并促进前部神经模式的形成⁶。FGF信号通路与Noggin协同作用，通过促进后部神经特性，共同诱导神经组织的形成^7-9。在此步骤中，mES细胞经Noggin、bFGF和FGF-8诱导两天，以促进其向神经谱系分化。第二步是诱导运动神经元特化。经Noggin/FGFs处理的mES细胞随后在RA和Shh激动剂Smoothened激动剂（SAG）中孵育5天，以促进运动神经元的生成。为监测mES细胞向运动神经元的分化过程，我们使用了一种转基因小鼠来源的ES细胞系，该细胞系在运动神经元特异性启动子Hb9的调控下表达eGFP¹。采用这一稳健的方案，我们实现了51±0.8%的分化效率（n = 3；p < 0.01，Student's t-检验）⁵。免疫荧光染色结果显示，GFP+细胞表达运动神经元特异性标志物Islet-1和胆碱乙酰转移酶（ChAT）。我们的两步分化方案为高效地将mES细胞分化为脊髓运动神经元提供了一种有效途径。

方案

1. 步骤1：小鼠胚胎干细胞（mES）培养（耗时：3天）

1. 原代小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF）的铺板

1. 用明胶包被四个100-mm组织培养皿，以促进PMEF细胞的黏附。向每个培养皿中加入8 ml的0.1%明胶溶液（StemCell Technologies），于室温孵育30分钟。
2. 从培养皿中去除多余的明胶溶液，不要冲洗培养皿。
3. 将一管含有约5 × 10⁶个丝裂霉素C失活的PMEF细胞（Millipore）用40 ml PMEF培养基（见表1中的配方）稀释后，接种至四个100-mm组织培养皿中。PMEF将作为mES细胞的饲养层。
4. PMEF应至少在接种mES细胞培养物前一天进行接种。接种后的PMEF在一周内均可使用。

2. 培养小鼠胚胎干细胞

为了监测小鼠胚胎干细胞向运动神经元分化效率，我们使用了HBG3细胞系，这是一种来源于转基因小鼠的胚胎干细胞系，该转基因小鼠在运动神经元特异性启动子Hb9的调控下表达eGFP。

1. 在37 °C水浴中解冻1管HBG3小鼠胚胎干细胞（mES细胞，约1 × 10⁷个，由约翰·霍普金斯大学Douglas Kerr博士提供）。将5 ml ES培养基（配方....

讨论

mES细胞的质量是高效生成运动神经元最关键的参数。必须将mES细胞培养在PMEF上以防止其自发分化。添加LIF有助于维持mES细胞的未分化状态。由于mES细胞每12-15小时分裂一次，培养基会迅速耗尽，必须每天更换。

高效激活Shh通路是诱导运动神经元特化所需的关键参数。Shh蛋白（R&D System）以及Shh信号通路激动剂，如Hh激动剂HhAg1.3（Curis, Inc.）、purmorphamine（Calbiochem）和SAG（EMD Chemicals），均已被用于促进运动神经元的形成^1-3,10,11。我们发现，在诱导细胞向运动神经元表型分化方面，SAG比purmorphamine更有效⁵。使用1–2.5 μM purmorphamine联合1 μM RA时，分化效率从未超过20%。然而，在我们实验中，1 μM RA与1 μM SAG联用，在未进行神经诱导步骤的实验流程中即可达到约25%的分化效率。

为了进一步提高分化效率，我们在运动神经元特化步骤之前增加了.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PMEF	EMD Millipore	PMEF-H	N.A.
DMEM	Invitrogen	11965-118	N.A.
FBS	Invitrogen	16140-071	10%
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-081	1%
青霉素/链霉素	Invitrogen	15240-063	1%
DMEM	干细胞技术公司	36250	N.A.
胚胎干细胞合格胎牛血清	Invitrogen	16141-079	15%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
非必需氨基酸	Invitrogen	11140-050	1%
核苷	EMD Millipore	ES-008-D	1%
β-巯基–乙醇	EMD Millipore	ES-007-E	0.1 mM
青霉素/链霉素	EMD Millipore	TMS-AB2-C	1%
LIF	EMD Millipore	LIF2010	10 ng/ml
DMEM	干细胞技术公司	36250	N.A.
ES Cult FBS	干细胞技术公司	06905	15%
非必需氨基酸	Invitrogen	11140-050	1%
单硫代甘油	Sigma-Aldrich	M-6145	1 mM
Noggin	Invitrogen	PHC1506	50 ng/ml
FGF-8	Invitrogen	PHG0274	20 ng/ml
bFGF	Invitrogen	PHG0024	20 ng/ml
ES-Cult 基础培养基-A	干细胞技术公司	5801	N.A.
无血清替代物	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 添加剂	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	干细胞技术公司	07155	1%
抗坏血酸	干细胞技术公司	07157	1%
青霉素/链霉素	EMD Millipore	TMS-AB2-C	1%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G-8270	0.15% 溶于 d2H2O
纤连蛋白	干细胞技术公司	07159	5 μg/ml
肝素	Sigma-Aldrich	H3149	20 μg/ml 溶于 d2H2O
β-巯基–乙醇	EMD Millipore	ES-007-E	0.1 mM
视黄酸	Sigma-Aldrich	R-2625	1 μM
SAG	EMD Millipore	566660	1 μM
ES-Cult 基础培养基-A	干细胞技术公司	5801	N.A.
无血清替代物	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 添加剂	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	干细胞技术公司	07155	1%
抗坏血酸	干细胞技术公司	07157	1%
青霉素/链霉素	EMD Millipore	TMS-AB2-C	1%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G-8270	0.15% 溶于 d2H2O
纤连蛋白	干细胞技术公司	07159	5 μg/ml
肝素	Sigma-Aldrich	H3149	20 μg/ml 溶于 d2H2O
β-巯基–乙醇	EMD Millipore	ES-007-E	0.1 mM
BDNF	R&D Systems	248-BD-005/CF	10 ng/ml
CNTF	R&D Systems	257-NY-010/CF	10 ng/ml
GDNF	R&D Systems	212-GD-010/CF	10 ng/ml
NT-3	R&D Systems	267-N3-005/CF	10 ng/ml
N.A. = 不适用
表 1. 小鼠胚胎干细胞培养或分化用 PMEF 及培养基
0.1% 明胶	干细胞技术公司	07903	N.A.
聚-DL-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P0421	0.1 mg/ml 溶于 d2H2O
小鼠层粘连蛋白	EMD Millipore	CC095	2 μg/ml 溶于 PBS
0.25% 胰蛋白酶/EDTA	干细胞技术公司	07901	N.A.
Accumax	EMD Millipore	SCR006	N.A.
N.A. = 不适用
表 2. 包被与解离试剂