小鼠胚胎干细胞高效分化为运动神经元

摘要

我们开发了一种新方案以提高效率 体外 小鼠胚胎干细胞向运动神经元的分化。通过免疫组织化学技术检测到神经元及运动神经元标志物的表达，表明已分化的胚胎干细胞具备运动神经元的特征。

摘要

将胚胎干细胞（ES细胞）直接分化为功能性运动神经元，为研究疾病机制、筛选新药物化合物以及开发运动神经元疾病（如脊髓性肌萎缩症（SMA）和肌萎缩侧索硬化症（ALS））的新疗法提供了有前景的资源。目前许多方案采用视黄酸（RA）与音猬因子（Shh）联合使用，以诱导小鼠胚胎干细胞（mES细胞）向运动神经元分化^1-4。然而，mES细胞向运动神经元的分化效率迄今仅达到中等水平。我们开发了一种两步分化方案⁵，与现有成熟方案相比，显著提高了分化效率。第一步是通过添加Noggin和成纤维细胞生长因子（FGFs）来增强神经化过程。Noggin是一种骨形态发生蛋白（BMP）拮抗剂，根据神经发生的“默认模型”，其参与神经诱导，并促进前部神经模式的形成⁶。FGF信号通路与Noggin协同作用，通过促进后部神经特性，共同诱导神经组织的形成^7-9。在此步骤中，mES细胞经Noggin、bFGF和FGF-8诱导两天，以促进其向神经谱系分化。第二步是诱导运动神经元特化。经Noggin/FGFs处理的mES细胞随后在RA和Shh激动剂Smoothened激动剂（SAG）中孵育5天，以促进运动神经元的生成。为监测mES细胞向运动神经元的分化过程，我们使用了一种转基因小鼠来源的ES细胞系，该细胞系在运动神经元特异性启动子Hb9的调控下表达eGFP¹。采用这一稳健的方案，我们实现了51±0.8%的分化效率（n = 3；p < 0.01，Student's t-检验）⁵。免疫荧光染色结果显示，GFP+细胞表达运动神经元特异性标志物Islet-1和胆碱乙酰转移酶（ChAT）。我们的两步分化方案为高效地将mES细胞分化为脊髓运动神经元提供了一种有效途径。

方案

1. 步骤1：小鼠胚胎干细胞（mES）培养（耗时：3天）

1. 原代小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF）的铺板

1. 用明胶包被四个100-mm组织培养皿，以促进PMEF细胞的黏附。向每个培养皿中加入8 ml的0.1%明胶溶液（StemCell Technologies），于室温孵育30分钟。
2. 从培养皿中去除多余的明胶溶液，不要冲洗培养皿。
3. 将一管含有约5 × 10⁶个丝裂霉素C失活的PMEF细胞（Millipore）用40 ml PMEF培养基（见表1中的配方）稀释后，接种至四个100-mm组织培养皿中。PMEF将作为mES细胞的饲养层。
4. PMEF应至少在接种mES细胞培养物前一天进行接种。接种后的PMEF在一周内均可使用。

2. 培养小鼠胚胎干细胞

为了监测小鼠胚胎干细胞向运动神经元分化效率，我们使用了HBG3细胞系，这是一种来源于转基因小鼠的胚胎干细胞系，该转基因小鼠在运动神经元特异性启动子Hb9的调控下表达eGFP。

1. 在37 °C水浴中解冻1管HBG3小鼠胚胎干细胞（mES细胞，约1 × 10⁷个，由约翰·霍普金斯大学Douglas Kerr博士提供）。将5 ml ES培养基（配方见表1）加入15 ml离心管中，以800 rpm离心5分钟，收集细胞。
2. 吸除上清液，将mES细胞重悬于20 ml含有新鲜添加的白血病抑制因子（LIF）的ES培养基中，LIF终浓度为10 ng/ml。注意：LIF应在使用当天添加，以维持mES细胞的未分化状态。
3. 从每皿PMEF培养皿中移除10 ml PMEF培养基，并向每皿中加入10 ml HBG3 mES细胞悬液。
4. 接种后24小时，mES细胞形成小的克隆集落，大小类似于图1B中箭头所示的克隆。接种后72小时，克隆体积增大，许多直径约为100 μm（图1B中箭头指示）。此时细胞已准备好进行分化。应每天更换培养基以维持细胞增殖。

2. 步骤2：神经诱导（用时：2天）

为了诱导小鼠胚胎干细胞（mES细胞）分化为运动神经元，需要将mES细胞从原代小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF）中分离，并在悬浮环境中培养。使用明胶包被的培养瓶来分离PMEF与mES细胞。

1. 当小鼠胚胎干细胞（mES）集落准备进行神经诱导时（定义为分化第0天），在室温下用0.1%明胶（每瓶18 ml）包被2个T150培养瓶，孵育30分钟，随后去除多余明胶，并用1×PBS洗涤三次。注意：每100 mm培养皿的培养物需要一个经0.1%明胶包被的T150培养瓶，用于分离PMEF。
2. 小心吸去培养基，注意不要扰动松散附着的集落。加入10 ml PBS短暂冲洗，然后吸除，完成洗涤步骤。
3. 为分离mES细胞与PMEF，加入0.25%胰蛋白酶/EDTA（每皿3 ml，StemCell Technologies），在37 °C孵育3–5分钟，直至干细胞和PMEF从培养皿表面脱落。加入15 ml不含LIF的新鲜ES培养基，用移液器反复吹打细胞以分散集落（约15–20次）。随后将细胞悬液转移至一个0.1%明胶包被的T150培养瓶中，在37 °C孵育30分钟。孵育后，PMEF应贴附于明胶化表面，而ES细胞则保持悬浮状态。收集悬浮的mES细胞至50 ml离心管中。
4. 以800 rpm离心，弃上清，将细胞重悬于10 ml神经分化培养基中（配方见表1）。
5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，随后将约2 × 10⁶个mES细胞接种至100 mm细菌培养皿或悬浮培养皿中。此类培养皿支持悬浮培养物的生长，并促进胚状体（EBs）的形成。
6. 在分化第1天，mES细胞形成可在光学显微镜下观察到的小型悬浮聚集体（EBs），任何残留的PMEF会贴附于培养皿表面。将悬浮细胞及培养基转移至15 ml离心管中，以低速（500 rpm）离心3分钟。小心吸除上清，向沉淀的EBs中加入10 ml新鲜神经分化培养基，然后将细胞接种至新的细菌培养皿中。此步骤除补充培养基外，还可去除前一步骤中残留的PMEF。
7. 在分化第2天，EBs已准备好诱导为运动神经元。

3. 步骤3：运动神经元特化（时间：5天）

1. 在分化第2天，轻轻摇晃培养皿，将培养基和拟胚体（EBs）转移至15 ml离心管中。让拟胚体自然沉降（约10分钟）或低速离心（500 rpm，3分钟）。
2. 小心吸除培养基，用10 ml运动神经元分化（MND）培养基重悬拟胚体（见表1中的配方）。将拟胚体接种至新的细菌培养皿中，并每天更换培养基，持续5天。
3. 在分化第7天，拟胚体直径应约为150 - 200 μm，并表现出强烈的GFP信号（图1C）。此时拟胚体已准备好进行解离，并接种到聚-DL-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养皿或盖玻片上。

4. 步骤4：聚-DL-鸟氨酸/层粘连蛋白包被盖玻片的制备（耗时：2天）

在拟胚体解离前两天（即分化第5天），准备经多聚-DL-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片。

1. 将12 mm圆形盖玻片（Warner Instruments）放置于24孔板底部。将25 mg聚-DL-鸟氨酸（Sigma-Aldrich）溶于25 ml无菌双蒸水（d₂H₂O）中，配制成10倍储存液（1 mg/ml）。使用前，用d₂H₂O将聚-DL-鸟氨酸按1:10稀释，得到100 μg/ml的工作浓度溶液。每孔加入0.5 ml，4 °C孵育过夜。
2. 次日（分化第6天），吸除聚-DL-鸟氨酸溶液，将24孔板及盖玻片置于生物安全柜中自然晾干。用d₂H₂O冲洗孔板3次，再于室温下晾干1小时。
3. 将1 mg小鼠层粘连蛋白（Millipore）溶于5 ml预冷的1×PBS中，配制成100倍储存液（200 μg/ml）。使用前，用预冷的1×PBS按1:100稀释（含层粘连蛋白2 μg/ml）。每孔加入0.5 ml，4 °C孵育过夜。接种细胞前，应吸除多余层粘连蛋白溶液，并用1×PBS冲洗孔板2次。盖玻片可保存于MND培养基中（0.5 ml/孔）。

5. 步骤 5：轴突伸长（时间：2 天）

1. 在分化第7天，将拟胚体收集至15 ml离心管中，静置使其沉降（约3分钟）。吸除培养基，用PBS重悬拟胚体。再次静置后吸除PBS。重复此步骤3次。向拟胚体中加入1 ml Accumax（Millipore），轻轻混匀，在室温下孵育5分钟。然后吸除覆盖在拟胚体表面的过量Accumax。
2. 为解离拟胚体，加入3 ml MND培养基。使用1 ml Eppendorf移液器（蓝色吸头）反复吹打20次以破碎拟胚体。室温孵育2分钟。将细胞悬液转移至带有细胞滤网帽的12x75 mm试管（BD Falcon）中，以获得单细胞悬液。对滤网上残留的细胞团块和细胞重复此解离步骤，以提高单细胞得率。最终单细胞悬液体积为6 ml。
3. 轻轻混匀该单细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。将细胞用MND培养基（添加10 ng/ml BDNF、GDNF、CNTF和NT-3）稀释至浓度为2×10⁵ 个细胞/ml。将细胞悬液（0.5 ml/孔）加入含有聚-DL-鸟氨酸/层粘连蛋白包被盖玻片（按上述方法预先制备）的24孔板中。分化后的细胞在培养2天后可延伸出较长的神经突（图1D）。

6. 代表性结果

图1A 展示了本实验方案的流程概要。在第1步中，将小鼠胚胎干细胞（mES细胞）培养在PMES饲养层上，并添加白血病抑制因子（LIF）以防止其自发分化。通常情况下，未分化的mES细胞集落呈圆形、致密，边缘清晰，彼此之间不相互接触。一般建议每2~3天以1:4的比例传代一次。然而，不同细胞系的生长速度各不相同，传代比例需根据经验确定。图1B 中的箭头指示了mES细胞在PMES饲养层上培养3天后的典型形态。这些集落较大（直径50-100 μm），但仍保持圆形且边界清晰。在此阶段，集落已准备好进行分化或传代培养。图1B 中的箭头头指示的是接种后24小时常见的小型mES细胞集落。接种4天后，mES细胞会过度生长，表现为细胞扁平化、边界模糊，提示其已开始分化。此类细胞不适合用于向神经元细胞的分化。

为了将小鼠胚胎干细胞（mES细胞）分化为运动神经元，需在悬浮条件下培养mES细胞以促进拟胚体（EB）的形成。在第2步中，将ES细胞转移至无饲养层的培养表面，以促进EB形成。在此步骤中，细胞在添加了Noggin、bFGF和FGF-8的神经分化培养基中孵育2天，以诱导其向神经谱系分化。在分化第1天，可在显微镜下观察到小型EB，它们应悬浮于培养基中。分化第1天也可能残留原始小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF），必须将其去除。这些PMEF会贴附于细菌培养皿上，因此在将EB传代至新的细菌培养皿时可被清除。因此，在分化第2天，培养皿中应几乎看不到或完全无PMEF残留。在第3步中，持续将EB转移至新培养皿可确保彻底清除任何残留的PMEF。EB在添加了视黄酸（RA）和SAG的运动神经元分化（MND）培养基中继续培养5天，以诱导其分化为运动神经元。在培养过程中，EB持续增大，在分化第3~4天肉眼即可观察到。图1C展示了分化第7天EB的显微形态。与未分化的细胞不同，EB因表达绿色荧光蛋白（GFP）而呈现强烈荧光。这些EB已达到最佳分化状态，可进行解离。流式细胞术分析显示，解离后的EB中，有51% ± 0.8%的细胞分化为GFP阳性细胞⁵。在第5步中，将这些运动神经元在含有GDNF、CNTF、BDNF和NT3的条件下继续培养，可促进其长出较长的轴突突起。图1D展示了EB解离后接种2天时分化细胞的形态，可见从贴壁细胞胞体延伸出的长神经突。免疫荧光染色结果显示，GFP阳性细胞表达泛神经元标志物（神经丝蛋白中链）以及两种运动神经元特异性标志物（Islet-1和胆碱乙酰转移酶，图2）。

图1. 小鼠胚胎干细胞（mES细胞）向运动神经元的分化过程（图片改编自Wu et al.⁵）。A) mES细胞向运动神经元分化的流程示意图。B) 未分化的mES细胞在成纤维细胞饲养层顶部形成圆形克隆，GFP表达较弱。C) 将mES细胞从饲养层分离后，在低黏附培养皿中培养以形成拟胚体（EBs）。在分化过程的前两天，细胞暴露于50 ng/ml Noggin、20 ng/ml bFGF和20 ng/ml FGF-8中；随后用1 μM视黄酸和1 μM sonic hedgehog激动剂SAG诱导分化5天。分化的mES细胞表现出强烈的GFP荧光。D) 经7天分化后，将拟胚体解离并接种于聚-DL-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养板上。分化后的细胞在培养2天后延伸出长长的神经突起。比例尺 = 200 μm。MN = 运动神经元。B、C和D为明场图像，B'、C'和D'为相应的荧光图像。

图 2. 小鼠胚胎干细胞来源的运动神经元的表征。神经丝中分子链（NF-M，红色）、ChAT（红色）和Islet-1（红色）的免疫荧光染色与GFP（绿色）表达共定位。使用DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺 = 50 μm。

讨论

mES细胞的质量是高效生成运动神经元最关键的参数。必须将mES细胞培养在PMEF上以防止其自发分化。添加LIF有助于维持mES细胞的未分化状态。由于mES细胞每12-15小时分裂一次，培养基会迅速耗尽，必须每天更换。

高效激活Shh通路是诱导运动神经元特化所需的关键参数。Shh蛋白（R&D System）以及Shh信号通路激动剂，如Hh激动剂HhAg1.3（Curis, Inc.）、purmorphamine（Calbiochem）和SAG（EMD Chemicals），均已被用于促进运动神经元的形成^1-3,10,11。我们发现，在诱导细胞向运动神经元表型分化方面，SAG比purmorphamine更有效⁵。使用1–2.5 μM purmorphamine联合1 μM RA时，分化效率从未超过20%。然而，在我们实验中，1 μM RA与1 μM SAG联用，在未进行神经诱导步骤的实验流程中即可达到约25%的分化效率。

为了进一步提高分化效率，我们在运动神经元特化步骤之前增加了...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PMEF	EMD Millipore	PMEF-H	N.A.
DMEM	Invitrogen	11965-118	N.A.
FBS	Invitrogen	16140-071	10%
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-081	1%
青霉素/链霉素	Invitrogen	15240-063	1%
DMEM	干细胞技术公司	36250	N.A.
胚胎干细胞合格胎牛血清	Invitrogen	16141-079	15%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
非必需氨基酸	Invitrogen	11140-050	1%
核苷	EMD Millipore	ES-008-D	1%
β-巯基–乙醇	EMD Millipore	ES-007-E	0.1 mM
青霉素/链霉素	EMD Millipore	TMS-AB2-C	1%
LIF	EMD Millipore	LIF2010	10 ng/ml
DMEM	干细胞技术公司	36250	N.A.
ES Cult FBS	干细胞技术公司	06905	15%
非必需氨基酸	Invitrogen	11140-050	1%
单硫代甘油	Sigma-Aldrich	M-6145	1 mM
Noggin	Invitrogen	PHC1506	50 ng/ml
FGF-8	Invitrogen	PHG0274	20 ng/ml
bFGF	Invitrogen	PHG0024	20 ng/ml
ES-Cult 基础培养基-A	干细胞技术公司	5801	N.A.
无血清替代物	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 添加剂	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	干细胞技术公司	07155	1%
抗坏血酸	干细胞技术公司	07157	1%
青霉素/链霉素	EMD Millipore	TMS-AB2-C	1%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G-8270	0.15% 溶于 d2H2O
纤连蛋白	干细胞技术公司	07159	5 μg/ml
肝素	Sigma-Aldrich	H3149	20 μg/ml 溶于 d2H2O
β-巯基–乙醇	EMD Millipore	ES-007-E	0.1 mM
视黄酸	Sigma-Aldrich	R-2625	1 μM
SAG	EMD Millipore	566660	1 μM
ES-Cult 基础培养基-A	干细胞技术公司	5801	N.A.
无血清替代物	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 添加剂	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	干细胞技术公司	07155	1%
抗坏血酸	干细胞技术公司	07157	1%
青霉素/链霉素	EMD Millipore	TMS-AB2-C	1%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G-8270	0.15% 溶于 d2H2O
纤连蛋白	干细胞技术公司	07159	5 μg/ml
肝素	Sigma-Aldrich	H3149	20 μg/ml 溶于 d2H2O
β-巯基–乙醇	EMD Millipore	ES-007-E	0.1 mM
BDNF	R&D Systems	248-BD-005/CF	10 ng/ml
CNTF	R&D Systems	257-NY-010/CF	10 ng/ml
GDNF	R&D Systems	212-GD-010/CF	10 ng/ml
NT-3	R&D Systems	267-N3-005/CF	10 ng/ml
N.A. = 不适用
表 1. 小鼠胚胎干细胞培养或分化用 PMEF 及培养基
0.1% 明胶	干细胞技术公司	07903	N.A.
聚-DL-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P0421	0.1 mg/ml 溶于 d2H2O
小鼠层粘连蛋白	EMD Millipore	CC095	2 μg/ml 溶于 PBS
0.25% 胰蛋白酶/EDTA	干细胞技术公司	07901	N.A.
Accumax	EMD Millipore	SCR006	N.A.
N.A. = 不适用
表 2. 包被与解离试剂