本文介绍了一种用于水果中挥发性化合物分析的快速方法。该方法利用超快速气相色谱（GC）结合表面声波（SAW）传感器，对样品匀浆顶空中的挥发性化合物进行快速分离和检测。同时讨论了数据处理与分析的操作流程。
本文内容
摘要
摘要
果实成熟过程中会发生多种多样的生理变化，包括形成特定的挥发性物质混合物，从而形成果实的芳香特征。采收时的成熟度是影响果蔬风味品质的关键因素之一1。验证能够快速评估果实成熟度和香气品质的可靠方法，将有助于改进先进育种项目、生产实践以及采后处理的管理。
在过去三十年中，人们开展了大量研究以开发所谓的电子鼻，这类设备能够快速检测气味和风味2-4。目前已有多种基于不同技术的商用电子鼻可用于挥发性物质分析。本研究中使用的电子鼻（zNose，EST，Newbury Park，CA，USA）采用超快气相色谱与表面声波传感器联用技术（UFGC-SAW）。该技术已用于评估多种产品的质量，包括苹果变质的检测5；芒果成熟度与腐烂程度的评价6；百里香（thymus）物种的香气轮廓分析7；葡萄浆果中C6挥发性化合物的检测8；植物油的特征表征9以及初榨椰子油中掺杂物的识别10。
该系统可完成香气分析的三个主要步骤：顶空取样、挥发性化合物分离和检测。大约在一分钟内即可生成输出结果——色谱图，经过一次吹扫循环后，仪器即可进行下一次分析。利用Kovats指数（KI）计算，可将zNose获得的结果与其他气相色谱系统的结果进行比较。一旦使用烷烃标准溶液对仪器进行校准，保留时间将自动转换为KI值。然而，随着时间推移，温度和流速可能发生轻微变化，导致保留时间漂移。此外，根据色谱柱固定相的极性不同，KI值计算的重现性可能会有数个指数单位的差异11。因此，开发了一系列程序和图形化界面，以半自动化的方式对样品间的计算KI值进行比较。这些程序可减少大规模数据集色谱图分析所需的时间，并在色谱图未完全对齐时最大限度地降低数据误读的可能性。
我们介绍了一种用于水果中挥发性化合物快速分析的方法。同时讨论了样品制备、数据采集和处理流程。
方案
1. 样品制备
- 在所需的成熟阶段采收果实，用自来水冲洗以去除污垢和灰尘。
- 根据无外部和内部缺陷以及大小均匀的原则选取用于分析的果实。
- 将果实沿纵向切成楔形，用于挥发性物质取样。如适用，去除果皮、种子、种腔组织或果核。实验过程中果实组织的选择必须保持一致，并考虑单个果实内部的变异性（即从赤道部、花端和茎端等部位均等取样）。
- 合并所选的果肉组织，混合均匀以实现随机化，然后称取200 g放入搅拌机中。
- 加入200 mL饱和CaCl2溶液（20 °C下，500 mL去离子水中溶解372.5 g）和50 μL甲醇中100 mM的2-甲基丁基异戊酸酯溶液。CaCl2用于抑制因切割和均质果肉后可能发生的酶活性。2-甲基丁基异戊酸酯作为内标物，用于监测均质过程中挥发性化合物可能的损失。
- 在实验室搅拌机（Waring，USA）中以18,000 rpm均质30秒，然后立即倒入玻璃瓶中，并用聚四氟乙烯（Teflon）瓶盖密封。将均质液在室温下保存，直至所有样品制备完成。
- 将均质液倒入玻璃瓶后，静置10分钟，使泡沫与液体分离，然后用移液器吸取5 mL不含泡沫的液体至20 mL棕色玻璃小瓶中，并用带有聚四氟乙烯/硅胶隔垫的钢制螺旋盖密封。该步骤适用于甜瓜和梨的均质样品制备。若使用其他水果进行分析，可能需要增加离心步骤。因此，在去除泡沫后，需对液体进行离心，以沉淀可能堵塞移液器的颗粒。每个样品至少制备三个小瓶作为技术重复。
- 此时，样品可立即进行分析，或在液氮中快速冷冻后于超低温（-80 °C）保存以备后续分析。
- 对于冷冻样品，在分析当天从冰箱中取出，于室温下解冻一小时。解冻后、分析前，应更换小瓶盖，使用带有干净、干燥隔垫的新瓶盖。若不更换隔垫，解冻过程中凝结在隔垫上的水分可能被吸入仪器，造成损坏。
2. 气相色谱-表面声波（GC-SAW）系统设置与数据采集
- 在zNose上加载适当的分析方法。
为分析甜瓜中富含酯类的挥发性成分，我们在 MicroSense 5.44.22 软件（Newbury Park, CA, USA）中设置的参数如下：在 30 mL/min 条件下顶空吸气进样 20 秒-1 通过泵；入口温度在 200 °CTenax 捕集阱温度 225 °C；载气（氦气，纯度99.999%）流速为2.9 mL min⁻¹；色谱柱（DB-5柱，1 m × 0.25 mm I.D. × 0.25 μm 薄膜厚度）温度程序从 45 °C 到 180 °C 以……的速率 10 °C 秒-1；传感器温度在 40 °C；阀门位于 165 °C每个样品的总分析时间为1分钟。 - 将带有无穿刺尖端的不锈钢针连接到zNose进样口，用环境空气多次吹扫系统，直至基线稳定且未检测到高于200计数（Ct）的峰。
- 使用直链烷烃（C6-C14）溶液对仪器进行调谐。仪器软件利用调谐结果将洗脱峰的保留时间从时间单位转换为柯瓦特指数（Kovats Index，KI）单位。因此，系统调谐完成后，保留时间将以KI单位报告。
- 分析前，将样品平衡30分钟。分析其中一个样品瓶时，先将一根针头插入样品瓶隔垫以释放压力，然后将连接至仪器进样的针头插入样品瓶隔垫，并启动顶空进样。每份样品至少分析三个技术重复。
- 手动点击“Play”按钮启动仪器；泵随即启动，抽取样品上方存在的蒸气。分析结束后，屏幕上将显示色谱图，传感器会自动加热至 150 °C 持续10秒以清洁管路。当系统状态框按钮再次变为绿色时，仪器即可用于分析下一个样品。
- 为确保基线稳定和系统充分清洁，每个样品之间至少运行一次空气空白。为监测样品瓶和瓶盖可能带来的挥发性污染，每天开始和结束时各分析两个样品瓶空白（带盖的空瓶）。
3. 数据导出与分析
- 使用 MicroSense 软件中的“峰记录”功能采集数据后，将数据导出为 Microsoft Excel 文件。数据导出后，添加包含变量和重复样本标签的列。
- 使用我们开发的 Python 脚本（版本 2.6；可在线免费获取）“reform_data.py”转换数据格式，以便更方便地进行数据处理（参见图1，了解使用脚本“reform_data.py”前后数据格式的示例）。在脚本中直接编辑输入数据的源文件名（xls 格式）、工作表名称，以及期望的输出文件名（xls 格式）。
- 启动“kim_interface.py”（同样使用 Python 2.6 编写；见图2），并从上一步生成的文件中导入数据。具体而言，分析基于查看和分析每个 KI 值被检测到的次数（“KI hits”）。因此，程序会为每个 KI 值显示 KI hits 的柱状图。
- 评估特定样本子集的 KI hits，将每组技术重复样本一起分析。为此，通过勾选/取消勾选相应的复选框，分别分析每个处理组或变量。有关图形用户界面（GUI）功能的详细说明，请参见图2的图注。
- 在使用 GUI 确定每个 KI 窗口的宽度后，随机选择 MicroSense 软件中对应的色谱图，并评估技术重复样本之间的重叠峰。参见图3，了解两个技术重复样本叠加色谱图的示例。
- 一旦确定了 KI 窗口，使用 GUI 中提供的“合并”功能，将落在该窗口内的 KI 合并到数量最多的 KI 中。通过此功能，具有多个 KI 值标签的峰将被整合到单一 KI 标签下，从而可将这些峰视为单一变量。
操作方法如下：首先点击“合并”按钮以激活该功能，然后通过左键点击对应柱状图选择数量最多的 KI 作为窗口中心。选定后，该柱状图颜色变为绿色。要将窗口内其他 KI 合并至选定 KI，请右键点击相应柱状图；此时这些柱状图变为红色，同时在中心 KI 上方添加一条对应长度的蓝色柱状图（见图4）。当所有选定的 KI 均已合并至相应中心 KI 后，再次点击“合并”按钮以确认更改；此时“合并”按钮变为黄色。如操作有误，可使用“取消合并”按钮进行修正。取消合并时，先在 GUI 中点击“取消合并”按钮，然后右键点击欲取消合并的红色柱状图，该柱状图将由红色变为蓝色。再次点击“取消合并”按钮以确认更改。 - 若尝试将单个样本中的两个峰错误地合并为一个 KI 值，系统将打印错误信息。此时应仔细检查色谱图，并在该区域重新定义 KI 窗口。
- 完成所有合并操作后，保存文件。
- 在进行统计分析之前，需分析空气空白和瓶空白的色谱图，以监测可能的污染。确定空白中峰的 KI 后，从样品中相应峰的面积中减去空气和/或瓶空白中检测到的峰面积。
然后继续进行统计分析。
4. 代表性结果
电子鼻能够检测到在不同成熟阶段采收的甜瓜果实之间挥发性成分谱的差异（图5）。在所有样品中共鉴定出20个KI窗口。方差分析表明，电子鼻检测到的14个峰在不同成熟阶段之间存在显著差异。在图6中，这14种组分的平均峰面积的对数值被绘制成图，以显示两个成熟阶段——早期成熟和完全成熟果实——之间峰丰度的差异。
图1. 仪器软件导出的数据格式示例（A），以及使用“reform_data.py”脚本进行转换后的数据格式（B）。为便于数据处理与分析，首先识别所有样品中全部唯一的KI值，随后将数据重新排序，以样品信息为行、对应于唯一KI的峰面积为列。若某样品中未检测到某一KI值的峰，则相应单元格保持空白。
图2. 来自脚本文件“kim_interface.py”的界面截图。图中心的图表显示每个KI的命中次数与KI的关系。“每个KI的命中次数”是指检测到具有该特定KI值峰的样本数量。左侧有三个黄色框用于控制所选数据，用于设定划分数据集的参数（处理方式、重复次数、定性变量等）。在本图中，从上到下分别为：品种、播种日期和收获时的成熟阶段。底部：通过点击三条横杠并左右移动蓝色滑块，可选择KI范围的最小值和最大值，以及最小峰面积（“阈值”）。右侧：“合并”按钮允许通过手动点击图表中的条形图来合并选定的KI；“取消合并”按钮可用于对已选情况撤销合并操作。
图3. 甜瓜挥发性顶空气体中两个技术重复样本的叠加色谱图（黑色和红色），用于说明保留时间的偏移。
图4. KI合并过程示例。在中心图中，绿色条（中心KI）代表数量最多的KI，被选为KI窗口的中心。KI X和KI Y是落在目标窗口范围内的KI，需要合并到中心KI中。通过右键单击KI X的条形，其颜色变为红色，同时在绿色条上方出现一个与KI X条形等长的蓝色条。对KI Y重复相同操作后，蓝色条（合并的KI）的长度将相应增加。当所有KI均被添加后，点击绿色的“合并”按钮，合并过程结束，更改被保存，按钮颜色变为黄色。
图 5. 两个在不同成熟阶段采收的甜瓜样品的色谱图，分别为早熟期（上方）和完全成熟期（下方），用于展示电子鼻检测挥发性物质丰度差异的能力。
图6. 雷达图显示了两个不同成熟阶段（早期成熟和完全成熟）的两个甜瓜样品中14种组分的峰面积。峰面积以对数尺度表示，以便于可视化比较。每条射线末端的数字代表相应的科瓦茨指数。
讨论
电子鼻代表了一种对水果或富含挥发性成分的样品进行快速、客观香气轮廓评估的有前景方法。然而，保留时间的偏移为峰的鉴定带来了挑战，当两个色谱图未完全对齐时，可能导致数据的误读。对色谱图的目视检查表明，样品间保留时间的变异性常导致同一峰被标注为略有不同的KI值（约±10），从而导致检测到的独特KI数量被过度高估。为了充分利用以下两个事实：（a）不同成熟阶段存在不同的化合物；（b）技术重复样品之间大致相同，开发了两个基于计算机的脚本（“kim_merge.py”，用于处理数据集的程序，以及“kim_interface.py”，提供图形用户界面（GUI）），以半自动化的方式系统性地比较样品，显著减少了大规模数据集色谱分析所需的时间。这些程序可在适当情况下将标注为一定范围KI值的峰合并至单一KI标签下。这实现了两个重要目的：（a）使统计分析能够将此类峰视为单一变量；（b）便于峰的鉴定，并与其它系统及已发表的数值进行比较。本文展示的结果表明，结合适当的KI鉴定，可利用zNose系统根据成熟度和香气特征对甜瓜样品进行区分。这代表了一种用于挥发性物质分析的有前景的新技术，可用于质量控制项目。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
作者感谢比尔·科普斯（Bill Copes，戴维斯哈里斯莫兰种子公司）为本研究提供的甜瓜果实。本项目由美国农业部国家食品与农业研究所特色作物研究计划竞争性拨款项目资助，资助号为2009-51181-05783。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钙 | MP Biomedicals | 195088 | |
| 2-甲基丁基异戊酸酯 | SAFC Global | W350613 | ≥ 98%，天然，FCC |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A411-4 | |
| 小瓶 | Sigma-Aldrich | SU860098 | |
| 瓶盖 | Sigma-Aldrich | SU860101 | |
| 实验室搅拌器 | Waring Laboratory | 7009G | 双速搅拌器；1 升玻璃容器 |
| 瓶子 | Fisher Scientific | 06-414-1C | Pyrex，500 mL；聚丙烯塞密封 |
| 针头 | Electronic Sensor Technology | TLC101046 | 侧孔鲁尔接头 |
| 烷烃溶液 | Electronic Sensor Technology | 甲醇中的 C6-C14 烷烃溶液 | |
| zNose | Electronic Sensor Technology | Model 4500 | |
| DB-5 气相色谱柱 | Electronic Sensor Technology | SYS4500C5 | |
| MicroSense | Electronic Sensor Technology | Version 5.44.22 | |
| Python 2.6 | 在线免费提供 | ||
| "reform_data.py" 和 "kim_interface.py" 脚本 | 脚本作为 JoVE 上的补充材料提供 |
参考文献
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重印与许可
