使用微孔板凝固试验测定人血浆中V因子活性

摘要

本研究描述了一种新型的微孔板检测方法，用于测定人血浆中纤维蛋白凝块形成过程中未被先前报道过的V因子凝血活性。该方法利用动力学微孔板读板仪，在人血浆纤维蛋白凝块形成过程中连续监测405 nm处吸光度的变化。

摘要

损伤发生后，血液凝固被激活，导致凝血蛋白酶凝血酶的生成。凝血酶可将纤维蛋白原裂解为纤维蛋白，形成不溶性凝块，从而阻止出血。凝血因子V（FV）在其活化形式FVa中，是蛋白酶FXa的关键辅因子，在纤维蛋白凝块形成过程中作为凝血酶原酶复合物的一部分，促进凝血酶的生成^{1, 2}。已有文献报道手工FV检测方法^{3, 4}，但其耗时较长且具有主观性。自动化FV检测方法也有报道^5-7，但所用分析仪和试剂成本较高，通常仅提供凝块形成时间，无法反映纤维蛋白形成的速率和程度。由于操作便捷、节省时间、成本低、样品用量少、可连续监测以及适合高通量分析，微孔板平台更适用于测定酶催化反应^{8, 9}。已有微孔板法用于检测凝块溶解¹⁰、血小板聚集¹¹和凝血因子¹²的报道，但尚无用于测定人血浆中FV活性的微孔板检测方法。本方法的目标是建立一种可在人血浆纤维蛋白形成过程中测定FV活性的微孔板检测法。

这种新型微孔板方法概述了一种简单、经济且快速测定人血浆中V因子（FV）活性的检测法。该检测利用动力学微孔板读板仪监测人血浆中纤维蛋白形成过程中在405 nm处吸光度的变化。图1) ¹³该检测可准确测量纤维蛋白凝块形成的时间、初始速率和程度。仅需 μ少量血浆即可完成检测，耗时仅6分钟，通量高，对24-80 pM的FV敏感，可分别测定非故意激活的FV（一期活性）和凝血酶激活的FV（二期活性），从而全面评估其总功能活性（二期活性减去一期活性）。

弥散性血管内凝血（DIC）是一种获得性凝血功能障碍，通常继发于已存在的感染¹⁴。DIC 与不良预后相关，并会增加原有疾病基础上的死亡率¹⁵。该检测用于显示，在9例DIC患者中，与正常混合人参考血浆（NHP）相比，FV 的一期法、二期法和总活性平均分别下降了54%、44%和42%。

FV 微孔板检测法易于调整，可用于测量任何凝血因子的活性。该检测方法将通过更准确、更全面地测定FV在科研和临床环境中的活性，增进我们对FV生物化学特性的理解。这些信息将通过实现更早诊断以及开发出针对弥散性血管内凝血（DIC）等凝血障碍疾病更有效的治疗方法，对医疗环境产生积极影响。

方案

1. FV 缺乏的人类血浆的制备

1. 该方法是对Bloom最初描述的实验步骤的改进 等 ⁴.
2. 从一名自愿的健康成年志愿者（男性或女性，年龄18–50岁）处采集全人血，该志愿者不得服用任何药物。操作全程须佩戴乳胶手套并穿着实验服。
3. 配制 100 ml 3.2% (w/v) 柠檬酸三钠水溶液。将 6.0 ml 该溶液分别装入 60 ml 注射器中。小心推动注射器活塞至 6.0 ml 刻度处以排除空气。
4. 使用酒精棉片清洁上臂与前臂之间肘正中静脉区域。将20号蝶形针头连接至3 ml注射器。将蝶形针插入肘正中静脉，轻柔回抽活塞，直至血液充满至3 ml刻度线。弃去含有血液的注射器。此步骤旨在去除针头穿刺部位受损内皮释放的任何组织因子，这些因子可能激活凝血过程，干扰FV缺乏血浆的制备。
5. 将蝴蝶针连接至已装有6.0 ml 枸橼酸钠的60 ml注射器，轻柔拉动活塞，直至血液达到注射器上的60 ml刻度。（最终枸橼酸钠浓度为10.9 mM）。
6. 从蝴蝶针上取下注射器，同时用戴手套的手指或拇指轻压注射器出口，并轻轻混匀。
7. 继续按照上述方法，使用每个已装有6.0 ml 3.2%枸橼酸钠的60 ml注射器采集血液。预计经离心后，可回收的血浆量约为枸橼酸抗凝血体积的50%，且微孔板检测中每个样品需要50 μl的FV缺乏血浆。本实验室通常每次处理300–420 ml枸橼酸抗凝血，使用5–7支60 ml注射器，每支含6.0 ml 3.2%枸橼酸钠/注射器。所获得的FV缺乏血浆足以进行约3,000次微孔板检测（见下文）。
8. 从志愿者手臂上取下蝶形针，用无菌纱布垫按压静脉穿刺部位1.0分钟。用无菌绷带覆盖静脉穿刺部位。
9. 将抗凝血在室温下以3,300 x g离心20分钟。使用带搅拌子的塑料烧杯，用塑料移液管小心吸取上层黄色血浆层，注意勿扰动下层的红细胞和白细胞层。
10. 以毫升为单位测量血浆体积，并在加入EDTA前于冰上保留100 μl血浆，用于后续凝血酶原凝块时间（PT）检测（见下文）。
11. 在室温下，将固体EDTA缓慢加入柠檬酸盐抗凝血浆中，同时轻轻搅拌，使其终浓度达到5 mM。待EDTA完全溶解后，在轻轻搅拌条件下逐滴加入1.0 M NaOH，调节pH至7.0。
12. 用保鲜膜覆盖烧杯，在 37 °C 下孵育 8–10 小时，期间不搅拌。
13. 每2小时在冰上收集100 μl经EDTA处理的血浆，测定加入EDTA孵育时的凝血酶原时间（PT），并与加入EDTA前血浆的PT进行比较（见上文）。
14. 进行PT测定时，将可拆卸的8孔免疫模块条放入塑料模板架中，并插入微孔板读数仪。
15. 将免疫模块条带按以下顺序从左至右放置于微孔板读数仪的模板架中：空、空、样品、空、空、样品、空、空，以尽量减少相邻含样品条带之间的光散射干扰。同时，在每条8孔免疫模块条带中仅使用从上至下的第2至第7孔，以尽量减少塑料模板架边缘产生的光散射干扰。
16. FV 微孔板检测法能够同时测量至少 12 个不同样本中的纤维蛋白凝块形成（每条免疫模块条带检测 6 个样本，共 2 条免疫模块条带）。
17. 使用多通道移液器，向每孔中加入 50 μl HBS 缓冲液（20 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.4），每个待测样品对应一个微孔板孔。使用单通道移液器，向不同的微孔板孔中分别加入 50 μl 正常人混合参考血浆（NHP）或在加入 EDTA 前、以及加入 EDTA 后不同孵育时间点的血浆。
18. 使用多通道移液器，向所有含有待测血浆的微孔板孔中加入 50 μl 组织凝血活酶（制备方法见下文）。在微孔板读数仪中于 25 °C 孵育 1 分钟，并设置微孔板读数仪在 1 分钟孵育期间的第 15 至 25 秒对板进行振荡。
19. 使用与酶标仪连接的计算机，打开 SoftMax Pro 软件微孔板应用程序。将酶标仪设置为吸光度检测模式，波长设为 405 nm，检测模式设为动力学模式，温度设为 25 °C，并编程使酶标仪每 5 秒振荡 5 秒，然后每 5 秒读取一次 405 nm 处的吸光度，持续 6 分钟。
20. 使用多通道移液器，向微孔板的所有孔中加入氯化钙（50 μl，25 mM 溶于蒸馏水，终浓度为 2.1 mM），等待 15 秒，然后点击微孔板 SoftMax Pro 菜单上的“开始”图标以启动检测。
21. 在 SoftMax Pro 中，根据吸光度随时间变化的曲线确定 PT 值，即吸光度在 405 nm 处达到最大增加值一半所需的时间（即加入凝血活酶和氯化钙后所生成的 S 形吸光度-时间曲线的中点）。见下文， 图1).
22. 根据下图所示的凝固时间对数（秒）与FV活性对数（单位/毫升）之间的关系，计算FV一期活性 图2A为定量目的，1单位的FV活性定义为添加凝血酶进行人为激活前1.0 ml NHP中存在的活性（见下文“使用FV单阶段和双阶段微孔板凝血测定法检测人血浆样本”）。
23. 在蒸馏水中加入4.0 L 20 mM HEPES和0.15 M NaCl，轻轻搅拌溶解。逐滴缓慢加入5.0 M NaOH，调节pH至7.4（HBS，pH 7.4）。
24. 取一段足够长度的透析管，用蒸馏水彻底冲洗。将透析管一端打结。用塑料移液管将EDTA处理的血浆转移至透析管中，排出空气后，将另一端打结。
25. 将经EDTA处理的血浆小心地加入到HBS中，并轻轻搅拌。用保鲜膜封口，在4 °C下轻轻搅拌透析14–16小时。
26. 小心地将经EDTA处理并透析的血浆以3.0 ml等分转移至15.0 ml螺口管中，并保留100 μl置于冰上，用于测定“最终”FV缺乏血浆的凝血酶原时间（PT）。将FV缺乏血浆于-80 °C保存，直至使用。在上述条件下，加入EDTA后8–10小时，凝血酶原时间（PT）从加入EDTA前的10–15秒延长至90–100秒。采用本方法制备的FV缺乏血浆中，活性FV含量通常低于起始新鲜人血浆中FV含量的0.1%。

2. 组织凝血活酶的制备

1. 必须进行透析以去除该试剂中的任何钙离子，从而能够精确控制从加入氯化钙启动凝血过程到纤维蛋白凝块形成的时间。
2. 在塑料烧杯中，用蒸馏水配制100 ml和4.0 L的20 mM HEPES及0.15 M NaCl溶液，并轻轻搅拌。逐滴缓慢加入5.0 M NaOH，调节pH至7.4（HBS，pH 7.4）。
3. 向每瓶凝血活酶试剂中加入6.0 ml HBS（pH 7.4），盖上盖子，轻轻摇动使其溶解。将试剂置于带盖小瓶中，在室温下孵育15分钟，使干燥物质充分溶解，再轻轻摇动以确保完全溶解。
4. 截取适当长度的透析袋，用蒸馏水充分冲洗，并用结扎结系紧一端。将凝血活酶转移至透析袋中，排出空气后，用结扎结系紧另一端。
5. 将透析袋小心悬挂于4.0 L HBS（pH 7.4）溶液中，加盖保鲜膜，在4 °C下轻轻搅拌透析14–16小时。
6. 将透析后的凝血活酶分装为每份3.0 ml，转移至15 ml螺口管中，于-80 °C保存，待用。

3. FV 一阶段微孔板凝血活性测定标准曲线的制备

1. 将FV缺乏血浆、NHP和凝血活酶在37 °C下解冻10分钟。分别轻轻混匀FV缺乏血浆和凝血活酶，转移至不同的塑料孵育盘中，并置于冰上孵育。轻轻混匀NHP后也置于冰上保存。将氯化钙（25 mM溶于蒸馏水）置于另一塑料孵育盘中，室温保存。
2. 使用1.5 ml微量离心管，在HBS缓冲液（pH 7.4）中分别制备200 μl的NHP系列2倍稀释液，稀释倍数依次为0、2、4、8、16、32、64、128、256、512倍。充分涡旋混匀后置于冰上孵育。
3. 将可拆卸的8孔免疫模块条插入塑料模板支架中，并放入微孔板读板仪。
4. 将免疫模块条在微孔板读板仪中按以下方式排列：从左至右依次为空、空、样品、空、空、样品、空、空，以减少相邻含样品条带之间的光散射干扰。同时，在每个8孔免疫模块条中仅使用从上至下的第2至第7孔，以减少塑料模板支架边缘引起的光散射干扰。
5. FV微孔板检测法可同时测定至少12个不同样品中的纤维蛋白凝块形成（每条免疫模块条6个样品，共使用2条免疫模块条）。
6. 开启微孔板读板仪，并启动与之连接的SoftMax Pro微孔板分析软件。
7. 使用多通道移液器，向所有样品微孔板孔中同时加入50 μl的FV缺乏血浆。使用单通道移液器，将上述制备的10个NHP系列稀释液各50 μl分别加入不同的微孔板孔中。
8. 使用多通道移液器，向所有样品孔中加入50 μl凝血活酶。将板置于微孔板读板仪中，25 °C孵育1分钟，并设置读板仪在1分钟孵育的第15至25秒期间震荡微孔板。
9. 通过与微孔板读板仪连接的计算机，打开SoftMax Pro软件中的微孔板分析程序。将检测模式设为吸光度（Absorbance），波长设为405 nm，检测模式为动力学（Kinetic），温度设为25 °C，并设置在加入氯化钙后的前5秒进行震荡，随后每隔5秒检测一次405 nm处的吸光度，持续6分钟。计算凝块时间时不包含这5秒震荡时间（见下文）。
10. 使用多通道移液器，向所有样品微孔板孔中加入50 μl氯化钙溶液（25 mM溶于蒸馏水，终浓度为3.5 mM），等待15秒后，点击计算机上SoftMax Pro软件中的“开始”（Start）按钮，启动检测程序。
11. 凝块时间定义为加入凝血活酶和氯化钙后，吸光度在405 nm处达到最小值与最大值中点所需的时间（单位：秒）。
12. 凝块形成的初始速率定义为在吸光度-时间曲线的线性部分，凝块形成最初5个时间点所对应的405 nm处吸光度上升速率（mUnits/min）。
13. 凝块形成的程度定义为凝块形成过程中，405 nm处最大吸光度与最小吸光度之间的差值（Units）。

4. 使用FV单阶段和双阶段微孔板凝血检测法检测人血浆样本

1. 将FV缺乏血浆、正常混合血浆（NHP）、待测血浆样本和促凝血酶原激酶在37 °C下解冻10分钟。分别轻轻混匀FV缺乏血浆和促凝血酶原激酶，转移至独立的塑料ELISA洗涤槽中，并置于冰上孵育。轻轻混匀NHP和待测血浆后也置于冰上保存。将氯化钙（25 mM溶于蒸馏水）置于另一ELISA洗涤槽中，室温保存。
2. 使用1.5 ml微量离心管，用HBS缓冲液（pH 7.4）将NHP和待测血浆分别配制成40倍稀释液，每份200 μl。充分涡旋混匀后置于冰上孵育。
3. 将可拆卸的8孔免疫模块条插入塑料模板支架中，并将其放入微孔板读数仪。
4. 在模板支架中从左至右交替放置空条、空条、样品条、空条、空条、样品条、空条和空条，以减少相邻含样品条之间的光散射干扰。每个免疫模块条仅使用从上到下的第2至第7孔，以减少塑料模板支架边缘引起的光散射干扰。
5. 打开微孔板读数仪，并启动SoftMax Pro微孔板应用软件。
6. 使用多通道移液器，向所有样品微孔板孔中加入FV缺乏血浆（50 μl）。使用单通道移液器，分别向不同的微孔板孔中加入50 μl上述制备的40倍稀释NHP或待测血浆。
7. 使用多通道移液器，向所有样品孔中加入促凝血酶原激酶（50 μl）。在微孔板读数仪中于25 °C孵育1分钟，并设置读数仪在1分钟孵育期间的第15至25秒进行振荡。
8. 通过与微孔板读数仪连接的计算机，打开SoftMax Pro软件中的微孔板应用程序。将读数仪设置为吸光度模式，波长405 nm，动力学检测模式，温度25 °C；程序设定在加入氯化钙后的前5秒内进行振荡，并在此后每5秒测量一次405 nm吸光度，持续6分钟。计算凝固时间时不包含这5秒的振荡时间（见下文）。
9. 使用多通道移液器，向所有样品孔中加入氯化钙（50 μl，25 mM溶于蒸馏水；终浓度为6.25 mM），并立即在计算机上的SoftMax Pro软件中点击“开始”图标，启动检测程序。
10. 运行结束后，根据SoftMax Pro中吸光度-时间曲线，确定40倍稀释NHP和待测血浆的凝固时间、初始凝固速率及凝固程度。
11. 结合40倍稀释因素，利用各样本的凝固时间，根据FV单阶段活性标准曲线（Log凝固时间 vs. Log FV活性）（图2A）计算FV活性（单位为Units/ml）。此结果代表FV单阶段活性，即未经过“人为”凝血酶激活的状态。
12. 由于FV需经凝血酶激活为具有辅因子活性的FVa¹，因此在加入凝血酶并孵育后进行第二次检测，对于准确测定血浆样本的FV双阶段活性至关重要（即通过外源添加凝血酶实现“人为”激活）。
13. 进行FV双阶段检测时，准备200–300 μl纯化的凝血酶¹⁸，浓度为100 nM，溶于HBS缓冲液（pH 7.4），置于冰上孵育。计划每个待测血浆样本使用10 μl稀释后的凝血酶进行FV双阶段检测。
14. 将上述40倍稀释的NHP和待测血浆各取120 μl，用含2.8 mM氯化钙的HBS缓冲液（pH 7.4）170 μl进一步稀释至100倍。向每个样本中加入10 μl凝血酶（终浓度为10 nM）。充分涡旋混匀后，在37 °C孵育1分钟。
15. 将NHP和待测血浆进一步稀释至500倍：各加入400 μl HBS缓冲液（pH 7.4），充分涡旋混匀，然后按照上述FV单阶段微孔板检测方法，取每份血浆样本50 μl进行检测。
16. 根据SoftMax Pro中的吸光度-时间曲线，确定NHP及各血浆样本的凝固时间。结合500倍稀释因素，利用各样本的凝固时间，根据FV单阶段标准曲线（Log凝固时间 vs. Log FV活性）（图2A）计算FV双阶段活性。
17. 总FV活性可通过FV双阶段活性减去FV单阶段活性计算得出。

结果

代表性结果 - FV 一阶段微孔板凝固试验活性标准曲线的制备

微孔板读数仪记录的FV检测中随时间推移纤维蛋白凝块形成的代表性示例示于 图1FV 测定法可准确测量纤维蛋白凝块形成的时间、初始速率和程度。在测定结束时观察各孔，证实了凝块的形成。所有反应均达到大致相同的凝块形成程度，在加入促凝血酶原激酶和氯化钙前后，405 nm 处吸光度的变化普遍为 0.35 - 0.45 单位。图中显示了非人灵长类动物（NHP）系列稀释样本的 FV 一阶段活性标准曲线的代表性示例，分别为凝块时间对数（秒）相对于 FV 活性对数（单位/毫升）以及凝块形成初始速率对数（毫单位/分钟）相对于 FV 活性对数（单位/毫升）的曲线。 图2A 和 图2B，分别。对凝血时间与FV 1-活性的Log-Log图进行拟合表明，经线性回归分析后，这些变量之间存在显著的相关性（图2A；R² = 0.980）。对凝块形成的初始速率与FV活性的Log-Log图进行拟合，经线性回归分析也表明这两个变量之间存在强相关性。图2B；R² = 0.983）。Log凝血时间与Log初始凝血速率相对于Log FV活性的关系在NHP稀释至512倍范围内仍保持线性。由于FV在NHP中循环浓度约为12–40 nM ¹⁶，微孔板检测法对非人灵长类动物样本中的FV浓度可敏感至约24-80 pM。鉴于FVa-FXa-脂质复合物相互作用的解离常数 凝血酶原酶 约为1 nM ¹⁷，FV 微孔板检测完全适用于在FVa功能的生理相关nM范围内测定FV水平 凝血酶原酶

通过FV微孔板检测法，还确定了15份健康对照血浆（男性和女性，年龄18-20岁）在FV一期活性检测中的FV活性正常范围为（均值±标准差；范围）：0.96 ± 0.14 U/ml；0.68–1.11 U/ml。该结果与Cutler et al. 报道的使用自动化分析仪测定的FV一期活性正常值及范围（0.66–1.14 U/ml）高度一致⁷。在8个不同日期进行的FV一期检测中，6个孔内凝块形成的时间、程度和初始速率的批内变异系数分别为3.4%、4.4%和3.1%。在8个不同日期进行的8次独立实验中，每次实验6个孔的FV一期检测中凝块形成的时间、程度和初始速率的批间变异系数分别为7.1%、7.8%和9.2%。因此，这三个测定参数的批内和批间变异均处于较低且可接受的水平，表明该检测在同时处理多个样本（最多12个）的微孔板实验中具有良好的重复性和稳定性。

代表性结果——使用FV 1阶段和2阶段微孔板凝血测定法检测人血浆样本

采用Log凝固时间与Log FV活性的标准曲线（图2A），测定非人灵长类动物（NHP）以及9例弥散性血管内凝血（DIC）患者血浆中的FV活性。这些血浆未额外添加凝血酶时测定FV单阶段活性（FV 1-stage activity），或额外添加凝血酶激活后测定FV双阶段活性（FV 2-stage activity），结果如表1所示。9例DIC患者血浆的FV单阶段活性和凝块形成的初始速率分别比NHP平均降低54%和18%。DIC患者在FV单阶段检测中的凝块形成程度与NHP相比无明显差异，平均较NHP升高13%。

使用凝血酶激活NHP后，FV两阶段活性相比FV一阶段活性增加了约8倍（表1）。这表明NHP中的FV主要以未激活形式存在，与先前报道的手动倾斜试管FV检测^{3, 4}和自动化FV检测^5-7结果一致。DIC患者血浆中的FV两阶段活性和总活性也平均分别比NHP降低了44%和42%。在DIC患者中，FV两阶段检测中凝块形成的初始速率和最终程度与NHP相比无显著差异，平均分别相差约9%和4%。这些结果表明，与NHP中的FV相比，DIC患者血浆中的FV导致纤维蛋白凝块形成时间延长、形成速率降低，且患者FV被凝血酶激活的程度平均仅为NHP的56%。

图1. 使用动力学微孔板FV单阶段凝血测定法检测正常混合人参考血浆中的凝块形成。通过动力学微孔板读数仪连续监测NHP中纤维蛋白凝块的形成，检测波长为405nm。该曲线图显示的是在微孔板孔中，32倍稀释的NHP、FV缺乏血浆、促凝血酶原激酶和氯化钙反应6分钟后的微孔板读数仪输出结果。纵轴表示由于血浆中纤维蛋白形成所导致的405nm处吸光度的变化值。纤维蛋白形成的时间定义为吸光度达到最大增加值一半所需的时间，即曲线中点（36.40秒）。凝块形成的初始速率定义为曲线上吸光度线性上升阶段前5个时间点处405nm吸光度变化的速率（611.88毫单位/分钟）。凝块形成的程度定义为405nm处最大吸光度与最小吸光度之间的差值（0.35单位）。

图2. 采用因子V单阶段微孔板法测定正常混合人参考血浆中因子V活性时，凝血形成时间及初始速率的标准曲线。将正常混合人血浆（NHP）用HBS缓冲液进行系列稀释（0至512倍），并按照方案所述进行因子V单阶段微孔板检测。分别对A和B图中的数据进行线性回归建模后，显示了因子V单阶段微孔板法中凝血形成时间及初始速率的对数-对数曲线图。

样本	单阶段检测 活性（单位/毫升）	单阶段检测 反应程度（单位）	单阶段检测 初始速率（毫单位/分钟）	两阶段检测 活性（单位/毫升）	两阶段检测 反应程度（单位）	两阶段检测 初始速率（毫单位/分钟）	总活性（单位/毫升）
NHP	1.02	0.363	744.96	7.93	0.433	375.84	6.91
患者 1	0.36	0.404	583.80	3.84	0.432	249.96	3.48
患者 2	0.67	0.416	704.04	5.28	0.469	323.16	4.61
患者 3	0.31	0.435	562.08	3.92	0.453	294.96	3.61
患者 4	0.39	0.435	617.04	4.14	0.462	372.60	3.75
患者 5	0.73	0.401	641.40	5.91	0.433	354.24	5.18
患者 6	0.45	0.403	600.72	4.16	0.445	393.96	3.71
患者 7	0.49	0.395	575.40	4.89	0.449	357.48	4.40
患者 8	0.19	0.448	489.00	2.89	0.450	330.48	2.70
患者 9	0.64	0.423	699.48	5.11	0.455	417.24	4.47

表1 非人灵长类动物及9例弥散性血管内凝血（DIC）患者的FV活性。 非人灵长类动物和9例DIC患者血浆中的FV一期、二期及总活性是根据FV一期微孔板检测的凝固时间与FV活性的标准曲线（图2A）测定的，结果以单位/毫升（Units/ml）表示。FV一期和二期微孔板检测中凝块形成的初始速率（前五个时间点A405nm上升的初始速率，单位为mUnits/min）和反应幅度（A405nm最大值减去最小值）也一并列出。

讨论

动力学微孔板检测方法概述了一种新型、快速、经济且便捷的技术，用于测定人血浆样本中凝血因子V（FV）的凝血活性，这些样本可未经处理（FV单阶段检测）或经外源性凝血酶故意激活（FV双阶段检测）。该检测利用动力学微孔板读数仪，所需的所有材料和试剂均可商业获得或自行制备。该方法通过连续监测纤维蛋白凝块形成过程中血浆在405 nm波长下的光散射变化来实现检测。微孔板检测具有所需血浆样本量小（μl级）的优点，并可同时分析多个样本（最多12个）。当使用昂贵设备和试剂（如自动化分析仪和因子缺乏血浆）时、样本量有限（如患者血浆）或需分析大量样本（如从血浆中纯化FV过程中）时，该检测的这些特性尤为有利。

FV 微孔板检测法具有操作简便、快速的优点，且无需分离和纯化所需组分。与已报道的手工倾斜试管法^{3, 4}和自动化FV检测法^5-7相比，FV微孔板检测法具有相当的凝块时间有效检测范围（25–75 秒）以及相应的样本中FV水平（0.5–0.005 单位/毫升），检测灵敏度/检测限也相似（20–80 pM）。与依赖主观目视判断凝块形成的手工倾斜试管法^{3, 4}相比，FV微孔板检测法可对凝块形成时间、初始速率及纤维蛋白凝块形成的程度进行客观且定量的测量。与需要昂贵分析仪和试剂的自动化FV检测法^5-7相比，FV微孔板检测法所用试剂和材料成本低廉，所有必需材料均可商业购买或自行制备。手工倾斜试管法^{3, 4}和自动化FV检测法^5-7通常仅能提供凝块形成所需的时间，而无法提供凝块形成的时间、初始速率及程度；而FV微孔板检测法可通过分光光度法准确测定上述全部参数。最后，手工倾斜试管法^3,4和自动化FV检测法^5-7通常每次只能测定一个血浆样本中的FV活性；而FV微孔板检测法适用于高通量检测，可同时检测12个样本。

采用微孔板检测法证明，由于FV一期检测中凝块形成时间延迟以及初始凝块形成速率降低，9例DIC患者血浆中的FV活性低于正常人血浆（NHP）。在FV二期检测中，DIC患者血浆的初始凝块形成速率与NHP相比未发生变化。在FV一期和二期检测中，DIC患者血浆的凝块形成程度也与NHP相比无差异。FV一期、二期及总活性降低可能与该获得性血液疾病发病过程中FV消耗增加¹⁹和/或失活⁶有关，这与其他研究结果一致。鉴于DIC血浆中凝块形成的程度与NHP中观察到的结果相同，该变量很可能取决于FV缺乏血浆中的纤维蛋白原浓度，而非患者血浆本身的特性。

微孔板检测的结果表明，可通过FV单阶段检测中凝块形成的时间和初始速率，以及FV双阶段检测中凝块形成的时间和总活性，获得人血浆样本中FV活性的测量结果。无法根据FV单阶段和双阶段检测中凝块形成的程度，或FV双阶段检测中凝块形成的初始速率，对血浆样本中的FV活性进行定量测定。由于所有反应在加入促凝血酶原激酶和氯化钙前后，吸光度的最大变化幅度均接近相同，约为0.35 - 0.45单位，因此凝块形成程度的测量不能用于对特定血浆样本中FV活性进行定量评估。

这种新型的微孔板检测方法将可用于科研和临床环境中，测定人血浆样品及从人和动物血浆中纯化过程中各组分的FV活性。该微孔板检测法可同时测量凝块形成的时间、初始速率和形成程度；而这些参数通常在手工倾斜试管法和自动化凝血分析仪中无法被同时监测。与以往报道相比^3-7，该方法可对FV在人血浆凝血过程中的参与情况进行更全面的定量评估。当在科研和临床实验室中检测血浆样品或纯化的FV及FVa中FV活性发生显著变化时，这些信息尤为重要。FV微孔板检测法还可用于表征和测定可能激活或灭活FV和FVa的化合物，评估因FV Leiden突变而具有静脉血栓风险患者的FV活性^{20, 21}，以及监测FV从血浆中纯化过程中的活性变化。

FV 微孔板检测法易于调整，可用于测定外源性、内源性或共同凝血途径中任何凝血因子的活性，只需使用相应的因子缺乏血浆以及启动纤维蛋白形成的试剂即可。该检测方法将通过更准确、更全面地测量 FV 活性，增进我们对 FV 生物化学特性的理解，从而服务于科研和临床实验室。最终，这些信息将有助于医疗环境的改善，实现对患有凝血功能障碍（如弥散性血管内凝血，DIC）的个体进行早期诊断，并推动更有效治疗方案的开发。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动力学酶标仪	Molecular Devices	Spectra Max 190	SOFTmax PRO 4.3 LS 软件
正常混合人参考血浆	Precision Biologicals	CCN-10
枸橼酸三钠	Becton Dickenson	B10242
EDTA	Becton Dickenson	B10093
FV缺乏人血浆4			由新鲜人血浆制备，分装后于 -70 °C 保存。
3 ml 和 60 ml 注射器	Becton Dickenson	309585 和 136898
蝶形采血装置	Vacutainer	367251	20 号规格
HEPES	Sigma/Aldrich	H-3375
NaCl	Fisher	BP358-212
组织凝血活酶	Trinity Biotech	T1106	相对于 HBS 进行透析，pH 7.4，分装后于 -70 °C 保存。
氯化钙	Becton Dickenson	B10070
人凝血酶15			来源于人血浆；在 50% (v/v) 甘油中于 -20 °C 保存。
透析膜	Fisher	21-152-6	截留分子量 6–8 kDa；50 mm × 3 m。
模板架及可拆卸 8 孔条板	Nunc	14-245-63 和 469957
ELISA 洗涤槽	BioRad	224-4872
1.5 ml 微量离心管和 15 ml 螺口管	Sarstedt	72690 和 62554205
多通道移液器	Fisher	2703630	8 通道型号。