发育中与成熟视网膜神经元的单细胞分析

摘要

本文描述了一种分离单个视网膜细胞并扩增其cDNA的方法。单细胞转录组学可揭示组织中细胞异质性的程度，并发现稀有细胞群体的新标记基因。 accompanying protocol 可根据多种不同细胞类型进行调整。

摘要

高度特化的细胞群体虽然数量极为稀少，但在多种组织中发挥着重要作用。利用传统的整体组织研究方法，难以鉴定出这些极稀有细胞亚群的细胞类型特异性标志物和基因表达程序。对单个细胞进行基因表达谱分析，使得研究人员前所未有地能够获取仅占组织总体很小比例的细胞类型。^1-7此外，该技术还可用于研究在动态发育转变过程中，少量细胞短暂表达的基因表达程序⁸.

中枢神经系统（CNS）中反复出现细胞多样性的这一问题，其中神经元连接可能发生在差异较大的细胞之间⁹。确切的不同细胞类型的数量尚不完全清楚，但据估计仅大脑皮层本身可能就存在多达1000种不同的细胞类型¹⁰。复杂神经回路的功能可能依赖于某些稀有的神经元类型及其所表达的基因。通过鉴定新的标记物并帮助在分子水平上对不同神经元进行分类，单细胞方法在神经系统细胞类型分析中尤为有用。该方法还可能通过识别神经前体细胞发育早期阶段差异表达的基因及基因通路，有助于阐明神经发育的机制。

由于结构简单且易于获取，并具有丰富的神经元多样性，脊椎动物视网膜是研究细胞发育、神经元分化及神经元多样化过程的优良模型系统。然而，与其他中枢神经系统区域类似，这种细胞多样性为确定驱动视网膜前体细胞选择特定细胞命运的遗传通路带来了挑战，尤其是考虑到视杆光感受器占视网膜细胞总数的大部分¹¹。本文报道了一种用于鉴定单个视网膜细胞中表达转录本的方法（图1）。单细胞分析技术可用于评估视网膜不同细胞群体内存在的异质性程度^2,4,5,12。此外，该方法已发现一系列新的候选基因，这些基因可能在视网膜前体细胞亚群的细胞命运决定过程中发挥重要作用⁸。通过对实验方案进行一些简单调整，该技术可应用于多种不同的组织和细胞类型。

方案

1. 细胞解离

1. 本方案的流程图见图1。本方案所用试剂的具体目录号请参见表1。在PBS溶液中解剖视网膜。解剖过程中，最好去除玻璃体和晶状体，因为保留这些组织可能会影响组织的解离。并非在所有情况下都必须完全去除视网膜色素上皮（RPE），有时甚至无法将其完全去除。然而，在进行光感受器细胞的单细胞测序实验时，应尽量去除RPE。若未去除RPE，可能导致杆状细胞的表达谱中混入RPE特异性表达的基因，这可能是由于光感受器与RPE之间存在连接所致。
   对于组织解离，将整个成年小鼠视网膜置于含有20 μl 激活的木瓜蛋白酶、20 μl 含5 mM EDTA的25 mM 半胱氨酸溶液以及360 μl 添加了10 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS）的1.5 ml 微量离心管中，于37 °C孵育10分钟。整个方案中所有步骤均使用带滤芯的移液器吸头，以最大限度减少潜在污染。木瓜蛋白酶的浓度和孵育时间需根据组织的年龄和性质进行调整。例如，对于出生后第0天（P0）获取的发育中视网膜，将其置于含10 μl 激活的木瓜蛋白酶、10 μl 含5 mM EDTA的25 mM 半胱氨酸溶液以及380 μl 添加了10 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，于37 °C孵育10分钟即可。不同物种的视网膜所需条件也略有差异。在大多数发育阶段，鸡的视网膜比小鼠视网膜更薄，使用10 μl 激活的木瓜蛋白酶、10 μl 含5 mM EDTA的25....

讨论

越来越多的研究揭示，在原本被认为基因表达较为均一的细胞群体中，细胞间的异质性十分显著^6,8。至少已有研究表明，这种基因表达的“噪声”具有重要的生物学功能¹³。传统的整体组织检测方法会掩盖单个细胞之间的基因表达差异，这些实验所获得的是一个“平均”细胞的表达谱，可能并不具备代表性¹⁴。本文介绍一种从单个视网膜细胞中分离并鉴定其基因表达模式的方法。对单个细胞的研究使科研人员能够深入探究复杂组织背后存在的细胞异质性，这对于确定不同类型细胞特有的基因表达模式至关重要。此外，单细胞分离还可揭示在发育过程中不同时期驱动单个细胞活动的基因调控程序。尽管该方法在研究神经系统时尤为有用——因为复杂细胞网络的功能可能依赖于稀有细胞类型的独特基因表达——但本实验方案也可经调整后用于从多种组织中分离单个细胞。

在小鼠视网膜早期发育过程中，神经节细胞、水平细胞、视锥光感受器细胞以及无长突细胞均在重叠的时间窗口内生成¹⁵。此外，每个退出细胞周期的细胞均处于不同的成熟阶段，这一事实进一步增加了发育中视网膜的复杂性。最后，对于某.......