本文描述了一种分离单个视网膜细胞并扩增其cDNA的方法。单细胞转录组学可揭示组织中细胞异质性的程度，并发现稀有细胞群体的新标记基因。 accompanying protocol 可根据多种不同细胞类型进行调整。
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摘要
摘要
高度特化的细胞群体虽然数量极为稀少，但在多种组织中发挥着重要作用。利用传统的整体组织研究方法，难以鉴定出这些极稀有细胞亚群的细胞类型特异性标志物和基因表达程序。对单个细胞进行基因表达谱分析，使得研究人员前所未有地能够获取仅占组织总体很小比例的细胞类型。1-7此外，该技术还可用于研究在动态发育转变过程中，少量细胞短暂表达的基因表达程序8.
中枢神经系统（CNS）中反复出现细胞多样性的这一问题，其中神经元连接可能发生在差异较大的细胞之间9。确切的不同细胞类型的数量尚不完全清楚，但据估计仅大脑皮层本身可能就存在多达1000种不同的细胞类型10。复杂神经回路的功能可能依赖于某些稀有的神经元类型及其所表达的基因。通过鉴定新的标记物并帮助在分子水平上对不同神经元进行分类，单细胞方法在神经系统细胞类型分析中尤为有用。该方法还可能通过识别神经前体细胞发育早期阶段差异表达的基因及基因通路，有助于阐明神经发育的机制。
由于结构简单且易于获取，并具有丰富的神经元多样性，脊椎动物视网膜是研究细胞发育、神经元分化及神经元多样化过程的优良模型系统。然而，与其他中枢神经系统区域类似，这种细胞多样性为确定驱动视网膜前体细胞选择特定细胞命运的遗传通路带来了挑战，尤其是考虑到视杆光感受器占视网膜细胞总数的大部分11。本文报道了一种用于鉴定单个视网膜细胞中表达转录本的方法（图1）。单细胞分析技术可用于评估视网膜不同细胞群体内存在的异质性程度2,4,5,12。此外，该方法已发现一系列新的候选基因，这些基因可能在视网膜前体细胞亚群的细胞命运决定过程中发挥重要作用8。通过对实验方案进行一些简单调整，该技术可应用于多种不同的组织和细胞类型。
方案
1. 细胞解离
- 本方案的流程图见图1。本方案所用试剂的具体目录号请参见表1。在PBS溶液中解剖视网膜。解剖过程中，最好去除玻璃体和晶状体，因为保留这些组织可能会影响组织的解离。并非在所有情况下都必须完全去除视网膜色素上皮（RPE），有时甚至无法将其完全去除。然而，在进行光感受器细胞的单细胞测序实验时，应尽量去除RPE。若未去除RPE，可能导致杆状细胞的表达谱中混入RPE特异性表达的基因，这可能是由于光感受器与RPE之间存在连接所致。
对于组织解离，将整个成年小鼠视网膜置于含有20 μl 激活的木瓜蛋白酶、20 μl 含5 mM EDTA的25 mM 半胱氨酸溶液以及360 μl 添加了10 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS）的1.5 ml 微量离心管中，于37 °C孵育10分钟。整个方案中所有步骤均使用带滤芯的移液器吸头，以最大限度减少潜在污染。木瓜蛋白酶的浓度和孵育时间需根据组织的年龄和性质进行调整。例如，对于出生后第0天（P0）获取的发育中视网膜，将其置于含10 μl 激活的木瓜蛋白酶、10 μl 含5 mM EDTA的25 mM 半胱氨酸溶液以及380 μl 添加了10 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，于37 °C孵育10分钟即可。不同物种的视网膜所需条件也略有差异。在大多数发育阶段，鸡的视网膜比小鼠视网膜更薄，使用10 μl 激活的木瓜蛋白酶、10 μl 含5 mM EDTA的25 mM 半胱氨酸溶液以及380 μl 添加了10 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS），于37 °C孵育5分钟即可完成解离。 - 轻轻敲击离心管以使沉降的细胞松动，然后用p1000移液器轻柔吹打10–20次。若仍有较大的组织团块，于37 °C额外孵育10分钟，随后再次吹打10–20次。
- 加入5 μl DNase I（10 U/μl），室温孵育5分钟。用p1000移液器轻柔吹打。具体吹打次数需根据实验经验确定，但通常在10–20次之间。
- 在台式离心机中以3000 rpm离心3分钟，弃去上清液，保留管底100–200 μl液体，轻敲管壁使沉淀松动。加入1 ml HBSS，通过轻柔吹打重悬沉淀。此步骤中轻敲管壁至关重要，因为仅靠吹打重悬可能会裂解大量视网膜细胞，成年小鼠视网膜尤其如此。
- 以3000 rpm离心3分钟，小心弃去上清液，用含0.1% BSA的450 μl PBS重悬细胞。应尽可能彻底去除上清液，以最大限度减少裂解细胞释放的mRNA以及解离过程中可能抑制后续反应的副产物。
2. 单细胞收获
- 准备两个6 cm培养皿，每个皿中加入5 ml含0.1% BSA的PBS。将解离后的细胞接种至其中一个培养皿中，静置至少5分钟，使细胞沉降。所用细胞密度很大程度上取决于待分析单细胞的性质。例如，对于用荧光标记（如GFP）标记的稀有细胞，可将整个解离的视网膜组织接种于一个6 cm培养皿中。对于相对更丰富的细胞类型，则应初始接种较少细胞，以便更容易用第一根移液毛细管捕获一个（或接近一个）细胞。
- 将含有解离细胞的培养皿置于倒置显微镜下。我们使用的是Olympus的IMT-2型号显微镜。使用拉制为细尖端的微移液毛细管（内径0.5 mm，外径1.04 mm）（图2），并配合吸管装置，捕获单个细胞。当微移液毛细管靠近培养皿中的细胞时，细胞会迅速进入毛细管内。吸管装置的长度必须适中，不能过长或过短，以适应倒置显微镜载物台的高度（我们使用的倒置显微镜配套吸管装置长度为38.1 cm）。若吸管过长，则细胞可能无法有效从微移液毛细管排出至收集管中。我们主要使用较早期的IMT-2型倒置显微镜，原因在于其载物台高度与我们的吸管组件配合最为理想。细胞（或多个细胞）进入微移液毛细管后，将其排出至第二个培养皿（洗涤皿）中，以确保仅收集一个且唯一一个细胞用于基因表达谱分析。在第二个培养皿中，通常需要使用新的微移液毛细管去除多余细胞，或将目标细胞转移至其他位置，以确保仅有一个细胞进入微移液毛细管。
- 当单个细胞完全与邻近细胞分离后，使用新的微移液毛细管按照2.2节所述方法吸取目标细胞，随后直接将其排入含有4.5 μl细胞裂解缓冲液的0.2 ml PCR管中。细胞应排至管壁侧边，注意避免将微移液毛细管尖端折断在管内。样品可在台式微量离心机中短暂离心，使细胞浸入裂解缓冲液中。此类离心通常每收集5个细胞后进行一次，并在收集结束后再进行一次。含有裂解缓冲液的单细胞样品在单细胞分离全程中应始终保持在冰上。为获得最佳结果，建议在组织解离后两小时内完成单细胞收集。超过该时间后，应尽快进入逆转录步骤，因延迟已被观察到会增加RNA降解的风险。
3. 逆转录
- 将样品在台式小型离心机中短暂离心，以确保所有单细胞均浸入细胞裂解缓冲液中。为促进细胞裂解，将样品在70 °C下于PCR仪中孵育90秒。随后立即将离心管放回冰上。
- 将离心管置于冰上静置2分钟。所有试剂添加步骤均应使用带滤芯的移液器吸头，以防止污染。进行逆转录反应时，加入0.33 μl Superscript III (200 U/μl)、0.05 μl RNase抑制剂 (40 U/μl) 和0.07 μl T4基因32蛋白。将反应混合物在PCR仪中50 °C孵育50分钟。随后在70 °C孵育15分钟以灭活酶，并将样品置于冰上。
- 为去除游离引物，加入0.1 μl外切酶缓冲液 (10X)、0.8 μl分子生物学级dH2O和0.1 μl外切酶I (20 U/μl)。在PCR仪中37 °C孵育30分钟。通过在80 °C孵育25分钟灭活酶，然后将离心管置于冰上。
4. 加尾与单细胞 PCR
- 加入6 μl加尾反应混合物，使用PCR仪在37 °C孵育20分钟，70 °C孵育10分钟，然后保持在4 °C
- 将10 μl加尾后的样品加入PCR反应混合物中，并按照以下条件进行第二链合成和PCR扩增：
- 95 °C预变性2分钟
- 37 °C退火5分钟
- 72 °C延伸16分钟
- 93 °C变性40秒
- 67 °C退火1分钟
- 72 °C延伸6分钟，每个循环增加6秒
- 重复步骤4共34次
- 72 °C最终延伸10分钟
- 保持在4 °C
5. Affymetrix 芯片标记
- 标记10-20 μg的cDNA（单个细胞扩增所得cDNA的浓度通常约为1 μg/μl），以在Affymetrix芯片上获得较强的杂交信号。首先，将10-20 μl单细胞cDNA加入8 μl 1X One-Phor-All缓冲液和1 μl稀释后的DNaseI（用1X One-Phor-All缓冲液按1:10稀释），总体积为80 μl。在PCR仪中37 °C孵育13分钟。然后100 °C加热15分钟以灭活DNase I，随后置于冰上。
- 加入20 μl 5X TdT缓冲液、2.5 μl Biotin N6-ddATP（Enzo Biosciences）和1 μl TdT（用TdT缓冲液按1:8稀释）。
- 37 °C孵育90分钟，随后65 °C孵育5分钟。产物可保存于-20 °C，或立即用于Affymetrix芯片杂交。杂交步骤依照Affymetrix标准操作流程进行。
6. 代表性结果
为评估 cDNA 的质量，取 10 μl cDNA 样品上样至 1% 琼脂糖凝胶。cDNA 主要通过 cDNA 弥散条带的大小范围（500–2000 bp）及其强度进行判断（图 1 和 图 3a）。在 图 1 所示的凝胶中，每隔一条泳道显示的是从 E16.5 小鼠视网膜细胞分离得到的 cDNA 弥散条带，中间的泳道则显示仅将培养基吸入并注入 PCR 管后产生的结果。这些对照泳道中有时仍可见微弱的弥散条带，但使用基因特异性 PCR 引物进行扩增时不会产生任何特异性产物。此外，cDNA 弥散条带的强度可能存在一定差异（可比较 图 1 与 图 3a）。在 图 3a 中，泳道 a、f、g 和 h 的 cDNA 弥散条带较强，而泳道 b、c、d 和 e 的条带则明显较弱。
基因特异性PCR被用作对单细胞cDNA质量进行二次筛选的方法。图3中的cDNA来自荧光标记的视网膜神经节细胞，并使用针对视网膜神经节细胞标志物Brn3b和Pax6的PCR引物进行检测。在该实验中，取1 μl cDNA进行30个循环的PCR扩增。实时定量PCR是更理想的检测方法，但其成本可能过高，且在仅需评估cDNA质量的情况下并非必需。所检测的8个单细胞中，全部对Brn3b呈阳性，其中6个对Pax6呈阳性（图3b）。即使cDNA条带强度较弱，也能扩增出Brn3b和Pax6的条带。尽管PCR结果显示如此，但根据我们的经验，如泳道b、c、d和e所示的cDNA条带通常在Affymetrix芯片上无法产生强烈的杂交信号，因此一般应避免使用。通过针对光感受器标志物Crx的基因特异性PCR，可评估单细胞cDNA中的污染程度（图3b）。选择光感受器标志物是因为这类细胞占视网膜细胞的大多数（约70%），因此任何发生的细胞裂解最可能涉及视杆细胞。即使经过30个PCR循环，这些cDNA样品中仅能检测到极微量的Crx。最后，这种基于PCR的筛选方法还可用于在对cDNA进行全基因组微阵列分析之前，初步判断其来源于特定细胞类型的哪些亚群，从而有助于优先选择需进行表达谱分析的细胞，因为这一步骤是整个流程中最昂贵的环节。例如，我们通过检测Tachykinin1基因的存在，已鉴定出视网膜神经节细胞中的特定亚群（图3b）。
通过小规模的基于PCR的筛选，选择特定的单个细胞，并将其cDNA与Affymetrix微阵列进行杂交。通过比较微阵列数据，并利用标准的聚类算法可发现表达模式。如图4所示，生成热图以图形化地展示数据。关于图4中的单细胞分析数据，可得出两个主要结论。首先，在完成单细胞实验流程后，特定细胞类型中表达的基因几乎仅存在于该特定细胞类型中。在少数情况下，某一细胞类型的标志基因也会在另一细胞类型中被检测到，例如双极细胞以较低水平表达某些“视杆细胞”基因；此类在第二种细胞类型中的表达通常可通过原位杂交或抗体染色实验轻易验证。其次，在更为多样化的无长突细胞和神经节细胞表达谱中，基因表达的异质性显而易见。Pou4f1仅在约1/4的发育期神经节细胞中表达，而Nr4a2和Scube2则是不同无长突细胞中异质性表达基因的两个实例。事实上，热图中展示的基因仅是极小的一部分样本，已有数百个基因被鉴定并确认为发育期神经节细胞的标志物，或不同亚群无长突细胞的标志物2,4。
图1. 单细胞分析方法的流程图。 首先，分离视网膜并通过木瓜蛋白酶消化将其解离为单个细胞。其次，使用拉制的玻璃针采集单个细胞，并将其转移至PCR管中。细胞经裂解后，通过逆转录结合PCR扩增cDNA。使用琼脂糖凝胶电泳评估所得cDNA的质量，如图所示。在第一泳道的DNA Marker之后，各泳道依次显示来自单细胞的cDNA弥散条带（以红色括号标示）与培养基阴性对照的扩增产物交替排列。此类质量的条带（红色括号内）可用于与Affymetrix微阵列进行杂交。
图 2. 针头与吸管装置的照片。 单个细胞通过拉制的玻璃微量移液管（内径 0.5 mm，外径 1.04 mm）的毛细作用分离，并通过向吸管中吹气产生的压力进行转移。吸管必须足够长以便于操作，同时又足够短以可靠地释放单个细胞，这一点非常重要。B 图显示了拉制成针头的毛细管的放大视图。
图3. 单细胞cDNA扩增产物的代表性电泳图及基因特异性PCR结果。 为评估单细胞cDNA扩增后的质量，取每个单细胞样本10 μl与阴性对照一同在1%琼脂糖凝胶上电泳（A）。应可见500–2000 bp范围内的弥散条带（smear）。进一步通过基于PCR的特定基因筛查，可帮助鉴定或确认所分离细胞的类型以及样本中可能存在的污染程度（B）。使用针对视网膜神经节细胞标志物Brn3b和Pax6的特异性引物，以验证这些细胞的身份（第1和第2行）。为评估制备样品中光感受器细胞污染的程度，采用针对光感受器标志物Crx的特异性引物（第3行）。部分亚群的神经节细胞还可通过检测如Tachykinin1等标志物进行鉴定（第4行）。
图 4. 标记基因的单细胞表达。 以热图形式展示在 22 个不同单细胞中选择性表达基因的微阵列结果。微阵列信号强度已进行标准化，对应于红色的深浅程度。黑色表示微阵列上无信号。所示的视网膜神经节细胞（RGC）前体细胞来源于胚胎期时间点，而其他细胞则来源于成年视网膜。
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讨论
越来越多的研究揭示，在原本被认为基因表达较为均一的细胞群体中，细胞间的异质性十分显著6,8。至少已有研究表明，这种基因表达的“噪声”具有重要的生物学功能13。传统的整体组织检测方法会掩盖单个细胞之间的基因表达差异，这些实验所获得的是一个“平均”细胞的表达谱，可能并不具备代表性14。本文介绍一种从单个视网膜细胞中分离并鉴定其基因表达模式的方法。对单个细胞的研究使科研人员能够深入探究复杂组织背后存在的细胞异质性，这对于确定不同类型细胞特有的基因表达模式至关重要。此外，单细胞分离还可揭示在发育过程中不同时期驱动单个细胞活动的基因调控程序。尽管该方法在研究神经系统时尤为有用——因为复杂细胞网络的功能可能依赖于稀有细胞类型的独特基因表达——但本实验方案也可经调整后用于从多种组织中分离单个细胞。
在小鼠视网膜早期发育过程中，神经节细胞、水平细胞、视锥光感受器细胞以及无长突细胞均在重叠的时间窗口内生成15。此外，每个退出细胞周期的细胞均处于不同的成熟阶段，这一事实进一步增加了发育中视网膜的复杂性。最后，对于某...
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