方法文章

三维自组装肽水凝胶中人类神经前体细胞的培养

16.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/3830

⸱

2012年1月11日

 ,  , 
1Albrecht-Kossel-Institute for Neuroregeneration, University of Rostock

本文内容

摘要

本文描述了利用自组装三维支架培养人类神经前体细胞的方法。我们提供了一种从支架中释放细胞的方案，以便后续对细胞进行分析，例如通过流式细胞术。该方案可适用于其他细胞类型，以开展深入的机制性研究。

摘要

为了探索神经系统疾病或神经退行性疾病中基于细胞的标准化治疗方法，研究三维（3D）支架对细胞生长、增殖以及最终神经元分化的影响具有重要意义。相较于二维培养，三维结构被认为能够提供更接近体内环境的培养条件。在再生医学领域，将生物材料支架与神经干细胞及前体细胞相结合，展现出巨大的治疗潜力1-5。已有研究表明，模拟三维环境的培养系统可影响多种干细胞和前体细胞的增殖与分化。其中，三维微环境的构建与功能化对于决定包埋细胞的存活状态及其命运至关重要6-8。本研究采用PuraMatrix9,10（RADA16，PM），这是一种基于多肽的水凝胶支架，已被广泛描述并用于研究三维环境对不同类型细胞的影响7,11-14。PuraMatrix易于定制，其纳米纤维为人工合成，所提供的三维培养系统具有高度可靠性，且不含异源成分。

最近，我们研究了PM浓度对支架结构形成的影响13。在本研究中，所使用的PM浓度直接影响了三维结构的形成，这一结果通过原子力显微镜得以证实。随后对人神经前体细胞（hNPCs）的存活与分化情况进行分析，发现所用PM浓度对包埋细胞的命运具有影响。然而，通过免疫荧光技术对细胞存活或神经元分化进行分析时存在一些困难。为了获得可靠的数据，必须确定基质内细胞的总数，从而计算出由βIII-微管蛋白标记的神经元细胞等特定细胞类型的相对数量。这就要求采用共聚焦显微镜或能够获取样品z轴层扫描图像的荧光显微镜等类似技术，对支架进行三维分析。此外，此类分析极为耗时。

本文展示了一种从3D支架中释放细胞的方法，以便后续进行分析，例如流式细胞术。在本实验方案中，人神经前体细胞（hNPCs）ReNcell VM细胞系（Millipore USA）在由PuraMatrix（PM）或添加了层粘连蛋白的PuraMatrix（PML）构成的3D支架中进行培养和分化。据我们经验，0.25%的PM浓度最适合细胞培养13，但该浓度可根据其他细胞类型进行调整12。释放后的细胞可用于免疫细胞化学研究，并进一步通过流式细胞术进行分析。该方法可加快分析速度，更重要的是，所得数据基于更广泛的样本基础，从而提高了数据的可靠性。

方案

1. 第1部分：在PuraMatrix中培养人神经前体细胞（hNPCs）

  1. 在制备浓度为0.25%且不含层粘连蛋白的PuraMatrix支架之前，需预先配制以下溶液
  2. 配制含有20%蔗糖和含有10%蔗糖的溶液，均用无菌蒸馏水溶解。
  3. 对于溶液1，取120 μl 20%蔗糖溶液与120 μl蒸馏水在1.5 ml锥形管中混合。
  4. 对于溶液2，取60 μl PuraMatrix溶液与60 μl 20%蔗糖溶液在1.5 ml锥形管中混合。

制备含有层粘连蛋白（每100 μl基质含8 μg）且PuraMatrix浓度为0.25%的支架时，需准备以下溶液。

  1. 配制溶液1：在1.5 ml锥形管中加入72 μl蒸馏水、120 μl 20%蔗糖溶液和48 μl层粘连蛋白。
  2. 配制溶液2：在1.5 ml锥形管中混合60 μl PuraMatrix溶液与60 μl 20%蔗糖溶液。
  1. 对于将细胞包埋于PuraMatrix中，需准备一个4孔细胞培养板，并在其中两个孔中放置灭菌的玻璃盖玻片（直径13 mm）。将培养板存放于超净工作台中以备后续使用。玻璃盖玻片仅用于免疫细胞化学研究。若不进行免疫细胞化学染色，此步骤可省略。

为了将人神经前体细胞（hNPCs）包封在三维支架中，需准备以下溶液。将Benzonase用胰蛋白酶/EDTA溶液稀释，稀释比例为1:10,000。配制胰蛋白酶抑制剂/Benzonase溶液：DMEM/F12培养基中加入Benzonase至终浓度25 U/μl、1%人血清白蛋白（HSA）以及胰蛋白酶抑制剂（终浓度0.5 mg/ml）。

  1. 加入 500 μl 胰蛋白酶/苯佐核酸酶溶液，于培养箱（37°C，5% CO2）中孵育 5 分钟以解离细胞。使用胰蛋白酶抑制剂/苯佐核酸酶溶液终止反应。随后将解离的细胞在 3000 × g 条件下离心 5 分钟。用 5 ml 10% 蔗糖溶液洗涤细胞，再次离心。弃去上清液。
  2. 将细胞重悬于 10% 蔗糖溶液中，最终细胞悬液浓度应为 1×106 个细胞/ml。

由于PuraMatrix溶液的pH值较低，可能对细胞有害，因此接下来的步骤1.8至1.11应尽快完成。

  1. 将60 μl细胞悬液与溶液1混合。
  2. 将含有细胞的120 μl溶液1缓慢加入含有溶液2的锥形管中，并轻轻混匀。
  3. 立即将100 μl混合液分别加入置于4孔板内的盖玻片上。
  4. 每孔缓慢加入200 μl细胞培养基，2–3分钟后再次加入200 μl。这将启动基质的自组装过程。
  5. 将细胞置于洁净台内的加热板或洁净台的加热区域，于37 °C孵育1小时。在此期间应尽量避免移动培养板，以免影响基质的组装。
  6. 用1000 μl移液器吸除大部分培养基，但不要完全吸干，以防基质干裂。加入500 μl培养基洗涤基质10分钟。最后吸除旧培养基，加入500 μl新鲜培养基，将培养板放入培养箱（37°C，5% CO2）中。由于基质对震动敏感，应尽量减少移动培养板，若条件允许，应将其放置于独立的培养箱中。
  7. 本实验所用的人神经前体细胞（hNPCs）在3D支架中增殖7天后，通过去除生长因子诱导其分化13。每2–3天更换一次培养基。

2. 第二部分：完整基质的免疫细胞化学染色

  1. 染色操作前需预先配制以下溶液：封闭缓冲液，由5%正常山羊血清和0.3% Triton X-100溶于PBS中制成；4%多聚甲醛溶液，以0.1 M PBS为基础配制；如需进行细胞核染色，还需配制含100 ng/mL DAPI（4',6-二脒基-2'-苯基吲哚二盐酸盐）的PBS溶液。样品使用Mowiol与DABCO混合液封片。
  2. 洗涤基质时，用1000 μl移液器吸除培养基，并用PBS洗涤支架一次，每次5分钟。
  3. 固定支架时，吸除PBS，向每孔中加入400 μl 4%多聚甲醛溶液（溶于0.1 M PBS），室温孵育30分钟。固定后的支架可保存于含0.02% NaN3的PBS中，4°C条件下可保存数周至数月。
  4. 染色前，用PBS洗涤支架5分钟。
  5. 将支架置于封闭缓冲液中孵育。封闭液每2–3小时更换一次，共更换三次，随后于4°C过夜孵育。
  6. 吸除封闭缓冲液，加入用含1%正常山羊血清的PBS稀释的一抗溶液，于4°C过夜孵育。
  7. 去除一抗溶液，用PBS洗涤支架4次，每次2小时，随后于4°C过夜洗涤，全程避光。
  8. 吸除PBS，加入用含1%正常山羊血清的PBS稀释的二抗溶液，室温避光孵育4小时。
  9. 用PBS洗涤样品4–6次，每次1小时，随后于4°C过夜洗涤，全程避光。
  10. 如需进行细胞核染色，可加入400 μl DAPI溶液，孵育30分钟。
  11. 封片时需使用显微镜载玻片。在载玻片上滴加50 μl Mowiol/DABCO封片剂。从4孔板中取出盖玻片，小心地将其放置于封片剂上。
  12. 本实验采用Biozero 8000显微镜（Keyence，德国卡尔斯鲁厄）获取单张显微图像及z轴层扫图像（z-stacks）。每个z轴层扫包含30张单图，层间距离为1–2 μm。使用配套分析软件去除荧光成像固有的模糊效应后，生成z轴层扫的完整投影图像。

3. 第三部分：从支架中释放hNPCs用于流式细胞术分析

  1. 在从支架中释放细胞之前，先用 500 μl HBSS 清洗支架。
  2. 使用 1000 μl 移液器将支架转移至含有细胞培养基的 15 ml 锥形管中。
  3. 为机械性破坏支架，用 1000 μl 移液器反复重悬细胞溶液数次，随后在 3000 × g 条件下离心 5 分钟。
  4. 用移液器吸除上清液，加入 500 μl 胰蛋白酶/苯佐内酯溶液，并反复重悬细胞沉淀数次。
  5. 将细胞在 37°C 下孵育 5 分钟以进行胰蛋白酶/苯佐内酯消化。为终止反应，加入 1 ml 胰蛋白酶抑制剂/苯佐内酯溶液，并反复吹打数次。
  6. 将细胞悬液在 3000 × g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液后用 2 ml HBSS 缓冲液洗涤细胞。重复此步骤两次。该步骤可去除基质碎片。
  7. 将细胞悬液通过细胞筛网（孔径 70 μm）过滤，以去除细胞团块，并将细胞收集于细胞培养基中。所得细胞可重新接种，例如接种于盖玻片上用于膜片钳或荧光检测等功能研究。若需进行流式细胞术分析，应立即固定细胞（见 4.1）。

4. 第4部分：通过流式细胞术定量分析βIII-微管蛋白阳性细胞

  1. 将步骤 3.7 中获得的释放细胞用 1% PFA 在室温下固定 15 分钟。
  2. 将细胞悬液在 3000 × g 条件下离心 5 分钟，并弃去上清液。如需保存以备后续分析，可将细胞重悬于洗涤缓冲液（含 0.5% BSA 和 0.02% 叠氮化钠的 PBS）中，并置于 4°C 保存。
  3. 为进行流式细胞术前处理，将细胞悬液在 350 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，然后将细胞重悬于 25 μl 抗体溶液中。第一抗体需用皂苷缓冲液按 1:100 的比例稀释，例如 βIII-微管蛋白抗体。皂苷缓冲液由 PBS 配制，其中皂苷浓度为 0.5%，BSA 浓度为 0.5%，叠氮化钠浓度为 0.02%。
  4. 将细胞悬液与第一抗体在室温下于摇床上孵育 2 小时。设置阴性对照组时，制备不含第一抗体的样本。
  5. 第一次洗涤时，直接向细胞中加入 300 μl 皂苷缓冲液，将细胞悬液在 350 × g 条件下离心 5 分钟。第二次洗涤时，弃去上清液，加入 300 μl 缓冲液，再在 350 × g 条件下离心 5 分钟。
  6. 弃去上清液，加入 25 μl 含第二抗体的溶液（例如 Alexa Fluor 647，1:1000，溶于皂苷缓冲液中）。将细胞在室温下避光孵育 1 小时。
  7. 第一次洗涤时，直接向细胞中加入 300 μl 皂苷缓冲液，将细胞悬液在 350 × g 条件下离心 5 分钟。第二次洗涤时，弃去上清液，加入 300 μl 缓冲液，再在 350 × g 条件下离心 5 分钟。
  8. 弃去上清液，将细胞重悬于 500 μl 洗涤缓冲液中，用于流式细胞术分析。

5. 代表性结果

图1展示了在自组装水凝胶支架PuraMatrix中培养的人神经前体细胞（hNPCs）的一个示例。在未修饰的PuraMatrix（PM）中，hNPCs以类球状结构生长。在此培养条件下，细胞在透射光下难以识别，但球状结构之间可见突起形成的束状结构（图1A）。根据所用细胞类型的培养条件，可对基质进行修饰，例如添加层粘连蛋白（laminin）。对于ReNcell VM（Millipore）这一hNPC细胞系，添加层粘连蛋白可诱导形成细胞聚集密度较低但分布更均匀的生长模式（图1B）。无论是否进行修饰，该基质均可用于研究神经元分化等过程。图1C展示了hNPCs经神经元标志物βIII-微管蛋白染色的结果。在本示例中，细胞在基质中培养7天，随后撤除生长因子EGF和bFGF以诱导分化，并继续分化4天13。细胞胞体及细胞形成的致密突起网络清晰可辨。然而，显然对细胞数量进行定量分析十分耗时，因为必须分析基质多个区域的大量图像，才能获得用于统计分析的可靠数据集。图1D显示了从基质中释放后接种于盖玻片上的细胞示例。这些细胞可用于功能研究。

从三维支架中释放细胞后，可对多种参数进行分析，例如标志物蛋白的表达、通过Annexin V/PI染色或TUNEL实验检测细胞存活率等。图2展示了通过流式细胞术分析βIII-微管蛋白+细胞百分比的示例。图2A显示了阴性对照（未标记βIII-微管蛋白的细胞），此类对照用于确定后续检测βIII-微管蛋白+细胞的设门范围（图2B）。图2C比较了人工细胞计数与流式细胞术分析的结果。βIII-微管蛋白+细胞的百分比通过荧光图像中总细胞数（通过细胞核DAPI染色计数）和βIII-微管蛋白+细胞数量的统计来确定。

显微镜下的细胞培养：细胞结构、神经网络、荧光染色图像。
图 1. 在自组装肽水凝胶 PuraMatrix 中培养的人神经前体细胞（hNPCs）。 A) 包埋于 PuraMatrix（PM）中的 hNPCs 形成球形、致密堆积的结构，球体直径可达数百 μm。在球体之间可见由细胞形成的突起束（箭头所示）。B) 在添加层粘连蛋白（laminin）的 PuraMatrix（PML）中包埋的细胞生长为较松散、分布更均匀的结构。在添加层粘连蛋白的基质中，可在较稀疏区域观察到单个细胞（箭头所示），但难以准确量化细胞数量。C) hNPCs 在 PML 中分化 4 天后表达神经元标志物 βIII-微管蛋白（绿色）。为评估阳性细胞百分比，需通过细胞核染色（如 DAPI，蓝色）确定总细胞数。该显微照片为使用 Biozero-8000 显微镜拍摄的 z 轴层扫图像的全投影。D) 从基质中释放的细胞可接种于盖玻片等表面，用于进一步的功能研究。该显微照片显示细胞在释放后继续培养 3 天的结果。βIII-微管蛋白染色（红色）显示其形态与三维支架内培养的细胞相似。

流式细胞术图示（A、B）和图表（C），显示βIII-微管蛋白细胞随时间的分化情况。
图2. 从PuraMatrix中释放的细胞进行流式细胞术分析。 为克服显微照片定量分析耗时的问题，我们采用了一种从PuraMatrix中释放细胞的方案，从而实现通过流式细胞术进行更快速的分析。A）未染色细胞作为阴性对照，用于设定后续分析（如βIII-微管蛋白阳性细胞）的门控（黑色框）。B）为定量βIII-tubulin+细胞的比例，使用了在阴性对照中设定的相同门控。阳性细胞位于x轴右侧，其中还观察到一个中间群体（虚线框），很可能代表细胞碎片。C）手动计数与流式细胞术计数结果的比较显示，流式细胞术检测出更高比例的阳性细胞，且βIII-tubulin+细胞数量随时间变化的趋势相似，表明该流式细胞术方案具有可靠性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

使用三维支架为研究不同类型细胞在更接近体内环境的细胞培养条件下的发育提供了机会。然而，在进行神经元分化分析或功能性研究时，必须克服一些障碍，才能获得可靠的定量细胞类型等数据。

本文描述了在基于多肽水凝胶PuraMatrix的支架中培养人神经前体细胞（hNPCs），以及随后将细胞释放用于二维条件下的研究，从而便于使用FACS或功能检测等工具。近期，我们通过原子力显微镜证明了PuraMatrix浓度对三维支架形成的影响，并研究了其对细胞存活和分化的作用。13 然而需要注意的是，不同细胞类型可能需要不同的培养条件，或由其他材料（如Matrigel或胶原蛋白）构成的基质。

细胞释放的方案基于制造商提供的方案18 其方法可与制备原代神经元培养物的常规方案相比较，即首先通过机械法分离细胞，随后利用酶消化去除周围组织成分。细胞对此处理过程具有良好的耐受性，保持活性，并重新长出突起，当再次接种于层粘连蛋白（laminin）包被的表面时，可表达神经元标志物如βIII-微管蛋白。本研究...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

作者感谢 Norman Krüger 提供出色的技术支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PuraMatrix 肽水凝胶 BD 生物科学354250
小鼠层粘连蛋白 ICultrex400-2009090
蔗糖Sigma-AldrichS9378-1KG
正常山羊血清DakoX0907
Triton X-100卡尔罗斯特有限责任公司3051.3
PBS DulbeccoBiochrom AGL 1825
HBSSGIBCO，隶属于 Life Technologies14170-088汉克斯’ 平衡盐溶液 1X
βIII-tubulin 抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.Sc-51670小鼠，单克隆，1:500
Alexa Fluor 488InvitrogenA 11029山羊 α 小鼠，1:1000
Alexa Fluor 568InvitrogenA 11031山羊 α 小鼠，1:1000
Alexa Fluor 647InvitrogenA 21235山羊 α 小鼠，1:1000
Mowiol 4-88 试剂Calbiochem475904
DabcoAldrichD2,780-21,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷 98%
细胞筛BD 生物科学35235070 μm 孔径大小
皂苷默克 & Co., Inc.7695
胰蛋白酶/EDTAGIBCO，隶属于 Life Technologies25300-054
Benzonase 250 U/μl默克 & Co., Inc.1.01654.0001
胰蛋白酶抑制剂Sigma-AldrichT6522（500 mg）
20% HSAOctapharma人血清白蛋白 Kabi 20%

参考文献

  1. Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).
  2. Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine. Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).
  3. Blow, N. Cell Culture: building a better matrix. Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).
  4. Hauser, C. A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials. Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).
  5. Teng, Y. D. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).
  6. Silva, G. A. Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers. Science. 303, 1352-1355 (2004).
  7. Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).
  8. Taraballi, F. Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures. Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).
  9. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).
  10. Zhang, S. Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment. Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).
  11. Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration. PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).
  12. Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro. Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).
  13. Ortinau, S. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).
  14. Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).
  15. Morgan, P. J. Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine. Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).
  16. Giese, A. K. Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells. BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).
  17. Schmöle, A. C. Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells. Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).
  18. PuraMatrix, B. D. Peptide Hydrogel. Guidelines for Use. Catalog No 354250, BD. (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

PuraMatrix III

相关文章