Drosophila 幼虫中评估热伤害感受的局部与整体方法

摘要

本文中，我们展示了用于研究热痛觉的研究方法 果蝇 幼虫。一种检测方法涉及对空间局限（局部）的热伤害感受器进行刺激^1,2 而第二种情况则涉及对大部分或全部此类神经元的全面（全局）激活³这些技术共同实现了对行为功能的可视化与定量分析 黑腹果蝇 伤害性感觉神经元

摘要

本文中，我们展示了用于研究热痛觉的研究方法 果蝇 幼虫。一种检测方法涉及对热伤害感受器进行空间限制性（局部）刺激^1,2 而第二种情况涉及大多数或全部此类神经元的全面（全局）激活³这些技术共同实现了对行为功能的可视化与定量分析 果蝇 伤害性感觉神经元

Drosophila 幼虫是一个成熟的模型系统，用于研究热伤害感受（thermal nociception），即对潜在有害温度的感官反应，这种反应在进化上在不同物种间高度保守^1,2。利用 Drosophila 进行此类研究的优势在于其神经系统的相对简单性，以及可用于解析潜在生物学分子基础的成熟遗传学技术^4-6。在 Drosophila 中，如同在所有后生动物中一样，对有害热刺激的反应通常表现为一种“伤害回避性”的厌恶性撤退反应⁷。此类刺激通过游离神经末梢或伤害感受器（nociceptors）被感知，机体反应的强度取决于接收有害刺激的伤害感受器数量⁸。在 Drosophila 中，是IV类树突分支感觉神经元负责检测有害的热刺激和机械刺激⁹，此外，这些神经元还具有最近发现的感光功能¹⁰。这些神经元在发育层面已被广泛研究，其树突在屏障性的表皮层上广泛分支，并与几乎所有表皮细胞形成接触^11,12。每个IV类神经元的单根轴突投射至中枢神经系统的腹神经索¹¹，在那里可能与投射至脑部的二级神经元相连接。

在基础条件下，伤害性感觉神经元不会放电，直到达到相对较高的阈值。本文所述的检测方法可使研究者量化基础行为反应，或推测组织损伤后继发的敏感化过程。每种检测方法均可引发对有害热刺激产生不同但相关的运动行为反应，并允许研究者观察和量化黑腹果蝇（Drosophila）幼虫热伤害感受的各个方面。这些检测可用于具有特定基因型的幼虫，或在可能影响伤害感受的不同环境条件下培养的幼虫。由于热伤害感受在物种间具有保守性，通过黑腹果蝇（Drosophila）进行的遗传学解析所得发现，将有助于增进我们对其他物种（包括脊椎动物）热伤害感受的理解。

方案

用于制备正常或UV致敏幼虫以进行两种热伤害感受实验的典型实验步骤流程如图1所示。

1. 幼虫的制备

1. 可直接测试所需基因型的雄性和雌性子代幼虫。或者，可设置遗传杂交以获得特定目标基因型的子代幼虫。在含有果蝇食物的培养瓶中进行杂交，每瓶使用20-30只处女雌蝇和15-20只雄蝇。
2. 产卵后5天，通过舀出软化的果蝇食物，并用流动水经630 μm（孔径）筛网轻轻过滤，收集并清洗早期三龄幼虫。将早期三龄幼虫（沿前后轴长约3-4 mm）转移至一小块湿润的食物垫上，以防止饥饿和干燥。若需检测伤害性敏感化，请继续执行后续步骤2.1–2.11；若幼虫需在无组织损伤条件下进行测试，则直接进入步骤3.1。

2. 麻醉与紫外照射

1. 构建一个乙醚麻醉室。
   1. 将一个1.5 ml微量离心管的底部切掉。
   2. 使用加热的金属 spatula 熔化微量离心管的切口边缘。
   3. 将一层细网固定在熔化的管口表面，并使其冷却固化。该乙醚麻醉室允许乙醚蒸气进入，同时防止幼虫逃逸。
2. 使用镊子或画笔轻轻将10只早期三龄幼虫放入自制的乙醚麻醉室内。
3. 将幼虫沿盖子内壁放置，然后盖上盖子。

注意：接下来的两个步骤应在通风橱中进行，因为乙醚是一种可能爆炸的化学物质，其蒸气不仅能使幼虫麻醉，也能使人类麻醉。

4. 将装有幼虫的乙醚麻醉室放入一个 Coplin 罐中，该罐内放置一个含有棉球的 10 ml 烧杯，棉球用约 1.5 ml 乙醚浸润。
5. 拧紧 Coplin 罐盖，使幼虫暴露于乙醚蒸气中 2 至 2.5 分钟。注意，过长的麻醉时间可能对幼虫行为或存活产生不利影响。
6. 麻醉完成后，将乙醚麻醉室从 Coplin 罐/烧杯中取出，在通风橱内静置数秒，使乙醚蒸气充分消散。此时可从通风橱转移回实验台继续操作。
7. 使用装有水的冲洗瓶，将幼虫从乙醚麻醉室中轻柔冲洗至一个小培养皿中。
8. 用镊子和 Kimwipe 纸轻轻吸干麻醉后的幼虫，并将其背侧朝上小心固定在一条双面胶带条上，该胶带条已粘附于一块 3 英寸 × 1 英寸的玻璃载玻片上。
9. 将载玻片置于紫外照射室的底部表面，以 20 mJ/cm² 的强度对幼虫进行 6 秒的紫外照射。
10. 将载玻片浸入水中，使幼虫轻柔地从双面胶带上漂浮脱落。
11. 使用镊子或画笔将照射后的幼虫轻柔转移至一个 15 × 45 mm 的一盎司玻璃培养瓶中，瓶内含约 1.0 ml 果蝇食物，让幼虫在 25 °C 或其他所需培养温度下恢复 8–24 小时不等，之后可重新收集用于热伤害感受测定。

3. 局部热探针检测法

我们使用由 Pro-Dev Engineering 公司定制制造的热探针（见材料表）向单个幼虫体节施加有害的热刺激。尽管该探针具有优化的设计特性（约 0.07 mm 的细小金属尖端）² 区域以及将设定温度精确维持在23 °C至65 °C之间的能力）原则上，任何带有细小尖端且可在长达20秒的时间内加热至特定温度的工具均可满足要求。该探针尖端用于刺激早期3^rd 四龄幼虫腹节A4背中线精确位置（参见 图2）。作为对这种热刺激的反应，幼虫通常会表现出厌恶性回撤行为，即侧向滚动超过360度。该行为不同于它们对无害的室温金属探针轻触刺激的反应，后者通常仅表现为运动活动的短暂暂停。¹³.

热探针实验方案：

1. 将热探针的温度预设至所需的目标值。
2. 使用画笔或镊子轻轻将单个幼虫转移至一个平坦的平台（我们通常使用从文件夹上剪下的小块乙烯基材料），以便后续进行刺激。在与热探针接触前，幼虫应被一层极薄的水膜覆盖。覆盖幼虫的水膜应尽可能少，但需完全覆盖幼虫，同时确保幼虫接触乙烯基时不会干燥。
3. 将探针尖端轻轻压在幼虫A4体节处，探针与幼虫表面呈约45°角，施加轻微压力（见图2）。压力应使幼虫表面产生轻微凹陷，通常足以抑制其运动。若幼虫继续移动，可略微增加压力，通常即可停止其运动。对于超出视野范围移动或无法在整个刺激过程中保持稳定探针接触直至出现反应或达到20秒截止时间的幼虫，不应记录其数据。
4. 持续刺激幼虫，直至其表现出逃避反应或达到20秒截止时间，以先发生者为准。有反应的幼虫通常首先表现出抬头和翘尾的初步行为，随后通常会进行至少360度的滚动逃避行为。仅将完整的360度滚动记为伤害性防御行为（初步的抬头或翘尾不计入）。
5. 一旦逃避行为开始，立即撤去探针接触，并记录逃避反应的潜伏期或反应时间。若在20秒内未观察到逃避行为，则该幼虫记为无反应者。有反应者可进一步分为两类：若逃避行为在5秒内出现，则该幼虫为快速反应者；若逃避行为出现在5至20秒之间，则该幼虫为慢速反应者（见Babcock, et al. 2009)¹中的图1。

4. 全局热板实验

热板实验旨在测量整个动物受到有害热刺激时黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的热伤害感受。将单个中期3^龄幼虫置于直径60 mm、高度15 mm的培养皿中80 μl水滴内——实验装置的示意图和照片见图3。然后将培养皿放置于一个固体加热块（称为“热板”）上。随着水滴温度升高，幼虫会表现出一系列五种刻板行为，我们将其命名为头部抽动、翻滚、鞭打、惊厥和麻痹。由于这些行为在一定程度上取决于热板的设定温度以及幼虫所处水滴的体积，本文提供了我们发现的最优条件（热板温度95 °C，水滴体积80 μl），在此条件下可观察到全部五种行为，且各行为之间的重叠最小。

热板实验方案：

1. 将光纤导光管放置到位，以确保幼虫观察区域具有充足且高对比度的照明。必要时可使用测试幼虫进行调整。光源功率应调至低档，以避免对受试幼虫产生环境热量影响。
2. 将加热块平面向上放入加热板中，并将加热板放置在显微镜底座上。将加热板调至“高”档，等待约15分钟使温度稳定，然后相应调节，使表面温度达到95 °C。
3. 用移液器量取80 μl蒸馏水，将水滴置于60 × 15 mm的聚苯乙烯培养皿中央。
4. 使用镊子轻轻放置一块干净的中段 3^rd 将龄期幼虫置于水滴中央。尽量以最小体积的水转移幼虫，使待加热的水滴体积尽可能接近原始的80 μl。
5. 将含有水滴和幼虫的培养皿轻轻放置在加热板的固体加热块上。迅速调整培养皿的位置，使整个幼虫和水滴均处于视野范围内。参见 图3及视频1-6.
6. 当培养皿放置到加热板的固体加热块上时立即启动计时器，并记录每种行为开始的时间。如有需要，也可对行为进行视频记录——参见 视频 1-5 以每种行为的代表性示例为准。使用 Leica 软件版本 3.7 进行视频录制，录制模式为“Continuous”，相机分辨率为 3 兆像素（使用 0.63 倍缩放，计算得到的图像分辨率为 10 μm/像素），帧率为 44.5 帧/秒。

5. 代表性结果

局部热探针检测法：

当幼虫接触到热探针时，通常会表现出抬起头部和尾部的初步行为。通常先看到头部抬起，随后尾部抬起。在出现这一初步行为数秒后，幼虫通常开始进行横向翻滚，我们称之为“厌恶性撤退行为”。出现初步行为或撤退行为的时间可能因温度或遗传背景的不同而有所差异。在我们的初步研究中，我们测量了在不同探针设定温度下表现出厌恶性撤退行为的幼虫百分比，发现48 °C是所有幼虫均快速响应（<5 s）的最低温度。在此，我们报告幼虫的热伤害感受反应存在上限（图4A）。当探针温度达到52 °C时，仍可观察到100%的幼虫快速响应。然而，在54 °C及更高温度下，90%或更多的幼虫即使在接触20 s后仍无反应。这些幼虫在20 s截止后仍继续移动。

如前所述¹，可在每个温度下绘制并统计比较回避行为的类别。由于这是一种行为学检测，不同幼虫之间以及不同操作者之间存在一定的变异性。为消除这一影响，我们通常每种测试条件下测量3组，每组30只幼虫。除了我们此前报道过的回避潜伏期的简单分类外，本文还报告了可进一步测量反应幅度（翻滚次数或处于厌恶性回避行为的时间）（见图4）。令人意外的是，输入温度与反应的强度之间似乎存在反向关系，因为较低的温度似乎会引发更多的翻滚次数（图4B）以及更长的厌恶性回避行为持续时间（数据未显示）。这可能表明，对有害温度的暴露持续时间可能是决定反应强度的主要因素。

热板实验：

将浸没在水中的幼虫转移至加热板后，可观察到五种刻板的运动行为。这些行为在视频中均有展示，并与未受热幼虫在水中的典型运动行为进行对比。每种行为出现的平均潜伏期如图5A所示，各潜伏期下测得的水滴温度平均值也一并展示。在本文所述的最佳检测条件下，表现出每种特定行为的幼虫比例介于77%至100%之间（图5B），尽管偶尔会出现翻滚和抽打行为缺失、重叠或顺序颠倒的情况。按时间顺序观察到的行为描述如下，可在视频中标注的相应时间点观看：

1. 无热刺激时的正常运动：伴随头部搜索动作的蠕动式移动。参见视频 6:27 处。
2. 头部抽打：幼虫头部快速向前或侧向摆动。该动作与其在水中正常的运动相似（见视频 1），但更为急促且持续时间更长。参见视频 6:40 处。
3. 翻滚：幼虫至少完成一次完整的侧向翻转（360°）。参见视频 6:50 处。此行为可发生多次，有时包含不完整的翻转。为便于行为评分，仅将完整的 360° 翻转计入统计。该行为与局部热探针刺激所引发的行为最为相似。
4. 鞭打：幼虫沿身体前后轴快速进行收缩-松弛运动，使头部极短暂地接近尾部。参见视频 7:11 处。鞭打行为常与翻滚行为连续发生或同时出现。
5. 惊厥：幼虫沿前后轴伸展，表现出高频的全身震颤行为，期间无明显弯曲。参见视频 7:25 处。
6. 麻痹：幼虫停止运动。部分幼虫表现为永久性静止，而另一些则随后出现低频脉冲式运动。参见视频 7:36 处。

这些数据表明，水滴的温度与幼虫/水滴整体加热后出现五种特征性行为的潜伏期之间存在高度相关性。

图1. 幼虫制备与检测实验步骤概要。在使用热探针或热板检测伤害感受之前，需从特定品系或遗传杂交中收集并清洗幼虫，去除食物残留。若需评估伤害性致敏（而非基础伤害感受），则在收集幼虫后，需进行乙醚麻醉（暴露于乙醚）、固定、紫外线照射，并在果蝇食物上恢复一段时间。收集后或恢复后的幼虫随后通过热探针（局部）或热板（整体）检测进行有害温度刺激测试。图中数字对应方法部分中描述相应步骤的章节。

图 2. 局部热探针实验装置示意图。热探针由温控单元控制，用于设定并维持探针温度。探针垂直于前后轴放置，并以与水平方向成 45° 角刺激幼虫。探针接触点位于腹部体节 A4，如图所示。操作者需以轻微压力保持接触，直至达到 20 秒截止时间或幼虫开始翻滚行为为止。当温度被感知为有害时，幼虫将表现出回避性撤退行为，特征为至少完成一次 360° 翻滚。翻滚次数可为单次或多次（见 图 4B）。

图 3. 热板实验装置示意图。（A）含有一个中龄3^rd幼虫、80 μl 水滴的 60 × 15 mm 培养皿的水平视图示意图。（B）通过显微镜观察，幼虫位于水滴中央的俯视示意图。（C）本实验所用工作站的水平视图照片。（D）通过显微镜观察幼虫的照片。

图 4. 利用热探针实验对行为反应进行量化。 （A）属于各类别（快速反应、慢速反应和无反应）的反应个体百分比随温度变化的曲线图。（B）在逐渐增强的有害温度（42 °C、44 °C、46 °C、48 °C、50 °C 和 52 °C）下，幼虫表现出厌恶性撤退行为的潜伏期与其滚动次数的关系图。

图 5. 热板实验：潜伏期与温度对行为的影响。 （A）在最佳条件下（热板表面温度为 95 °C，水滴体积为 80 μl）每种行为反应的潜伏期及平均水滴温度（n = 150）。注意每种行为均出现在特定的时间区间内。水滴温度通过将热电偶插入水滴顶部或底部进行测量（每个位置测量 10 滴），并取平均值。（B）在最佳实验条件下表现出每种行为反应的幼虫百分比。抽搐、强直和麻痹几乎在 100% 的情况下被观察到，而翻滚和抽打分别在 77% 和 80% 的情况下被观察到。在较低的表面温度设定点下，200 秒内未观察到强直和麻痹；而在较高的设定点下，翻滚和抽打可能被跳过或同时发生。n = 150。（C）在麻痹行为开始后仍能存活的幼虫百分比。将幼虫加热至开始出现麻痹后，转移至标准培养条件下恢复。对照组幼虫接受除加热以外的相同处理。在第 7 至 13 天量化蛹和可育成虫的形成情况。n = 120。

图6. 幼虫伤害性感觉神经元的失活会增加行为反应潜伏期. 不同基因型小鼠各项行为反应潜伏期的曲线图： w¹¹¹⁸，Gal4^109(2)80 = md-Gal4/+, UAS-Ork1.Δ-C/+, UAS-Ork1.Δ-NC/+, md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-C 和 md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC。md-Gal4 在四类多树突周围感觉神经元中驱动UAS调控的转基因表达； UAS-Ork1.Δ-C¹⁴ 表达一种修饰版本的 果蝇 开放整流K+通道，为突触传递所必需，且 UAS-Ork1.Δ-NC¹⁴ 表达该通道的一个进一步修饰版本，该版本不会干扰突触传递。请注意，仅含有这两个遗传元件的幼虫 md-Gal4 驱动程序⁶ 以及 UAS-Ork1.Δ-C 转基因动物在五种被观察行为中的四种表现出潜伏期延长（抽搐、翻滚、惊厥和麻痹）。还需注意，由于翻滚潜伏期增加，这些动物在翻滚前会出现抽打样动作。星号表示 p < 通过学生t检验，p值为0.05。每种基因型使用30条幼虫。

补充视频 1。 点击此处观看视频。

补充视频 2。 点击此处观看视频。

补充视频 3。 点击此处观看视频。

补充视频 4。 点击此处观看视频。

补充视频 5。 点击此处观看视频。

补充视频 6。 点击此处观看视频。

讨论

本文所述的实验可用于定性及定量评估不同基因型幼虫对有害热刺激的反应性。热探针实验的一个主要特点是，刺激仅作用于单一特定位置。这可能仅导致一小部分IV类神经元放电——即探针接触体节内的神经元，以及可能邻近体节中的神经元¹¹。由于刺激具有局部性，热探针实验模拟了感知局限于身体某一特定区域的有害刺激这一常见感觉体验——例如手接触热炉灶。热探针实验的一个缺点是存在一定的操作者间变异，这可能归因于三个因素：i）操作者将探针施加于幼虫时的压力大小，ii）探针在幼虫体表的位置相对于下方伤害感受神经元的精确程度，以及iii）探针接触幼虫体表时的确切角度。

我们先前报道了一种定量策略，可根据幼虫对特定温度的回缩潜伏期，将其分类为无应答者、慢应答者和快应答者¹。本文中，我们报道了幼虫对更高温度的应答性。有趣的是，我们发现幼虫的热伤害感受反应存在一个上限，该上限介于52至54 °C之间。这可能表明幼虫缺乏能够在高于52 °C的温度下激活的瞬时受体电位（TRP）通道。或者，这也可能提示，用于启动或执行运动反应的神经元或肌肉在产生厌恶性回缩反应之前即已受损。我们还报道了对回缩反应幅度的另一种分析方法——使用翻滚次数作为反应“强度”的指标。直观上，人们会预期这些参数随温度升高或刺激时间延长而增加。然而令人意外的是，我们发现事实并非如此。在有害温度范围的低端（42 °C）长时间受到刺激的幼虫，其翻滚次数和翻滚持续时间均多于在较高温度（48–52 °C）下受到刺激的幼虫。这表明，在有害温度范围内，决定反应幅度的主要因素是暴露持续时间。由于暴露于高度有害温度（48–52 °C）的幼虫平均反应非常迅速，因此它们表现出的翻滚次数少于在较低有害温度下长时间暴露的幼虫。本文所报道的反应幅度分析为不同基因型或环境干预之间的比较提供了另一个定量维度。

热板实验的一个主要特征是，它涉及对有害热刺激的全局暴露。因此，这种情形更类似于动物置身于一个加热的容器中，而不是触碰一个发热的炉灶。尽管尚不清楚幼虫在自然环境中何时会经历全局性的有害刺激，但在实验室中，这种全局暴露所引发的行为反应比局部刺激所观察到的更为复杂。热板实验的一个优势（其他研究者也已指出³）在于其操作者之间的变异性极小，因为该实验流程不包含对幼虫的触碰操作。唯一的显著变异似乎在于如何界定每种行为的起始时刻，而这一点可通过反复观察和熟悉来最小化。不同实验方法之间一个有趣的差异在于引发厌恶行为的温度阈值。在热板实验中，这些行为的起始温度明显低于热探针实验。使用热探针接触幼虫时所引发的初期行为（抬头和翘尾）可能与热板实验中约27 °C时观察到的头部摆动行为相对应。这种反应可能更多反映的是“不适感”而非“疼痛”。即使在较高温度（高达48 °C）下，我们在热探针实验中也未观察到与抽搐、惊厥和麻痹行为相对应的现象，这表明可能需要来自身体多个区域的感觉神经元同时达到一定的激活阈值，才能诱发这些行为。有趣的是，惊厥和麻痹行为在热板实验中出现的温度（约34–37 °C）低于热探针实验中观察到的伤害感受阈值的下限，这表明全局刺激可能整合了多个神经元的反应，而这些反应在局部热探针刺激下不足以引发行为。这些温度确实对幼虫具有伤害性，这一点得到了以下观察结果的支持：开始出现麻痹行为的幼虫若随后被转移至果蝇食物上恢复，大多数情况下无法存活（图5C）。进一步支持热板实验反映的是伤害感受反应的证据是：阻断已知伤害感受感觉神经元的突触传递会显著延长大多数观察到行为的潜伏期（图6）。值得注意的是，高温下的抽搐行为潜伏期并未延长，这表明该行为可能依赖于其他不表达md-Gal4的感觉神经元。

总之，两种实验均涉及将单个幼虫暴露于特定温度的有害热刺激下——局部实验中使用小型金属探针的加热尖端，整体实验中则将其浸入迅速升温的水滴中。对幼虫的行为反应进行观察 黑腹果蝇 具有不同遗传背景和/或暴露于不同环境条件（例如，有无组织损伤）的幼虫，均可通过这些检测方法进行研究和量化。最终，这些检测的结果将有助于我们更深入地理解控制伤害性感受的遗传网络 果蝇 及其他相关物种。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
热探针	Pro-Dev Engineering	按需定制	可根据要求提供联系方式
干浴孵育器	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	11-718	配备1个实心加热模块和1个带16 mm孔的加热模块
Leica DFC290 12 V/400 mA 彩色相机	徕卡显微系统（Leica Microsystems）	12730080	任何等效 相机均可使用。
Leica MZ6 体视显微镜	徕卡显微系统（Leica Microsystems）	MZ6 变倍镜体（光学支架）的部件号为 10445614
Schott Ace Modulamp 灯具	Schott AG	A20500
Schott 双蛇形管 23 英寸光纤导光臂	Schott AG	Schott A08575
温度控制单元	TSCI 公司	定制设备	可根据要求提供详细信息
蔡司 Stemi 2000 体视显微镜	卡尔·蔡司公司（Carl Zeiss, Inc.）	NT55-605	任何等效 显微镜均可使用。
镊子	精细科学工具公司（Fine Science Tools）	FS-1670
1 mm 网格筛网	Genesee Scientific	57-101
画笔	Blick 艺术材料公司	06762-1002
紫外交联仪	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	1199289
柯普林瓶（Coplin 瓶）	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	08-816
10 ml 烧杯	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	02-540C
乙醚	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	E138-500
35 × 10 mm 聚苯乙烯培养皿	BD Falcon	351008	我们尚未测试 其他替代培养皿。
玻璃显微镜载玻片	康宁公司（Corning）	26003
热电偶	欧米茄工程公司（Omega Engineering, Inc.）	HH802U
一段乙烯基材料	Office Depot	480009
微量离心管	Denville Scientific	C-2170