用于内皮角膜移植术的角膜供体组织制备

摘要

内皮角膜移植术是一种用于治疗后部角膜疾病的外科技术。采用机械微型角膜刀进行组织切削制备，可获得更薄、更对称的移植物，减少内皮细胞丢失，从而改善手术预后。组织切削可在角膜移植手术前于眼库中完成。

摘要

在过去十年中，角膜移植手术技术经历了革命性的变革^1,2。自问世以来，传统的全层角膜移植一直是因角膜疾病导致视力受限患者的复明治疗方法。但该方法存在一些缺点，包括术后高度散光、屈光结果不可预测以及对眼表的干扰。后弹力层剥离内皮角膜移植术（DSEK）的发展彻底改变了角膜内皮疾病的治疗方式；该手术仅移植角膜后基质层、后弹力层和内皮层。DSEK通过较小的切口完成，避免了“开放眼”手术所带来的出血或眼内容物脱出风险，降低了术后切口裂开的发生率，减少了屈光结果的不可预测性，并可能降低移植排斥反应的发生率^3-6。

最初，DSEK手术中供体角膜后板层的分离是手工完成的¹，导致移植片厚度不均，且在组织处理过程中容易损伤 delicate 的角膜内皮组织。为解决这些问题，发展出了自动板层分离技术（即后弹力层剥除自动内皮角膜移植术，DSAEK）。该技术采用与LASIK角膜瓣制作相同的机械微角膜刀设备，可在组织处理过程中最大限度减少角膜内皮细胞丢失，制备出厚度均匀且较薄的移植组织片。

多年来，眼库一直为手术移植提供全层角膜。2006年，眼库开始开发用于内皮角膜移植术的预切角膜组织制备方法。在角膜外科医生的参与下，眼库已建立起完善的操作规程，能够安全、有效地制备用于DSAEK手术的后板层角膜组织，该步骤可在术前于眼库内完成。研究表明，使用眼库预切角膜组织与由手术医生 intraoperatively 制备的供体组织，在组织质量⁷或患者术后效果^8,9方面均无显著差异。对大多数角膜外科医生而言，预切DSAEK角膜组织的可获得性节省了手术时间和成本¹⁰，并减轻了在手术室内进行供体角膜剥离操作的压力。正因为眼库能够及时提供高质量的后板层角膜组织，DSAEK已成为角膜内皮疾病外科治疗的标准方案。

我们所描述的步骤是在眼库中为DSAEK手术准备角膜后板层组织（图1）。

方案

1. 准备：无菌技术¹¹

1. 开启层流罩（Laminar Flow Hood, LFH）。
2. 打开氮气控制单元。确保控制台与氮气罐之间的软管已连接。打开气体，调节压力至50-60 PSI。设备上的涡轮压力应显示为3.3至3.4巴（Bars）。
3. 按下测试按钮。大气压力读数应在700左右，泵1和泵2的读数应低于200。测试完成后设备会发出蜂鸣声。根据需要佩戴面罩、护目镜和头帽。洗手后戴上非无菌手套。将无菌套件放入层流罩内，并打开包装以建立无菌区域。
4. 在已建立的无菌区域旁放置一个无菌药杯和一个装有无菌纱布的无菌塑料盆。将无菌异丙醇倒入药杯中。用含酒精的棉片/垫擦拭角膜测厚探头，并将探头尖端朝下放入药杯中。探头尖端需在异丙醇中浸泡10分钟。浸泡10分钟后，用预充式注射器中的无菌水冲洗探头尖端以去除酒精，然后将探头放入塑料盆中。
5. 采用无菌技术，将无菌物品（刀片、无菌手套和角膜观察室）打开并放置到无菌区域上，除非这些物品已是预包装套件的一部分。
6. 取出保存液中的角膜组织，并置于层流罩内（图2）。
7. 打开小瓶，将瓶盖丢弃至适当的生物危害容器中。脱去非无菌手套并丢弃。
8. 戴上无菌手套。将预包装的塑料盆放置在无菌区域一侧靠近测厚仪的位置。将输液管连接至旋塞阀，并将输液管的穿刺端置于层流罩外，固定输液管，防止罩外部分重新进入层流罩或接触无菌区域。
9. 进行角膜组织转移。将组织及其保存液从原小瓶中一次性轻柔倾倒至无菌观察室中，确保内皮面朝上。盖上观察室盖子。将含有组织和保存液的观察室保持在无菌区域内。将空小瓶移出层流罩。脱去无菌手套并丢弃。
10. 用输液管穿刺平衡盐溶液（BSS）瓶。将无菌BSS瓶悬挂在距离操作台面约四英尺高的位置。
11. 打开两副无菌手套和无菌手术衣连同毛巾。
12. 执行六分钟外科洗手，并擦干双手。
13. 穿上无菌手术衣，然后戴上两副无菌手套。
14. 打开器械盒，将内容物放置于无菌区域上。
15. 向金属盆或药杯中倒入10-20 cc的BSS溶液。用BSS溶液填充无菌移液管。将旋塞阀和输液管连接至前房灌注口，并用BSS冲洗，使少量液体可见于活塞顶部。
16. 将人工前房装置置于层流罩内的纱布上。通过逆时针旋转移植物紧固环来降低活塞。

2. 实验步骤

1. 使用镊子轻轻夹住角膜的巩膜缘。打开旋塞，用BSS冲洗系统，同时小心地将角膜内皮面朝下对准活塞顶部居中放置。若角膜下方可见气泡，继续灌注BSS并轻微移动角膜以排除气泡。气泡排除后停止灌注。确保角膜位于活塞中央（图3a）。
2. 将前房盖板置于底座锁环上，使盖板的卡舌插入底座的空隙中。顺时针旋转盖板15°，将其锁定在底座上。升起活塞并完全拧紧（图3b）。
3. 用无菌戴手套的手指轻触角膜顶部，确认压力足够以进行操作。
4. 将测厚探头置于角膜表面测量厚度（图4），标准差必须小于10。若不符合要求，需重新测量。使用未参与测厚的无菌戴手套的手，将涡轮软管递给完成测厚的手，并将涡轮软管旋入控制单元。请协助的技术人员记录测厚结果。
5. 脱去污染的手套。
6. 使用无菌标记笔从角膜缘向角膜中心画一条4 mm的线（若术者偏好不标记则可省略）。用移液管在角膜表面滴加5滴BSS。
7. 除非术者有特殊指示，若切割前测得的角膜厚度小于600 μm，则使用300 μm切削头；若大于600 μm，则使用350 μm切削头。
8. 将刀片有螺纹的一侧朝向操作者，数字朝上，尖端优先插入微型角膜刀头右侧，注意避免接触刀片。
9. 双手握住刀头两侧，将其旋紧至涡轮上。用手拧紧人工前房。
10. 将涡轮旋紧至涡轮软管上。
11. 踩一次真空踏板，将切削头浸入无菌水中，启动涡轮脉冲5秒，测试刀片振荡功能。
12. 重新拧紧活塞。
13. 将微型角膜刀通过安装柱放置在底座上，并置于五点钟位置。踩下并保持涡轮踏板，使刀片开始振荡（图5a）。
14. 用拇指和食指握住微型角膜刀，位置介于底座与涡轮顶部之间。转动腕部，平稳均匀地完成角膜切割。松开涡轮踏板，将微型角膜刀垂直提起。踩下真空踏板关闭真空（图5b）。
15. 戴上无菌手套，在移除角膜瓣后重新检测角膜厚度：将探头置于角膜表面获取第二次测厚值，注意此时组织极薄且易受损。检测后脱去污染手套。请协助的技术人员记录第二次测厚结果。
16. 根据术者要求，使用无菌标记笔在人工前房内残留基质床的中周缘处做标记。在残留基质床上滴加数滴无菌BSS。
17. 从微型角膜刀上取下前部角膜瓣（图6），在将角膜从人工前房取出前，将其重新覆盖于角膜表面。如有必要，应利用周边标记对准角膜瓣，使其居中复位。使用棉签尖端轻轻调整角膜瓣位置。使用新的棉签尖端吸除角膜瓣下方的BSS。
18. 打开旋塞，将前房倒置，缓慢降低活塞，防止角膜变形。解锁底座，利用BSS流动产生的压力使人工前房杯体脱离底座。使用镊子在9、12和3点钟位置轻轻牵拉角膜边缘，使其与杯体分离。一旦松动，用镊子在12点钟位置将角膜取出。将角膜放入观察室，内皮面朝上（图7）。盖上观察室盖子。脱去无菌手套。
19. 拧紧观察室盖子。
20. 对角膜进行切割后的裂隙灯评估和角膜内皮显微镜检查，并记录结果。
21. 将前房（或观察室）放入冰箱的指定区域。
22. 包装后运送至术者处（图8）。

3. 代表性结果

使用机械微型角膜刀对供体角膜进行适当的机械分离，可获得表面光滑、厚度均匀的板层角膜供体组织。这一结果可通过角膜横截面的光学相干断层扫描（OCT）图像显示（图9）。最终的后部角膜组织应具有足够的厚度，可通过角膜测厚仪进行测量。在过去的6个月中，密歇根眼库的数据显示，供体角膜处理前的平均厚度为558微米，处理后后部角膜组织的平均厚度为158微米。87%的微型角膜刀分离供体组织厚度介于100至200微米之间，10.9%的组织厚度>200微米，2.1%的组织厚度<100微米。

后部角膜组织必须保持较高的内皮细胞密度（ECD），以向移植受体提供更好的内皮功能。可通过角膜内皮显微镜检查测量 ECD。在过去 6 个月中，密歇根眼库判定适用于内皮角膜移植术的所有角膜组织，其 ECD 均 >2200 个细胞/mm²。99% 的预切 DSAEK 组织在处理后的 ECD >2400 个细胞/mm²，其中 19% 的 ECD >3000 个细胞/mm²。处理前后 ECD 的平均变化极小，仅为 1.2%（p=0.0003，配对双尾 t 检验）。手术过程中可能出现的并发症包括压力丧失、不对称剥离以及明显的组织压痕（导致角膜内皮细胞丢失）。不当的剥离还可能导致组织穿孔。

图1. 角膜内皮移植术中供体角膜组织制备的整体方案。图1a至图1e为供体角膜制备过程的横截面示意图。图1f至图1i为DSAEK手术过程中受体角膜的横截面示意图。

1. 将供体角膜安装到人工前房，并用微型角膜刀头进行分离。
2. 组织分离后，两层角膜基质层彼此分开，但前层（角膜瓣）被重新放置于剩余的角膜床之上，以便运输至手术医生。
3. 在手术室中，医生使用环钻垂直切穿受体角膜中央区域的前层和后层。
4. 环钻切割后，将供体角膜的周边部分从手术区域移除。
5. 用刮匙轻轻将后层从其前层上分离。供体角膜后层（DSAEK 组织）用于替换受体角膜的病变部分（1i）。
6. 患者存在需要被切除的病变角膜后层。
7. 使用眼内器械（反向 Sinsky 钩）在病损角膜上以较大直径画出环形标记。
8. 完成角膜标记后，移除角膜后部的膜状结构。
9. 将供体角膜后层（DSAEK 组织）植入受体眼内。

图 2. 保存液中的角膜组织。 角膜组织在从供体获取后置于保存液中。

图3. 人工前房上的角膜组织。

1. 在使用基底锁定环固定或进行组织切开之前，将角膜组织安装到人工前房上。
2. 将角膜组织安装到人工前房上，并用基底锁定环密封组织。

图4. 角膜组织厚度检测。 使用超声波角膜测厚探头在角膜表面检测角膜厚度。

图 5. 角膜组织解剖。

1. 将角膜刀片安装在底座的固定柱上，并置于五点钟位置。
2. 通过角膜推进角膜刀，进行板层分离。

图6. 角膜剥离后的前部角膜瓣。 微角膜刀剥离完成后，前部角膜瓣已完全游离。

图7. 观察室中的离体角膜。 完成解剖后，将角膜放回观察室中以进行转运。

图 8. 用于运输的角膜包装。 将观察室中的角膜妥善包装，以便运输至外科医生处。

图 9. 角膜的光学相干断层扫描（OCT）表现。 最终分离角膜的OCT横截面图像显示，角膜被分为两半。如箭头所示，分界面比周围组织具有更强的反射性。

讨论

角膜最内层的内皮层通过维持角膜脱水状态来保证角膜的光学透明性。多种疾病状态会直接影响角膜内皮的健康与活性，包括营养不良、感染、炎症过程及退行性病变。直到最近，替换病变角膜内皮的角膜移植仍需进行全层角膜移植。在过去十年中，通过部分厚度角膜移植（如 DSAEK 手术）实现对后部角膜的靶向替换，已能够以更短的恢复时间达到相同效果。无论采用何种技术，移植组织都必须保留健康的角膜内皮，以维持移植角膜的光学透明性；因此，所有组织处理技术均包含额外步骤以保护角膜内皮。

目前，自动角膜刀切削是内皮角膜移植术中角膜组织制备的标准方法。与手工分离相比，使用角膜刀可降低供体组织穿孔的风险，并加快视力恢复⁵。在DSEAK技术最初引入时，部分外科医生购买了角膜刀设备，并在手术开始时于手术室内进行供体板层角膜的分离。如果组织制备失败，手术将不得不取消，给患者和医生带来不便和经济损失。自2006年起，眼库开始在手术前一天于眼库实验室的受控条件下进行“异地”角膜刀切削¹²。在此环境下若组织制备失败，仍有时间使用新鲜组织重新进行切削。

使用角膜刀对供体角膜后板层组织进行分离时，需要采用轻柔且精确的技术，以尽量减少并发症的发生。角膜必须轻柔地放置在人工前房（AAC）上，以避免对脆弱的内皮细胞造成任何损伤。一旦角膜被安装并准确对位在人工前房上，必须放置并调整锁定环，以形成紧密密封，维持前房内的高压力，从而降低角膜刀分离过程中组织塌陷的风险。为确保切削均匀，应以恒定且平稳的方式旋转角膜刀头。分离完成后，仍需小心处理组织，以最大限度减少内皮细胞的损伤。此外，必须确认板层切口居中且完整，以确保后板层组织适合用于手术¹³。

角膜供体穿孔是该手术令人担忧的并发症，随着操作经验的积累，其发生率会降低。若在使用角膜切割器过程中反复发生穿孔，需仔细检查手术中的多个步骤。角膜必须正确安装并准确对齐于自动角膜切割器（AAC）上。在进行角膜切割器切削前，应确保形成紧密密封并达到足够高的压力，并在整个手术过程中维持该状态。有时巩膜边缘残留有结膜组织，安装前需将其解剖清除。角膜切割器刀片应保持锋利，无任何缺口。应根据估计的角膜厚度选择合适厚度的角膜切割器刀头。在切削前，必须确认角膜切割器刀头已正常振荡。若该技术仍存在问题，应联系角膜切割器供应商，以确认所有设备均正常工作。

即使操作完全正确，该技术仍存在一些局限性。可用于切割角膜组织的微型角膜刀刀头具有不同的切削厚度规格；然而，微型角膜刀刀头与最终组织厚度之间的关系并不精确，同一刀头可能产生较宽范围的最终组织厚度⁷。此外，该技术存在显著的学习曲线，初学者在制备过程中出现并发症的频率更高。在眼库环境中进行板层分离，可由每天多次执行该操作的训练有素的技术人员完成，从而优化其技术，最大限度地减少因经验不足导致的并发症。

针对内皮角膜移植术中使用角膜板层切开刀辅助角膜剥离的技术，存在多种改良方法。一些操作者倾向于在人工前房的角膜植片下方使用粘弹性物质或角膜保存液，而非平衡盐溶液，以期对角膜内皮提供更好的保护。此外，在确定角膜板层切开刀切口起始位置的方法上也存在差异。不同的眼库和角膜外科医生可能对如何标记角膜以识别前部角膜帽或后部角膜板层的方向有各自特定的偏好。需要注意的是，有多个制造商生产与本方案所用设备相似的仪器，因此无论使用何种设备，均应遵循相应生产厂商提供的具体操作说明。

可靠的眼库为DSAEK手术制备分离的角膜组织，已促进了这种相对较新的外科技术被广泛接受。当外科医生对眼库完成角膜移植的“第一步”——即组织制备——建立起信心后，DSAEK的许多实际限制得以缓解。眼库现已能够稳定地满足对加工组织的需求，安全、有效且及时地供应供体角膜组织。高质量的DSAEK角膜组织如今可提前订购，手术室占用时间和组织制备相关并发症均已减少^{9, 14-15}。

本方案从眼库对角膜供体组织进行处理的角度，描述了DSAEK移植物的制备方法；然而，该技术同样可直接适用于希望自行制备板层角膜供体组织的外科医生，以及从事板层角膜移植相关实验室或临床研究的研究人员。

角膜板层制备的未来发展方向包括使用飞秒激光进行组织处理、制备“超薄”DSAEK角膜组织，或为后弹力层内皮角膜移植术（DMEK）手术制备角膜内皮卷。内皮角膜移植术是一个不断发展的外科领域，随着手术技术的优化，眼库与角膜外科医生之间的共生关系将持续演变。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微角膜刀	Moria	1021174
人工前房基座	Moria	19161-562
人工前房盖	Moria	19172-220
显微角膜刀头 300	Moria	O304
显微角膜刀头 350	Moria	N791
控制台	Moria	19360-3482