本文描述了一种用于实时筛选与G蛋白门控内向整流K+（GIRK）通道相互作用药物的检测方法。该检测技术利用对膜电位敏感的荧光染料来测量GIRK通道的活性。该方法可适用于多种细胞系。
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摘要
摘要
G蛋白门控内向整流K+（GIRK）通道作为多种激素和神经递质的细胞内介质，在脑、心脏、骨骼肌和内分泌组织中均有表达1,2。当配体（神经递质、激素、药物等）与细胞膜上的G蛋白偶联受体（GPCRs）结合后，可激活GIRK通道。这种结合会激活G蛋白（Gi和Go），后者继而结合并激活GIRK通道。通道开放后，允许K+外流，使静息膜电位变得更负。因此，神经元中GIRK通道的激活可减少自发动作电位的产生，并抑制兴奋性神经递质的释放。在心脏中，GIRK通道的激活会抑制起搏活性，从而减慢心率。
GIRK 通道是开发治疗神经病理性疼痛、药物成瘾、心律失常及其他疾病新药的潜在靶点3。然而，这些通道的药理学特性在很大程度上仍未被充分研究。尽管包括抗心律失常药、抗精神病药和抗抑郁药在内的多种药物均可阻断 GIRK 通道，但这种抑制作用缺乏选择性，且通常在相对较高的药物浓度下才会发生3。
本文介绍一种用于筛选GIRK通道新型调节剂的实时筛选实验方法。在该实验中，表达GIRK通道的神经AtT20细胞被加载膜电位敏感的荧光染料，例如双(1,3-二丁基巴比妥酸)三甲川基氧化物[DiBAC4(3)]或HLB 021-152（图1）。染料分子被细胞摄取后会表现出强烈的荧光（图1）。当细胞经G蛋白偶联受体（GPCR）配体处理后，可激活GIRK通道开放。由此引发的K+外流使细胞膜电位变得更负，导致荧光信号降低（图1）。因此，可通过荧光酶标仪检测能够调节GIRK通道介导的K+外流的药物。与其它离子通道筛选方法（如原子吸收光谱法4或放射性示踪剂分析5）不同，GIRK通道荧光检测法提供了一种快速、实时且成本低廉的筛选流程。
方案
1. 细胞的制备
- 在添加了10%马血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养垂体AtT20细胞，并将细胞培养物置于37 °C、含5% CO2的湿化环境中维持培养。
- 每5至7天采用标准的胰蛋白酶消化法传代细胞，以维持培养。
- 用50 μL多聚-L-赖氨酸包被黑色、透明底的96孔板各孔，然后将各孔置于培养箱中孵育30分钟使其干燥。
- 将细胞以每孔30,000个细胞的密度接种于含200 μL培养基的96孔板中，并将细胞在培养箱中孵育3至4天。
- 使用一套吸液装置（由一个带塞的4升玻璃瓶组成，一端连接真空泵，另一端连接200 μL移液枪头），缓慢吸除细胞单层上的培养基。
- 用200 μL正常缓冲液（132 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、5 mM葡萄糖、5 mM HEPES，用NaOH调节pH至7.4）洗涤细胞。
- 向每孔加入含膜电位敏感性染料（MPD）DiBAC4(3) 或 HLB 021-152（5 μM）的缓冲液200 μL，并在37 °C孵育细胞40分钟。
2. 测试化合物的制备与细胞处理
- 使用 Versette（ThermoFisher）自动化液体处理系统，从化合物库（96 孔板格式）中制备待测化合物（储备液 = DMSO 中 10 mM）的系列稀释液。
- 将含有 AtT20 细胞的 96 孔板从培养箱中取出，使其恢复至室温。吸除旧的缓冲液，并向细胞中加入含有 MPD 的新鲜缓冲液溶液。
- 使用液体处理系统，将不同浓度（10 nM 至 10 μM）的待测化合物（2 至 20 μL）以及对照溶液（0.1% DMSO）（溶于含 MPD 的缓冲液中）加入含细胞的 96 孔板中。
- 在进行荧光检测前，将细胞与待测化合物共同孵育 5 分钟。
3. GIRK 通道的激活、荧光检测与分析
- 将96孔板插入Biotek Synergy2荧光酶标仪中，在激发波长520 nm和发射波长560 nm的条件下测定荧光背景信号。
- 使用Synergy2注射系统向各孔中加入GPCR配体（生长抑素 = 200 nM 或卡巴胆碱 = 10 μM）或对照溶液（仅缓冲液）（20 μL）（总体积 = 220 μL），以激活GIRK通道。在300秒的采样时间内，每隔10秒采集一次数据，激发波长和发射波长分别为520 nm和560 nm。
- 使用Biotek Gen5软件获取荧光变化的时间进程和峰值幅度，并将数据导出至Excel进行进一步分析。
- 计算Z'因子以评估实验的可靠性。用于Z'因子测定的孔板包含各两行的阳性对照（GPCR配体）和阴性对照（仅缓冲液）。Z'因子定义为：Z' = 1 - (3σP + 3σN) / | μP - μN |，其中μP 和 μN 分别为阳性对照和阴性对照信号的均值，σP 和 σN 分别为阳性对照和阴性对照信号的标准差6。Z'因子在0.5至1.0范围内表明实验质量优良6。Z'因子低于0.5的孔板将被排除在分析之外。
- 对能够调节荧光信号的化合物，在存在Ba2+或蜂毒抑素-Q（tertiapin-Q）的情况下重新进行测试，以确认其对内向整流K+通道的特异性。
4. 代表性结果
使用GIRK通道检测法测得的荧光信号示例如图2所示。向AtT20细胞中加入GPCR配体生长抑素（200 nM）后，HLB 021-152荧光信号迅速出现随时间依赖性的下降（图2）。相比之下，加入对照溶液仅引起荧光信号瞬时轻微上升，随后随时间恢复至基线水平（图2）。对加入对照溶液和生长抑素溶液的96孔板中荧光峰值进行比较，得到的Z'因子范围为0.5至0.7。为进一步定量分析，将生长抑素记录信号减去对照记录信号，得到生长抑素敏感性信号并进行分析（图2）。
该检测方法可用于快速鉴定调节GIRK通道的药物。例如，抑制GIRK通道的药物可通过阻止细胞内K+外流，从而减弱G蛋白偶联受体（GPCR）配体介导的荧光降低。如图3所示，用tertiapin-Q（一种可阻断GIRK通道的毒素7）处理细胞后，可抑制生长抑素介导的荧光变化。丙苯酮（propafenone）是一种在心脏中阻断GIRK通道的抗心律失常药物8，同样抑制了荧光信号的变化（图4）。该检测方法也可能适用于筛选GIRK通道的激活剂。然而，与对照溶液相比，加入GIRK通道激活剂乙醇（100 和 200 mM）2,3后，荧光信号未发生显著变化（p > 0.5）。
图 1. GIRK 通道荧光检测实验设计。AtT20 细胞在含有膜电位敏感型荧光染料（D）的缓冲液中孵育。染料分子进入细胞后，与细胞内蛋白结合并产生荧光（上图）。生长抑素（Som）与其 G 蛋白偶联受体（GPCR）结合后，激活抑制性 G 蛋白（Gi），从而激活 GIRK 通道（下图）。随后细胞内 K+ 外流，导致膜电位变得更负，染料分子随之离开细胞。因此，荧光信号减弱（下图）。
图2. 在AtT20细胞中加入生长抑素或对照溶液后，随时间变化测得的HLB 021-152荧光信号的代表性结果。荧光强度比值（F/FO）通过将加入生长抑素（或对照溶液）后的信号（F）除以加药前测得的基线信号（FO）计算得出。每个数据点代表5–6个孔的平均值±标准误。在时间零点（↓）加入生长抑素或对照溶液。加入对照溶液导致荧光信号出现轻微的短暂升高，此现象由溶液注入引起的温度变化所致。
图3. 使用 tertiapin-Q（500 nM）处理 AtT20 细胞可通过结合并阻断 GIRK 通道，抑制生长抑素介导的荧光信号下降。每个数据点代表 4–6 个孔的平均值 ± 标准误。在时间零点（↓）加入生长抑素。
图 4. 用丙吡胺（20 μM）处理 AtT20 细胞也能抑制生长抑素介导的荧光信号降低。每个数据点代表 5–6 个孔的平均值 ± 标准误。在时间零点（↓）加入生长抑素。
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讨论
尽管膜电位敏感型荧光染料已被用于筛选调节离子通道的药物9,10，但本文首次报道了其在神经元GIRK通道药物发现中的应用。本文所介绍的GIRK通道荧光检测法为配体门控K+通道的筛选提供了一种快速、可靠且可实时监测的方法。该检测方法可适用于多种细胞类型，包括表达外源性重组GIRK通道的永生化细胞系（如HEK293、CHO等）11，或表达内源性通道的克隆细胞系（如AtT20、PC-12）。此外，该方法还可调整用于胚胎干细胞及原代细胞培养中的药物筛选。在使用AtT20细胞时，该方法还具有额外优势，即可同时研究多种G蛋白偶联受体配体（如生长抑素和卡巴胆碱）对GIRK通道的作用。与所有荧光检测方法一样，必须进行对照实验，以排除化合物自身荧光造成的假象，并识别化合物与染料分子直接相互作用所导致的误差。还应考虑其他替代方法，例如铊离子内流检测法11和自动化膜片钳技术12。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到美国公共卫生署资助项目 NS-071530 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| 马血清 | Invitrogen | 16050-114 | |
| 96孔板 | Corning | 3603 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| 生长抑素 | Sigma-Aldrich | S9129 | |
| 卡巴胆碱 | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| HLB 021-152 | AnaSpec | 89300 | |
| Versette 自动液体处理系统 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 650-01 | |
| Synergy2 荧光酶标仪 | BioTek | ||
| Gen5 分析软件 | BioTek | ||
| 表1. 特定试剂与仪器列表。 |
参考文献
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重印与许可
