演示一种快速定量检测低分子量肝素依诺肝素对血液凝固抑制作用的方法。通过肝素酶消化去除依诺肝素的影响，从而评估其作用贡献。该检测方法的更详细描述见于我们已发表的论文1。该检测仍需临床验证。
本文内容
摘要
摘要
目前需要一种临床检测方法，用于确定患者血液中低分子量肝素（LMWH）依诺肝素抗凝作用的程度。在某些紧急临床情况下，若能快速获得这一信息将尤为重要。本检测方法旨在实现这一目标。我们仅对加入已知浓度依诺肝素的人血样本进行了检测。本方法的核心在于通过肝素酶将患者血液样本中的依诺肝素完全降解并使其失活，从而定量评估其抗凝效力。采集两份血液样本，分别置于加入依诺肝素的真空采血管（Becton-Dickenson；美国新泽西州富兰克林湖）中：其中一份样本在37 °C条件下经肝素酶消化5分钟，另一份则代表患者的基础抗凝状态。通过比较肝素酶处理样本相对于基础状态的凝血时间缩短百分比，即可得出依诺肝素的抗凝贡献。我们使用便携式、电池供电的Hemochron 801仪器（International Technidyne Corp.，美国新泽西州爱迪生）测量凝血时间。该仪器具有两个恒温控制（37 °C）的检测管孔。我们在仪器制造商提供的两种不同类型的检测 cartridge 中进行检测。其中一种 cartridge 经过改良以提高其灵敏度：通过大量蒸馏水冲洗去除FTK-ACT cartridge 中的高岭土，仅保留试管的玻璃表面及可能存在的检测磁珠作为激活物。我们将此称为最小激活检测（MAA）。我们及其他研究者已对最小激活检测的应用进行了研究2-4。另一种被研究的 cartridge 为活化部分凝血活酶时间（aPTT）检测 cartridge（A104），直接按制造商提供的方式使用。仪器的恒温孔同时用于肝素酶消化和凝血检测。该检测可在10分钟内完成。在典型的临床浓度范围内，MAA检测在依诺肝素经肝素酶消化后显示出明显的凝血时间变化。当每毫升血液样本中含有0.2抗Xa国际单位（I.U.）的依诺肝素时，肝素酶消化使凝血时间平均缩短9.8%（20.4秒）；当依诺肝素浓度为1.0 I.U./mL时，凝血时间缩短41.4%（148.8秒）。本报告仅介绍该检测方法的实验应用，其在临床环境中的实际价值仍有待进一步验证。
方案
1. 肝素酶的重悬
- 冻干肝素酶I可从商业途径获得（Siemens，美国特拉华州纽瓦克，DadeHepzyme货号B4240-10），每瓶含有1 μg纯化蛋白。将该蛋白溶解于0.25 ml生理盐水（0.9% NaCl）中。
2. 血液样本的采集
- 使用真空采血管采集两份血液样本，分别收集至含有枸橼酸钠（0.3 ml 0.109 M；3.2%）缓冲液的Vacutainer管（Becton-Dickinson；Franklin Lakes, NJ）中；两支采血管均预先加入已知浓度的依诺肝素；采集的血液体积为2.7 ml，总体积为3.0 ml。
3. 肝素酶消化
- 将肝素酶小瓶中可吸入注射器的全部内容物（约 0.2 ml；小瓶总量的 80%；含 0.8 μg 蛋白质）转移至一个 Vacutainer 管中；在第二个管中加入 0.2 ml 生理盐水（0.9% NaCl），作为消除依诺肝素作用前的基线状态对照。
- 将两个 Vacutainer 管均置于 Hemochron 仪器的恒温孔中，孵育 5 分钟。（我们先前已发表的研究证实，使用肝素酶消化 5 分钟的时间是充分的。1）
4. 凝血检测
- 肝素酶孵育结束后，将2.0 ml血液转移至检测 cartridge 中。对于MAA管，其预先装有0.1 ml 250 mM CaCl2，以启动凝血过程。商用aPTT检测 cartridge（A104）设计用于启动已采集至含柠檬酸钠抗凝剂的真空采血管中的全血的凝固反应。
- Hemochron仪器会提示血液凝固完成，并以秒为单位记录凝固时间。肝素酶处理样本与基线样本之间的凝固时间差值，除以基线样本的凝固时间，即得到因依诺肝素消除所导致的凝固时间百分比下降值。如下文所述，凝固时间百分比下降值与添加了已知浓度依诺肝素的全血样本中依诺肝素浓度之间呈现出高度线性相关，且该值与通过显色法测定抗Xa活性所得到的依诺肝素浓度测量值之间也具有良好的相关性。依诺肝素浓度的抗Xa活性检测采用商用试剂盒进行两步显色法检测（BIOPHEN；Aniara，Mason，OH）。
结果
图1展示了在使用肝素酶消除依诺肝素后，一系列依诺肝素加标浓度（0.2、0.4 和 1.0 anti-Xa IU/mL）下凝固时间减少百分比的结果。图中同时呈现了MAA和aPTT检测盒的结果。各图横坐标还包含了通过显色法测定抗Xa活性所得的依诺肝素测量浓度。
图2展示了相同数据的曲线图，即凝血时间的百分比减少值相对于抗Xa活性的显色测定值。
在所有四个关系中均发现了具有高度统计学显著性的强线性相关性。
图1. 基于加入肝素酶后凝血时间百分比变化（缩短）对添加依诺肝素的全血样本进行床旁检测，评估依诺肝素对凝血时间的影响。横坐标显示添加至全血中的依诺肝素浓度及测得的抗Xa血浆浓度（均值 ± 标准误，括号内）。所有凝血时间的百分比变化均以均值和标准误表示，并附以凝血时间平均缩短的秒数。同一患者的数据显示通过虚线连接。图A（MAA结果）中标有星号的四位患者数据与图B（aPTT检测）中的四位患者数据相同。所有结果均为单次测定值。与MAA和aPTT检测的相关性分析所得Pearson相关系数分别为 r = 0.869（p = 1.9 × 10-5）和 r = 0.916（p = 2.8 × 10-5）。经Inchiosa et al.1许可转载
图2. 将床旁检测中凝血时间的百分比变化（见图1A和1B）与血浆抗Xa因子浓度进行对比作图。A，MAA检测结果；B，aPTT检测结果。所有数据均来自单次凝血时间检测和单次抗Xa因子浓度测定。MAA检测和aPTT检测的相关性皮尔逊相关系数分别为 r = 0.910（p = 2.5 × 10-6）和 r = 0.922（p = 2.0 × 10-5）。经Inchiosa et al.1许可转载。
讨论
该依诺肝素疗效检测方法可作为确定实施有出血或血肿风险的侵入性操作相对安全性的关键选择之一，尤其在考虑进行硬膜外注射时具有重要意义。大多数指南建议在注射依诺肝素后等待12小时再开始侵入性操作。5 肾功能损害、肥胖和妊娠可能影响依诺肝素的剂量需求。6,7 由于该检测可在10分钟内完成，因此也可在诊所或医生办公室中使用，为存在静脉血栓栓塞风险的患者提供抗凝是否充分的信息，并根据需要立即调整用药剂量。
可通过显色法测定依诺肝素对凝血因子Xa活性抑制程度，从而检测其在血浆中的浓度。然而，该方法仅能反映其浓度，而无法特异性地反映其抗凝疗效，后者在不同个体间存在显著差异。6-8
我们的研究仅使用依诺肝素进行。然而，可以预见该检测方法也可适用于任何可被肝素酶I降解的低分子量肝素（LMWH）。目前已知达肝素、那屈肝素和亭扎肝素即属于此类情况9-11。本检测方法的设计基于Hemochron凝血时间测定仪的特性。该仪器相对便宜；此外，完成一名患者检测所需的 disposable 血液采集管、肝素酶安瓿及检测试剂盒的成本约为15美元。因此，该方法预期适用于多种临床环境下抗凝状态的监测。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
研究仅由部门和机构资源提供支持。凝血检测仪器（Hemochron 801）由制造商无偿提供使用，检测试剂盒以市售价格购得。视频中的引言图示改编自 Sanderink。 等12 视频中的第二幅图（肝素酶消化时间进程）经Inchiosa许可后复制 等1
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Hepzyme | Siemens AG | B4240 | 肝素酶 I |
| "MAA" 羧酸酯滤芯 | Technidyne | FTK-ACT | 经去除高岭土修饰 |
| aPTT 滤芯 | Technidyne | A104 |
参考文献
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重印与许可
