使用吸管技术记录嗅觉受体神经元对气味分子刺激的反应

摘要

嗅觉受体神经元（ORNs）首先将气味信号转化为受体电流，进而触发动作电位，并传递至嗅球中的二级神经元。本文描述了采用吸液电极技术，同时记录小鼠嗅觉受体神经元中由气味诱导产生的受体电流和动作电位的方法。

摘要

动物通过位于鼻腔内的化学感受系统来感知周围的气味环境。化学感受信号会影响多种复杂行为，例如食物选择、捕食者识别、同种个体及配偶识别以及其他具有社会意义的线索。嗅觉感受神经元（ORNs）位于鼻腔背侧的嗅觉上皮内。这些双极神经元发出轴突投射至嗅球（见图1，Reisert & Zhao¹，最初发表于《普通生理学杂志》），并从细胞体延伸出一条单一树突至上皮边界，树突上的纤毛伸入覆盖嗅觉上皮的黏液层中。这些纤毛含有信号转导装置，最终通过纤毛上的转导通道引发兴奋性电流内流，这些通道包括环核苷酸门控（CNG）通道和Ca²⁺激活的Cl^-通道（图1）。随后产生的去极化在胞体处触发动作电位的产生^2-4。

在本视频中，我们描述了使用“吸管记录技术”来记录气味物质诱导的嗅觉感觉神经元（ORNs）反应。该方法最初用于记录视杆光感受器的电活动⁵，其改良版本已被用于记录小鼠视锥光感受器的反应，并发布于jove.com⁶。随后，该技术被进一步改进，用于记录ORNs的电活动^7,8。简而言之，在分离嗅觉上皮组织并获得单个细胞后，将一个ORN的整个胞体吸入记录电极的尖端。其树突和纤毛仍暴露于浴液中，因此可通过更换溶液施加气味物质或药理学阻断剂等。在此配置下，无法进入细胞内环境（无法进行全细胞电压钳制），细胞内的电压可自由变化。这使得能够同时记录起源于纤毛的缓慢受体电流以及由胞体产生的快速动作电位⁹。由于这两种信号的动力学特性不同，可通过设置不同的滤波参数将其分离。该技术可用于任何野生型或基因敲除小鼠，也可选择性地记录那些同时表达GFP以标记特定亚群的ORNs，例如表达特定气味受体或离子通道的ORNs。

方案

1. 记录装置的设置

记录室安装在一台尼康TE2000U Eclipse倒置显微镜上，该显微镜配备相差光学系统，并置于气浮台上，同时使用法拉第笼进行电屏蔽。聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglass）制成的记录室由两个区域组成，中间由一道屏障部分隔开，并粘附于经硅烷化处理的玻璃载片上。记录过程中，其中一个区域用于沉降细胞，另一个区域则用于施加刺激，以尽量减少已沉降但尚未使用的细胞过早接触气味物质。记录装置包括一个吸液移液管（见下文）和一个接地电极，吸液移液管安装在移液管固定夹持器中。通过显微操作器来定位吸液移液管。刺激溶液通过三通道玻璃方管施加，每个方管截面尺寸为0.7 mm × 0.7 mm。该三通道玻璃管连接至安装在操纵器上的电动快速切换灌流系统（Sutter SF-77B，Warner Instruments），并以约45°角进入记录室。三通道玻璃管末端再次以45°角削成斜面，使得其最终端面（开口）呈垂直方向，以便移液管能够紧密靠近放置。

使用标准哺乳动物林格液填充的负压移液电极和接地电极连接至膜片钳放大器（PC-501A，Warner Instruments）的1 GΩ前置放大头段，工作模式为电压钳。放大器输出的模拟信号（在5 kHz处进行低通滤波）被送至数字示波器，以实时监测信号，同时连接至一个8极贝塞尔滤波器（Krohn-Hite），在该滤波器中信号在50 Hz处进行低通滤波。两个信号（分别在5 kHz和50 Hz处....

讨论

吸吮式移液技术是一种电生理学方法，可用于同时记录嗅觉受体神经元（ORN）中由气味诱导产生的慢受体电流和快速双相动作电位。由于该技术不破坏细胞的质膜，因此可保持细胞内环境的稳定，确保气味反应不会因胞质内离子浓度改变或细胞内因子稀释而受到影响。该方法可对细胞进行长时间记录（在蛙类中可达4小时，在小鼠中可达1小时）。该技术的另一优势在于，由于细胞体位于记录移液管内部，刺激仅作用于ORN的顶端部分，即纤毛和树突结（与体内情况一致）。 体内因此可消除因整个细胞暴露而可能产生的非特异性效应。此外，由于细胞稳定地位于移液管尖端，受到相对良好的保护，与紧密封接记录构型相比，该技术可实现较高的溶液流速，从而加快溶液更换速度；而在紧密封接记录中，高流速容易导致封接失败。 相反，由于无法建立细胞内接触，该技术不能用于电压钳制细胞，例如研究电压门控电流。同时，由于属于松密封技术，记录结果易受来自各种来源的电噪声干扰。应注意确保电极架清洁，未被盐类或任氏液覆盖，以防止其导电而成为潜在的噪声源。此外，所有设备及法拉第笼的接地均需仔细处理。

移液管尖端的尺寸和一致性非常重要，因为开口处任.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
气浮台	设备	Newport Corp.
气泵	设备	Newport Corp.	ACGP
拉针仪	设备	Sutter Instrument Co.	P-97
硼硅酸盐玻璃	设备	World Precision Instruments, Inc.	1B150-4
尼康Eclipse倒置显微镜	设备	Nikon Instruments	TE2000U	配备汞灯、GFP滤光片，以及至少20X和5X物镜
放大器PC-501A	设备	Warner Instruments	64-0008	探头1 GΩ
金刚石刀	设备	定制
模数转换器Mikro1401 A/D	设备	Cambridge Electronic Design
滤波单元3382	设备	Krohn-Hite Co.
Signal软件	软件	Cambridge Electronic Design
成型Ag/AgCl颗粒电极	设备	World Precision Instruments, Inc.	64-1297
移液管夹持器	设备	Warner Instruments	64-0997	经定制改装以适配 探头
记录室	设备	定制
微操纵器 MP85-1028	设备	Sutter Instrument Co.	微操纵器 MP85-1028
矿物油	溶液	Sigma-Aldrich	330779-1L
示波器TDS 1001	设备	Tektronix, Inc.
三通道方形玻璃管	设备	Warner Instruments	64-0119	内径0.6 mm，长5 cm
阀门	设备	The Lee Company
Valvelink 8.2	设备	AutoMate Scientific, Inc.
SF-77B灌流快速切换系统	设备	Warner Instruments