嗅觉受体神经元（ORNs）首先将气味信号转化为受体电流，进而触发动作电位，并传递至嗅球中的二级神经元。本文描述了采用吸液电极技术，同时记录小鼠嗅觉受体神经元中由气味诱导产生的受体电流和动作电位的方法。
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方法文章
使用吸管技术记录嗅觉受体神经元对气味分子刺激的反应
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
动物通过位于鼻腔内的化学感受系统来感知周围的气味环境。化学感受信号会影响多种复杂行为，例如食物选择、捕食者识别、同种个体及配偶识别以及其他具有社会意义的线索。嗅觉感受神经元（ORNs）位于鼻腔背侧的嗅觉上皮内。这些双极神经元发出轴突投射至嗅球（见图1，Reisert & Zhao1，最初发表于《普通生理学杂志》），并从细胞体延伸出一条单一树突至上皮边界，树突上的纤毛伸入覆盖嗅觉上皮的黏液层中。这些纤毛含有信号转导装置，最终通过纤毛上的转导通道引发兴奋性电流内流，这些通道包括环核苷酸门控（CNG）通道和Ca2+激活的Cl-通道（图1）。随后产生的去极化在胞体处触发动作电位的产生2-4。
在本视频中，我们描述了使用“吸管记录技术”来记录气味物质诱导的嗅觉感觉神经元（ORNs）反应。该方法最初用于记录视杆光感受器的电活动5，其改良版本已被用于记录小鼠视锥光感受器的反应，并发布于jove.com6。随后，该技术被进一步改进，用于记录ORNs的电活动7,8。简而言之，在分离嗅觉上皮组织并获得单个细胞后，将一个ORN的整个胞体吸入记录电极的尖端。其树突和纤毛仍暴露于浴液中，因此可通过更换溶液施加气味物质或药理学阻断剂等。在此配置下，无法进入细胞内环境（无法进行全细胞电压钳制），细胞内的电压可自由变化。这使得能够同时记录起源于纤毛的缓慢受体电流以及由胞体产生的快速动作电位9。由于这两种信号的动力学特性不同，可通过设置不同的滤波参数将其分离。该技术可用于任何野生型或基因敲除小鼠，也可选择性地记录那些同时表达GFP以标记特定亚群的ORNs，例如表达特定气味受体或离子通道的ORNs。
方案
1. 记录装置的设置
记录室安装在一台尼康TE2000U Eclipse倒置显微镜上，该显微镜配备相差光学系统，并置于气浮台上，同时使用法拉第笼进行电屏蔽。聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglass）制成的记录室由两个区域组成，中间由一道屏障部分隔开，并粘附于经硅烷化处理的玻璃载片上。记录过程中，其中一个区域用于沉降细胞，另一个区域则用于施加刺激，以尽量减少已沉降但尚未使用的细胞过早接触气味物质。记录装置包括一个吸液移液管（见下文）和一个接地电极，吸液移液管安装在移液管固定夹持器中。通过显微操作器来定位吸液移液管。刺激溶液通过三通道玻璃方管施加，每个方管截面尺寸为0.7 mm × 0.7 mm。该三通道玻璃管连接至安装在操纵器上的电动快速切换灌流系统（Sutter SF-77B，Warner Instruments），并以约45°角进入记录室。三通道玻璃管末端再次以45°角削成斜面，使得其最终端面（开口）呈垂直方向，以便移液管能够紧密靠近放置。
使用标准哺乳动物林格液填充的负压移液电极和接地电极连接至膜片钳放大器（PC-501A，Warner Instruments）的1 GΩ前置放大头段，工作模式为电压钳。放大器输出的模拟信号（在5 kHz处进行低通滤波）被送至数字示波器，以实时监测信号，同时连接至一个8极贝塞尔滤波器（Krohn-Hite），在该滤波器中信号在50 Hz处进行低通滤波。两个信号（分别在5 kHz和50 Hz处低通滤波）均输入至模数转换器（Cambridge Electronic Design Micro 1401 mkII），该转换器与计算机连接以进行数据采集。使用Signal 3采集软件（Cambridge Electronic Design）以10 kHz的采样频率记录数据。在两个不同带宽下记录信号，首先同时记录受体电流及其叠加的动作电位，然后单独记录受体电流（见图2）。灌流系统用于在林格液（对照）和气味刺激物或任何所需组成的溶液之间快速切换，由计算机和Signal 3软件控制。溶液盛装于60 ml注射器中，流速由医用级静脉输液流速调节器控制。通常，流速设定为1 ml/min。
记录电极管的吸力通过以下方式控制：将电极夹的侧端口连接至一条油管，该油管再连接至一个高度可调的油储液罐。通过升高或降低储液罐，可确保电极管内的压力保持在最小且略微正压的状态，从而使林格液通过电极尖端的流动量极小。此外，可通过一根连接至储液罐气相空间的管道施加额外的吸力或压力，管道另一端带有吹嘴，用于将分离的嗅觉神经元细胞体吸入记录电极的尖端内。
实验在 37 °C 下进行，以尽可能模拟细胞的天然生理条件。温度通过使溶液流经一个自制加热装置来控制，该装置由陶瓷电阻组成，溶液则流经穿过其中的不锈钢管10。温度使用热电偶温度计（Fluke）进行监测。
2. 溶液
哺乳动物林格氏液（mM）：140 NaCl、5 KCl、1 MgCl2、2 CaCl2、0.01 EDTA、10 HEPES、10 葡萄糖。用 NaOH 将 pH 值调节至 7.5。测量结电流时使用稀释 10% 的林格氏液。气味物质溶液：乙酰苯和丁香酚使用 Ringer 溶液将 20 mM DMSO 储存液现配现用。
3. 制作电极
- 将一根未拉丝的硼硅酸盐玻璃毛细管放入 Sutter P-97 显微注射针拉制仪中，拉制出具有长锥形的显微注射针。
- 将该注射针转移至安装在 Nikon E200 Eclipse 显微镜上的定制显微注射针持针器中，该显微镜目镜内装有分划板，并在载物台上固定有可移动的金刚石刀片。
- 在 20 倍物镜下观察注射针尖端，以分划板为参考，当注射针直径为 10 μm（外径）时，使用定制金刚石刀片垂直轻划注射针表面。
- 将金刚石刀片进一步向针尖方向移动，并逐渐对针尖施加压力，注射针应在划痕处整齐断裂。
或者，可将步骤 3.1 至 3.4 合并，直接拉制出所需尺寸的移液管，而无需切割移液管尖端，但这种方法在拉制具有较大尖端直径且切口边缘整齐的移液管时，可能更难实现稳定可靠的制备。
- 在40倍物镜下，使用电加热丝将移液管尖端拉制为内径5 μm的火焰抛光尖端。完成后，该微移液管即可用于记录小鼠嗅觉神经元的电流。当充满任氏液时，敞口移液管的电阻应约为1 MΩ。
4. 嗅觉受体神经元的分离
- 根据机构指南和规定处死一只小鼠。取下头部，剥离覆盖颅骨的皮肤，并沿中线将头颅从正中矢状面一分为二。
- 将两个半侧头部置于解剖显微镜下，移除鼻中隔并取出嗅黏膜下甲。将所有组织放入含有葡萄糖的哺乳动物任氏液（Ringer solution）的培养皿中。
- 从两个下甲的软骨上剥离嗅上皮组织，并将组织转移至含有250 μl任氏液的离心管中。我们使用来自两个下甲的组织，以获得适合记录室尺寸所需的细胞密度。将剩余组织保存在4 °C以备后续使用。
- 将含有嗅上皮组织的离心管在涡旋振荡器上短暂涡旋两次，每次1秒，中等速度。此步骤可使嗅觉神经元（ORNs）从上皮组织中机械性解离。
- 将含有解离后嗅觉神经元的任氏液转移至记录室中。用精细镊子去除悬浮液中存在的较大组织碎片。
- 让嗅觉神经元静置沉降20分钟，然后开始用任氏液持续灌流，并进行记录。
5. 记录
- 将连接油管的负压电极缓慢放入记录室中，并调节油储液罐的高度，使微管尖端形成轻微的正压。可通过观察细胞碎片是远离（正压）还是朝向（负压）微管尖端移动来判断。注意避免细胞碎片污染微管尖端。
- 使用20–40倍放大倍率在记录室中寻找具有典型双极形态的孤立嗅觉神经元（ORN）。将记录电极移至ORN胞体附近，轻柔地开始抽吸，使细胞胞体进入微管尖端。持续缓慢而小心地施加负压，直至整个细胞胞体被吸入微管尖端内，仅使树突和纤毛暴露于灌流液中。有关吸入后的ORN图像及微管形状，参见7,11。确保在停止施加负压后，ORN不会在微管内发生移动；如有移动，应相应调整油储液罐的高度。
- 利用显微操作器，将负压微管从含有已沉降ORN的区域移至记录区域，并将其小心地置于三通道灌流管前方。负压微管应足够靠近三通道管的开口端，以确保ORN暴露于层流中，避免湍流混合，从而实现快速的溶液交换。溶液交换通过切换平行流动溶液之间的界面穿过微管尖端来完成。溶液交换的时间过程通常约为20 ms，该时间通过切换细胞于不同离子成分溶液之间所引发的连接电流来测定（见图2）。溶液依靠重力驱动输送。
6. 代表性结果
图 1。 A) 嗅球中的双极感受神经元。 B) 纤毛内的信号转导机制最终导致兴奋性电流内流。随后的去极化在胞体处触发动作电位的产生。
图 2 显示了溶液交换的速度和可靠性。将移液管从正常林格液步进至稀释 10% 的林格液中持续 100 毫秒，记录因离子浓度差异产生的连接电流。黑色迹线为 5 次试验的平均值，红色迹线为其标准差。溶液交换过程中标准差变化很小，表明各次试验间溶液交换的可靠性，以及两种溶液流中均无额外噪声。
图3 显示使用吸水电极技术记录到的嗅觉神经元（ORN）对丁香酚诱导的反应。如记录图上方的条形图所示，该嗅觉神经元被暴露于100 μM丁香酚中持续1秒。图3A（黑色轨迹）中，受体电流经过0 - 50 Hz带宽滤波，仅显示受体电流。图3B 显示同一段记录，但此时滤波带宽为0 - 5000 Hz（红色轨迹），以同时显示动作电位（APs，用箭头指示）。插图为同一轨迹在时间轴放大后的显示，以便更清晰地观察反应起始阶段的动作电位。
图 4。 对丁香酚有反应的嗅觉受体神经元的剂量反应曲线族（A）。丁香酚的使用浓度范围为 0.3 μM 至 100 μM，刺激持续时间为 1 s，信号经 0 - 50 Hz 滤波。随着气味分子浓度逐步增加，反应幅度增大、潜伏期缩短，且在停止气味刺激后，反应的终止也更缓慢。
在中等浓度气味物质的长时间刺激下，嗅觉受体神经元（ORN）可表现出振荡性反应模式（图4B）。此处对一个对苯乙酮（3 μM）有响应的ORN进行了8秒的刺激。在刺激开始时出现快速而短暂的峰值反应后，观察到一系列较小且重复出现的反应。记录带宽为0 - 50 Hz。
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讨论
吸吮式移液技术是一种电生理学方法，可用于同时记录嗅觉受体神经元（ORN）中由气味诱导产生的慢受体电流和快速双相动作电位。由于该技术不破坏细胞的质膜，因此可保持细胞内环境的稳定，确保气味反应不会因胞质内离子浓度改变或细胞内因子稀释而受到影响。该方法可对细胞进行长时间记录（在蛙类中可达4小时，在小鼠中可达1小时）。该技术的另一优势在于，由于细胞体位于记录移液管内部，刺激仅作用于ORN的顶端部分，即纤毛和树突结（与体内情况一致）。 体内因此可消除因整个细胞暴露而可能产生的非特异性效应。此外，由于细胞稳定地位于移液管尖端，受到相对良好的保护，与紧密封接记录构型相比，该技术可实现较高的溶液流速，从而加快溶液更换速度；而在紧密封接记录中，高流速容易导致封接失败。 相反，由于无法建立细胞内接触，该技术不能用于电压钳制细胞，例如研究电压门控电流。同时，由于属于松密封技术，记录结果易受来自各种来源的电噪声干扰。应注意确保电极架清洁，未被盐类或任氏液覆盖，以防止其导电而成为潜在的噪声源。此外，所有设备及法拉第笼的接地均需仔细处理。
移液管尖端的尺寸和一致性非常重要，因为开口处任...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）DC009613 项目、人类前沿科学计划以及莫利护理研究员项目（授予 JR）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 气浮台 | 设备 | Newport Corp. | ||
| 气泵 | 设备 | Newport Corp. | ACGP | |
| 拉针仪 | 设备 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 硼硅酸盐玻璃 | 设备 | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| 尼康Eclipse倒置显微镜 | 设备 | Nikon Instruments | TE2000U | 配备汞灯、GFP滤光片，以及至少20X和5X物镜 |
| 放大器PC-501A | 设备 | Warner Instruments | 64-0008 | 探头1 GΩ |
| 金刚石刀 | 设备 | 定制 | ||
| 模数转换器Mikro1401 A/D | 设备 | Cambridge Electronic Design | ||
| 滤波单元3382 | 设备 | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal软件 | 软件 | Cambridge Electronic Design | ||
| 成型Ag/AgCl颗粒电极 | 设备 | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| 移液管夹持器 | 设备 | Warner Instruments | 64-0997 | 经定制改装以适配 探头 |
| 记录室 | 设备 | 定制 | ||
| 微操纵器 MP85-1028 | 设备 | Sutter Instrument Co. | 微操纵器 MP85-1028 | |
| 矿物油 | 溶液 | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| 示波器TDS 1001 | 设备 | Tektronix, Inc. | ||
| 三通道方形玻璃管 | 设备 | Warner Instruments | 64-0119 | 内径0.6 mm，长5 cm |
| 阀门 | 设备 | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | 设备 | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B灌流快速切换系统 | 设备 | Warner Instruments |
参考文献
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681(2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
- Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13(1999).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
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重印与许可
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