本文介绍了一种从斑马鱼背主动脉采集血液的技术，同时提供了获取血清的步骤，可用于生化分析，例如测定胆固醇和甘油三酯水平的实验。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼已被用作研究多种人类疾病的动物模型。它可作为研究分子事件和治疗策略以及评估某些病理生理机制的强大临床前研究平台1。
关于成年斑马鱼器官和系统的生理学研究，相关发表文献相对较少2，这可能导致研究人员认为目前尚缺乏探索斑马鱼系统所需的基本技术3。斑马鱼的血液生化指标最早由Murtha及其同事于2003年报道4，他们采用了一种由Jagadeeswaran及其同事于1999年首次描述的采血技术。简而言之，通过在背主动脉区域做一个长约0.3 cm的侧向切口，使用微量移液器吸头采集血液5。由于操作涉及的尺寸极小，该技术精度要求高，需要操作者具备高度熟练的技术。同一年，该研究团队在另一篇论文中也采用了相同的技术6。2010年，Eames及其同事评估了斑马鱼的全血葡萄糖水平7。他们通过使用剪刀进行断头，然后将肝素化毛细管采血管插入胸鳍关节处获取血液。他们提到存在溶血困难的问题，后根据Kilpatrick等人的研究，通过调整适当的储存温度得以解决8。在本实验室尝试使用Jagadeeswaran的技术时，我们发现很难将切口准确地定位在合适位置，导致在开始采集前已有大量血液流失。
最近，Gupta 等人9描述了成年斑马鱼器官的解剖方法，Kinkle 等人10描述了腹腔注射的操作方法，Pugach 等人11描述了眶后注射的技术。然而，斑马鱼研究中的基础技术仍需进一步系统探索和完善。
斑马鱼体型较小，这为将其作为实验模型的研究人员带来了挑战。此外，鉴于其微小的体型，开发简便的技术以帮助研究人员充分利用斑马鱼模型的优势显得尤为重要。
方案
1. 实验方案正文
- 在采集斑马鱼血液之前，需要准备麻醉用水。将约 200 ml 的养殖水倒入一个容量为 500 ml 的容器中，加入约 200 g 冰屑，使水温降至约 4 °C。随着冰屑融化，需不断补充冰屑以维持温度在接近 4 °C 的恒定水平。
- 麻醉用水准备好后，准备采血所需材料。在 P20 移液器上安装低吸附吸头，并将移液器放置在便于取用的位置。确保移液器吸头不接触任何可能的污染源。
- 在培养皿上铺一块干燥纱布，并将钢制刀片和另一块纱布放置在便于取用的位置。
- 需要准备一台适用于塑料离心管的离心机。
- 上述材料准备就绪后，用捞网捕获第一条需麻醉的斑马鱼，并将其放入已准备好的麻醉用水中。斑马鱼在低温水中通常需要 3–6 秒完成麻醉，具体时间因个体而异。将鱼保持在冷水中，直至其对外界刺激无反应。
- 用捞网将已麻醉的鱼放置在预先准备的纱布上，使尾部悬于纱布外。将纱布折叠覆盖鱼的头部和身体，仅露出尾部，并将包裹纱布的鱼置于培养皿中。
- 使用钢制刀片在肛鳍与尾鳍之间做一斜向切口，血液将开始流出。此时需迅速操作。
- 使用 P20 移液器（已预装低吸附吸头）轻柔吸取流出的血液。可采集的血量取决于鱼的大小及麻醉效果，通常在 5 至 20 μl 之间。当血液停止流出时，将吸取的血液轻柔转移至离心管中。
- 为避免溶血，必须极其小心地处理含有血液的离心管，在放入离心机前避免任何剧烈动作。
- 为避免溶血，还应在采血后 10 分钟内将血液样本放入离心机并固定。
- 如有必要，可将多条鱼的血液合并成一个混合样本。只要从第一条鱼采血到开始离心的间隔不超过 10 分钟，混合样本即可正常使用。
- 完成采血后，将血液在 0.5 g 条件下离心 10 分钟（使用 Eppendorf Centrifuge 5415D）。
- 离心后，血清位于离心管上层。用移液器吸取血清，注意仅吸取血清层，同时保持上下两层清晰分离且稳定。
- 将血清转移至新的微量离心管中，即可用于生化分析。在等待开始生化分析期间，血清可暂时保存在冰上。
- 若血清不立即使用，可在 -18 °C 冷冻保存，最长可保存约 3 个月。
2. 代表性结果
从每条鱼中可采集到5至20 μl的全血，其血量甚至可达既往报道技术的4倍（表2）。采用该方法采血后，进行了总胆固醇、HDL-胆固醇、LDL-胆固醇和甘油三酯的生化分析。为避免进食对结果的干扰，将两组不同性别的鱼类在采血前禁食24小时。总胆固醇和甘油三酯的检测使用3 μl血清，而LDL-胆固醇和HDL-胆固醇的检测则分别使用4 μl和10 μl血清，检测采用小规模比色法进行（Labtest Diagnóstica S.A.，巴西）。这些分析以每10条斑马鱼为一组混合成样本进行。
在为期2周的实验中，比较了能够接触自身鱼卵的鱼类与在底部铺有覆盖物的水族箱中无法接触自身鱼卵的鱼类之间的血清脂质水平。血清分析显示，总胆固醇（有卵组362 ± 42 mg/dL，无卵组357 ± 13 mg/dL）、HDL-胆固醇（有卵组91.22 ± 1.79 mg/dL，无卵组72.14 ± 2.89 mg/dL）和LDL-胆固醇（有卵组55.68 ± 10.88 mg/dL，无卵组44.18 ± 9.84 mg/dL）的血清水平在两组之间无显著差异。然而，实验组（无卵组292 ± 64 mg/dL）的甘油三酯水平显著低于对照组（有卵组457 ± 25 mg/dL；P = 0.03）。
| 可获取鸡蛋 | 不可获取鸡蛋 | |
| 总胆固醇 (mg/dL) | 362.82 ± 73.11 | 357.69 ± 23.08 |
| 低密度脂蛋白胆固醇 (mg/dL) | 55.69 ± 18.84 | 44.19 ± 17.05 |
| 高密度脂蛋白胆固醇 (mg/dL) | 91.23 ± 3.11 | 72.14 ± 5.01 |
| 甘油三酯 (mg/dL) | 457.64 ± 43.78* | 292.36 ± 111.28 |
表1：两个研究组（可接触鸡蛋组与不可接触鸡蛋组）血清胆固醇和甘油三酯水平，以均值±标准差表示。
*具有统计学显著性（P=0.03）。采用学生t检验。
| 作者 | 切口位置 | 采集方法 | 麻醉方式 | 采集血液量 |
| Jagadeeswaran 等, 1999 Murtha 等, 2003 | 背鳍后方显微解剖 | 微量移液器 | 未提及
冷水中含 3% MS222 | 1 至 5 μl
5 至 10 μl |
| Eames 等, 2010 | 断头法 | 微毛细管 | 0.02% MS222 28 °C 水温 | 5 至 10 μl |
| 本研究 | 肛鳍与尾鳍之间的切口 | 微量移液器及低吸附吸头 | 水与冰屑 | 5 至 20 μl |
表2. 本研究所述采血技术与先前描述的采血技术之间的比较。
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讨论
本文介绍了一种简单的方法，可实现斑马鱼实验中进一步的血液和血清分析。该技术有望为未来需要血液参数数据的斑马鱼血液学研究提供支持，同时也将拓展斑马鱼作为实验模型的广泛应用。
该技术无需特殊技能或精确的操作技巧。此外，与其他方法相比，该方法可使采集的血液量增加一倍，从而减少为获取所需生物材料而使用的鱼类数量。该技术有一个关键步骤，即必须小心处理血液样本，因为斑马鱼血液极易发生溶血。采血与离心之间的时间间隔必须严格控制，延迟不超过10分钟可防止溶血。离心的速度和时间（0.5 g 离心10分钟）也必须严格遵循。
在开发该技术之前，曾尝试过其他采血技术。然而，这些方法需要使用大量动物，且每条鱼采集到的血量极少。这种新技术减少了动物使用数量，即使操作者技能水平较低也能顺利实施，并且在每条鱼采集的血量方面，结果优于其他技术。
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披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低吸附吸头 | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | 已停产 |
参考文献
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol. Dis. 25, 239-249 (1999).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717(2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126(2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645(2009).
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