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方法文章

从 naïve 小鼠和胰腺肿瘤荷瘤小鼠中分离制备髓系来源抑制性细胞（MDSC）的流式细胞术与自动磁性激活细胞分选（AutoMACS）方法 关键词：MDSC，髓系来源抑制性细胞，naïve 小鼠，胰腺肿瘤荷瘤小鼠，流式细胞术，自动磁性激活细胞分选，AutoMACS

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DOI：

10.3791/3875

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2012年6月18日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of South Florida Morsani College of Medicine

本文内容

摘要

这是一种快速且全面的免疫表型分析髓系来源抑制性细胞（MDSC）并富集Gr-1的方法+ 从小鼠脾脏中分离白细胞。该方法利用流式细胞术和AutoMACS细胞分选技术富集活的Gr-1+ 在使用流式细胞荧光分选（FACS）分离髓源性抑制细胞（MDSC）之前，对白细胞进行处理 体内 和 体外 检测方法

摘要

MDSC 是一组异质性的未成熟巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞，在寄生虫感染、炎症、创伤应激、移植物抗宿主病、糖尿病和癌症等病理条件下，会在淋巴器官中积聚1-7在小鼠中，MDSC 表达 Mac-1（CD11b）和 Gr-1（Ly6G 和 Ly6C）表面抗原7需要注意的是，在多种荷瘤宿主中，髓源性抑制细胞（MDSC）已被广泛研究，其数量显著扩增，并较未受刺激的对应细胞更强地抑制抗肿瘤免疫应答。7-10然而，根据不同的病理状况，髓源性抑制细胞（MDSC）存在具有不同抑制机制和靶点的亚群11,12因此，有效分离具有活性的MDSC群体的方法对于阐明其不同的分子抑制机制至关重要 体外 和 体内.

最近，Ghansah 研究组报道了在小鼠胰腺癌模型中髓源性抑制细胞（MDSC）的扩增现象。与未受刺激的 MDSC 相比，荷瘤小鼠来源的 MDSC 表现出稳态失衡以及抑制功能增强13。在未受刺激小鼠与荷瘤小鼠之间，前者的淋巴器官中 MDSC 比例显著较低。这一差异构成了主要的技术局限，常常阻碍对这两类 MDSC 进行准确的比较分析。因此，在进行荧光激活细胞分选（FACS）之前，对来自未受刺激小鼠的 Gr-1+ 白细胞进行富集，可提高细胞纯度和存活率，并显著缩短分选时间。然而，由于荷瘤小鼠体内的 Gr-1+ 白细胞数量丰富，能够快速完成 FACS 分选，因此对其富集步骤为可选操作。基于此，本实验方案描述了一种高效的方法，用于对 MDSC 进行免疫表型分析，并及时从小鼠脾脏中富集 Gr-1+ 白细胞以进行后续 MDSC 分选。将免疫健全的 C57BL/6 小鼠皮下接种小鼠 Panc02 细胞，而对照组（未受刺激）小鼠则给予 1×PBS。接种约 30 天后，取脾脏并使用细胞解离筛将其处理为单细胞悬液。随后对脾细胞进行红细胞（RBC）裂解，并取部分白细胞使用偶联荧光染料的 Mac-1 和 Gr-1 抗体染色，通过流式细胞术分析 MDSC 的比例。在平行实验中，将来自未受刺激小鼠的全部白细胞用荧光标记的 Gr-1 抗体染色，再与 PE-MicroBeads 孵育，利用自动磁性激活细胞分选（autoMACS）Pro 分离系统进行正向筛选。随后，取部分富集得到的 Gr-1+ 白细胞用 Mac-1 抗体染色，通过流式细胞术检测 MDSC 比例的提升情况。至此，这些经 Gr-1+ 富集的白细胞已准备好用于 FACS 分选 MDSC，以便在体内（in vivo）和体外（in vitro）实验中开展未受刺激组与荷瘤组之间的比较分析。

方案

开始之前，准备以下溶液：

3% 染色液（SM）：

含3% 胎牛血清（FBS）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）

MACS 缓冲液（MB）：

- 1×PBS 中含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）

1. 从小鼠中采集脾脏

  1. 将1.5 × 105个悬浮于100 μl 1× PBS中的小鼠Panc02细胞皮下注射至6-8周龄的C57BL/6小鼠（Harlan）体内（荷瘤小鼠；TB）。对照小鼠（Naïve）注射100 μl 1× PBS。
  2. 注射后约4周，采用二氧化碳窒息法处死小鼠。
  3. 使用镊子和剪刀通过钝性解剖法分离小鼠脾脏，称重后置于分别标记的含有1× PBS的50 ml锥形管中。

2. 从脾脏制备单细胞白细胞悬液

所有操作均应在生物安全柜内的无菌环境中进行，并将细胞和抗体置于冰上保存。

  1. 将筛网插入杯体底部开口处，组装细胞解离筛。然后将固定环带槽口的一面朝上旋入螺纹区域，并使用环形钥匙拧紧固定环，以固定筛网。将组装好的筛子放入含有10 ml 1×PBS的培养皿中。
  2. 收集脾脏，使用玻璃研杵在细胞解离筛的筛网上研磨脾脏，使细胞进入培养皿中。对每组实验小鼠重复此操作。
  3. 使用70 μm细胞滤筛和5 ml移液管将细胞悬液过滤至50 ml锥形离心管中。在12,000 rpm（250–300 ×g）下离心5分钟。
  4. 弃去上清液，按每只脾脏加入5 ml 1×红细胞裂解缓冲液重悬沉淀。剧烈吹打混匀。室温孵育5分钟。加入20 ml 1×PBS终止反应。再次剧烈吹打混匀。在12,000 rpm（250–300 ×g）下离心5分钟。
  5. 弃去上清液，用20 ml无菌1×PBS重悬沉淀。剧烈吹打混匀。
  6. 使用台盼蓝和血细胞计数板进行细胞计数，并将细胞重悬于3% SM中至所需浓度，使50 μl细胞悬液含有5×105–1×106个细胞（即1×107个细胞/ml – 2×107个细胞/ml）。

3. 使用流式细胞术对髓源性抑制细胞进行细胞表面染色/免疫表型分析

  1. 为96孔V型底板的各孔标记对照组、实验组以及用于补偿对照的单染样本（未染色，NS；Mac-1-FITC；Gr-1-APC 和 DAPI）。
  2. 向96孔V型底板的相应孔中加入相当于50 μl/孔脾细胞的5×105–1×106个细胞。以12,000 rpm（250–300 × g）离心5分钟。
  3. 在冰上，于1.5 ml微量离心管中用3% SM稀释小鼠BD Fc阻断剂（大鼠抗小鼠CD16/32单克隆抗体），配制“主混合液”（MM）。初始建议每孔使用1 μg Fc阻断剂溶于3% SM，终体积为50 μl。
  4. 将96孔V型底板快速倒置并回正，置于废液容器或水槽上方，小心吸除各孔上清液，避免扰动细胞沉淀。
  5. 涡旋混匀Fc阻断剂主混合液，短暂离心5秒，然后向96孔V型底板中所有细胞沉淀加入50 μl。通过轻柔吹打充分混匀，保持样本在原孔中。将板置于冰上避光孵育15分钟。以12,000 rpm（250–300 × g）离心5分钟。
  6. 在样本与Fc阻断剂孵育期间，于冰上1.5 ml微量离心管中用3% SM稀释荧光素偶联抗体，配制“主混合液”（MM）。抗体应预先滴定以确定染色步骤的最佳稀释比例。初始建议每孔终体积50 μl，其中Mac-1-FITC按1:25稀释，Gr-1-APC按1:20稀释，均溶于3% SM。
  7. 参照前述方法，小心吸除96孔V型底板各孔中的上清液。
  8. 涡旋混匀荧光素偶联染色抗体主混合液，短暂离心5秒后，向对照组和实验组的细胞沉淀中各加入50 μl。通过轻柔吹打充分混匀。对于单染补偿样本，分别向对应孔中加入含1:25稀释的Mac-1-FITC、1:20稀释的Gr-1-APC及75 ng/ml DAPI的3% SM溶液，每孔终体积为50 μl。向未染色孔（未染色对照）加入50 μl 3% SM。充分混匀后，将细胞置于96孔V型底板中，冰上避光孵育30分钟。
  9. 标记FACS管（5 ml，12 mm × 75 mm聚苯乙烯圆底管），使其与96孔V型底板中的各孔对应。每管加入200 μl 3% SM。
  10. 以12,000 rpm（250–300 × g）离心5分钟，吸除上清液。向每孔沉淀中加入100 μl 3% SM进行洗涤，通过轻柔吹打充分混匀。以12,000 rpm（250–300 × g）离心5分钟。重复洗涤步骤一次。
  11. 参照前述方法，小心吸除96孔V型底板各孔中的上清液。将每孔沉淀重悬于100 μl 3% SM中，并充分混匀。
  12. 将96孔V型底板中每孔重悬的100 μl细胞悬液转移至相应标记的FACS管中。
  13. 在流式细胞术分析前，向对照组、实验组样本及DAPI单染补偿对照中加入75 ng/ml DAPI。
  14. 进行流式细胞术检测以获取MDSC百分比数据。使用阴性对照（未染色对照）和单阳性对照进行补偿调节。设置点图显示前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）的对数关系，以便识别目标白细胞群体。在点图上圈选所有白细胞群体，排除前向和侧向散射光最低的碎片和细胞团块。从此父门内创建新的SSC与DAPI点图，并圈选DAPI阴性（活细胞）群体。选择该新圈选的群体，创建Mac-1与Gr-1的点图，并圈选双阳性（Mac-1+ Gr-1+）MDSC群体。

4. Gr-1+ 白细胞的磁珠富集

  1. 将1×107个未染色的白细胞分装至适当标记的FACS管中，在12,000 rpm（250–300 × g）下离心5分钟。
  2. 在1.5 ml微量离心管中配制Gr-1-PE抗体的标记微珠（MM）。每份样本中，对于不超过107个细胞，使用50 μl MB缓冲液对Gr-1-PE抗体进行1:10稀释；细胞数量更多时，按比例增加体积。短暂离心5秒后，加入FACS管中的白细胞，于4 °C避光孵育15分钟。
  3. 向FACS管中加入2 ml MB缓冲液，在12,000 rpm（250–300 × g）下离心5分钟，弃去上清液。
  4. 在1.5 ml微量离心管中配制Anti-PE MicroBeads的标记微珠（MM）。每份样本中，对于不超过107个细胞，使用200 μl MB缓冲液对anti-PE MicroBeads进行1:4稀释；细胞数量更多时，按比例增加体积。短暂离心5秒后，加入FACS管中的白细胞，于4 °C避光孵育15分钟。
  5. 向FACS管中加入2 ml MB缓冲液，在12,000 rpm（250–300 × g）下离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于3 ml SB缓冲液中，通过70 μm细胞筛过滤至新的、已标记的50 ml锥形管中。
  6. 准备并启动Auto MACS Pro分选仪。必要时，补充所有瓶中的相应溶液并清空废液瓶。打开仪器，初始化后检查流体容器和柱的状态，所有指示灯应为绿色。在菜单栏中，从上方菜单选择“Separation”，再从下方菜单选择“Wash Now”。在弹出选项中选择“Rinse”，然后点击“Run”以启动预冲洗程序。预冲洗程序成功完成后，仪器状态菜单将显示“Ready for Separation”。
  7. 选择适合的冷藏管架以匹配管的尺寸，将含有磁标记细胞的50 ml锥形管置于A排，用于收集阴性组分的50 ml锥形管置于B排，用于收集阳性组分的15 ml锥形管置于C排。
  8. 选择“POSSEL_S”细胞分选程序，用于从样本中以敏感模式对标记的目标细胞进行阳性分选。磁标记的目标细胞将被保留在自动分选柱上，未标记的细胞则被释放至B排的阴性组分收集管中。当磁铁自动回缩时，标记的目标细胞将被洗脱至管架C排的阳性收集管中。

5. Gr-1+ 富集白细胞的分选后分析

  1. 使用台盼蓝和血细胞计数板重新计数 Gr-1+ 和 Gr-1- 细胞组分。将细胞重悬于 3% 染色缓冲液中，调整至所需浓度，使 50 μl 含 5×105–1×106 个细胞（即 1×107 个细胞/ml – 2×107 个细胞/ml），并转移 50 μl 至相应标记的流式管中。
  2. 在 3% 染色缓冲液中按 1:25 稀释 Mac-1 抗体，配制仅含 Mac-1 的混合抗体溶液，每样本终体积为 50 μl。对细胞进行染色，并为流式细胞术分析制备 Gr-PE、Mac-1 FITC 和 DAPI 的单染对照补偿样本。随后每管加入 200 μl 3% 染色缓冲液及 DAPI 活性染料，操作同前。
  3. 进行流式细胞术数据采集，以确定 Gr-1+ 和 Gr-1- 细胞的百分比，并比较 autoMACS 富集前后髓源性抑制细胞（MDSC）的比例。

6. 代表性结果

此处我们展示了使用autoMACS从汇集的未致敏脾脏中富集Gr-1+白细胞以进行后续MDSC流式细胞术分选的代表性结果（图1）。在进行autoMACS分选前，取1×106个未致敏白细胞，用Mac-1-FITC和Gr-1-APC抗体染色，通过BD LSRII仪器检测MDSC所占百分比。随后，取1×107个未致敏白细胞，使用抗Gr-1-PE抗体和PE-MicroBeads标记，利用autoMACS Pro分选仪富集Gr-1+白细胞。在完成autoMACS富集后，通过流式细胞术检测Gr-1+和Gr-1-收集组分中Gr-1阳性细胞的比例。另取1×106个Gr-1+白细胞，用Mac-1-FITC抗体染色，通过流式细胞术分析并比较富集后的汇集未致敏白细胞与未经富集的汇集荷瘤白细胞中MDSC的百分比。

流式细胞术分析，初始细胞和荷瘤细胞中 Gr-1 和 Mac-1 的表达，等高线图
图 1. 使用 AutoMACS 富集初始 Gr-1+ 白细胞用于 MDSC 的 FACS 分选。从小鼠胰腺肿瘤模型小鼠和初始小鼠中分离脾脏，并制备成单细胞悬液。在 AutoMACS 富集前，对初始白细胞进行表面染色，使用 Mac-1 和 Gr-1 荧光标记抗体进行流式细胞术分析（A）。对来自混合初始白细胞、经 Gr-1-PE 抗体及抗-PE MicroBeads 标记后，通过 AutoMACS 富集 Gr-1+ 细胞所得的 Gr-1+（B）和 Gr-1-（C）组分进行流式细胞术分析。对来自混合初始白细胞经 AutoMACS 富集 Gr-1+ 细胞后的 MDSC 和 Gr-1+ 细胞比例进行流式细胞术分析（D），并与未经富集的荷瘤小鼠混合白细胞进行比较（E）（初始小鼠，n=5；荷瘤小鼠，n=3）。MDSC 和 Gr-1 阳性细胞比例在代表性等高线图和直方图中设门分析。

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讨论

本文详细介绍了一种适用于多种动物模型不同淋巴组织中髓源性抑制细胞（MDSC）群体的处理与免疫表型分析方法。具体而言，autoMACS 富集技术可用于分离多种白细胞群体，包括脾细胞中 Gr-1 的去除4、从脾脏和淋巴结中纯化髓系亚群5、骨髓中性粒细胞的分离14，以及从脾脏和淋巴结中纯化 CD8+ T 细胞15。无论目标细胞群体为何，均需从目标淋巴组织制备单细胞悬液，以实现最佳的表面染色、流式细胞术分析、autoMACS 富集及 FACS 分选。在本方案中，我们采用机械解离法制备白细胞单细胞悬液。然而，使用胶原酶 D 等酶消化法也是本方案的适当替代方法，可提高从脾脏或其他淋巴器官中获取白细胞的得率5。

流式细胞术是白细胞免疫表型分析的重要技术。因此，为进行流式细胞术检测而进行的充分样本制备和富集，也需要使用适当的缓冲液来重悬细胞，并用于稀释抗体试剂。许多实验方案在制备染色缓冲液和MACS缓冲液时，交替使用FBS和BSA。然而，这些试剂也可从eBioscie...

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致谢

我们感谢南佛罗里达大学流式细胞术核心设施。感谢 Denise Cooper 博士分享资源。同时感谢 Maya Cohen、Laura Pendleton 和 Diana Latour 在本视频的搭建和拍摄过程中提供的协助。NN 获美国国家科学基金会 LSAMP 博士学位桥梁奖学金（项目编号：HRD #0929435）支持。本研究由美国癌症协会机构研究基金（项目编号：93-032-13/Moffitt 癌症中心）资助，授予 TG。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1X 磷酸盐缓冲液Thermo Scientific HycloneSH30028.02不含 Ca2+/Mg2+/酚红
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA7906让 BSA 在 PBS 中静置溶解；无菌环境
胎牛血清（FBS）Thermo Scientific HycloneSV3001403HI热灭活；无菌环境
大鼠抗小鼠 CD16/32 单克隆抗体（Fc 封闭）BD Biosciences553142无菌环境
抗小鼠 CD11b（Mac-1）FITCeBioscience11-0112无菌环境
抗小鼠 Ly6G（Gr-1）APCeBioscience17-5931无菌环境
抗小鼠 Ly6G（Gr-1）PEeBioscience12-5931无菌环境
DAPIInvitrogenD1306系列稀释，无菌环境
细胞解离筛Sigma-AldrichCD1-1KT使用前高压灭菌
70-μm 细胞筛BD Biosciences352350无菌环境
1X 红细胞裂解缓冲液eBioscience00-4333-57使用前恢复至室温；无菌环境
培养皿Fisher Scientific08-757-12无菌环境
50 ml 锥形离心管Thermo Fisher Scientific, Inc.339652无菌环境
5 ml 12×75 mm 聚苯乙烯圆底管BD Biosciences352054又称 FACS 管；无菌环境
96 孔 V 型底板Corning3897无菌环境
台盼蓝Cellgro25-900-CI无菌环境
PE MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-801无菌环境
AutoMACS Pro 分离仪Miltenyi Biotec130-092-545
AutoMACS 柱Miltenyi Biotec130-021-101
AutoMACS 运行缓冲液Miltenyi Biotec130-091-221

参考文献

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AutoMACS 分离Gr-1 阳性白细胞Mac-1 Gr-1 染色脾细胞悬液红细胞裂解荧光激活细胞分选
从 naïve 小鼠和胰腺肿瘤荷瘤小鼠中分离制备髓系来源抑制性细胞（MDSC）的流式细胞术与自动磁性激活细胞分选（AutoMACS）方法 关键词：MDSC，髓系来源抑制性细胞，naïve 小鼠，胰腺肿瘤荷瘤小鼠，流式细胞术，自动磁性激活细胞分选，AutoMACS
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