从 naïve 小鼠和胰腺肿瘤荷瘤小鼠中分离制备髓系来源抑制性细胞（MDSC）的流式细胞术与自动磁性激活细胞分选（AutoMACS）方法 关键词：MDSC，髓系来源抑制性细胞，naïve 小鼠，胰腺肿瘤荷瘤小鼠，流式细胞术，自动磁性激活细胞分选，AutoMACS

摘要

这是一种快速且全面的免疫表型分析髓系来源抑制性细胞（MDSC）并富集Gr-1的方法⁺ 从小鼠脾脏中分离白细胞。该方法利用流式细胞术和AutoMACS细胞分选技术富集活的Gr-1⁺ 在使用流式细胞荧光分选（FACS）分离髓源性抑制细胞（MDSC）之前，对白细胞进行处理 体内 和 体外 检测方法

摘要

MDSC 是一组异质性的未成熟巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞，在寄生虫感染、炎症、创伤应激、移植物抗宿主病、糖尿病和癌症等病理条件下，会在淋巴器官中积聚^1-7在小鼠中，MDSC 表达 Mac-1（CD11b）和 Gr-1（Ly6G 和 Ly6C）表面抗原⁷需要注意的是，在多种荷瘤宿主中，髓源性抑制细胞（MDSC）已被广泛研究，其数量显著扩增，并较未受刺激的对应细胞更强地抑制抗肿瘤免疫应答。^7-10然而，根据不同的病理状况，髓源性抑制细胞（MDSC）存在具有不同抑制机制和靶点的亚群^11,12因此，有效分离具有活性的MDSC群体的方法对于阐明其不同的分子抑制机制至关重要 体外 和 体内.

最近，Ghansah 研究组报道了在小鼠胰腺癌模型中髓源性抑制细胞（MDSC）的扩增现象。与未受刺激的 MDSC 相比，荷瘤小鼠来源的 MDSC 表现出稳态失衡以及抑制功能增强¹³。在未受刺激小鼠与荷瘤小鼠之间，前者的淋巴器官中 MDSC 比例显著较低。这一差异构成了主要的技术局限，常常阻碍对这两类 MDSC 进行准确的比较分析。因此，在进行荧光激活细胞分选（FACS）之前，对来自未受刺激小鼠的 Gr-1⁺ 白细胞进行富集，可提高细胞纯度和存活率，并显著缩短分选时间。然而，由于荷瘤小鼠体内的 Gr-1⁺ 白细胞数量丰富，能够快速完成 FACS 分选，因此对其富集步骤为可选操作。基于此，本实验方案描述了一种高效的方法，用于对 MDSC 进行免疫表型分析，并及时从小鼠脾脏中富集 Gr-1⁺ 白细胞以进行后续 MDSC 分选。将免疫健全的 C57BL/6 小鼠皮下接种小鼠 Panc02 细胞，而对照组（未受刺激）小鼠则给予 1×PBS。接种约 30 天后，取脾脏并使用细胞解离筛将其处理为单细胞悬液。随后对脾细胞进行红细胞（RBC）裂解，并取部分白细胞使用偶联荧光染料的 Mac-1 和 Gr-1 抗体染色，通过流式细胞术分析 MDSC 的比例。在平行实验中，将来自未受刺激小鼠的全部白细胞用荧光标记的 Gr-1 抗体染色，再与 PE-MicroBeads 孵育，利用自动磁性激活细胞分选（autoMACS）Pro 分离系统进行正向筛选。随后，取部分富集得到的 Gr-1⁺ 白细胞用 Mac-1 抗体染色，通过流式细胞术检测 MDSC 比例的提升情况。至此，这些经 Gr-1⁺ 富集的白细胞已准备好用于 FACS 分选 MDSC，以便在体内（in vivo）和体外（in vitro）实验中开展未受刺激组与荷瘤组之间的比较分析。

方案

开始之前，准备以下溶液：

3% 染色液（SM）：

含3% 胎牛血清（FBS）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）

MACS 缓冲液（MB）：

- 1×PBS 中含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）

1. 从小鼠中采集脾脏

1. 将1.5 × 10⁵个悬浮于100 μl 1× PBS中的小鼠Panc02细胞皮下注射至6-8周龄的C57BL/6小鼠（Harlan）体内（荷瘤小鼠；TB）。对照小鼠（Naïve）注射100 μl 1× PBS。
2. 注射后约4周，采用二氧化碳窒息法处死小鼠。
3. 使用镊子和剪刀通过钝性解剖法分离小鼠脾脏，称重后置于分别标记的含有1× PBS的50 ml锥形管中。

2. 从脾脏制备单细胞白细胞悬液

所有操作均应在生物安全柜内的无菌环境中进行，并将细胞和抗体置于冰上保存。

1. 将筛网插入杯体底部开口处，组装细胞解离筛。然后将固定环带槽口的一面朝上旋入....

讨论

本文详细介绍了一种适用于多种动物模型不同淋巴组织中髓源性抑制细胞（MDSC）群体的处理与免疫表型分析方法。具体而言，autoMACS 富集技术可用于分离多种白细胞群体，包括脾细胞中 Gr-1 的去除⁴、从脾脏和淋巴结中纯化髓系亚群⁵、骨髓中性粒细胞的分离¹⁴，以及从脾脏和淋巴结中纯化 CD8⁺ T 细胞¹⁵。无论目标细胞群体为何，均需从目标淋巴组织制备单细胞悬液，以实现最佳的表面染色、流式细胞术分析、autoMACS 富集及 FACS 分选。在本方案中，我们采用机械解离法制备白细胞单细胞悬液。然而，使用胶原酶 D 等酶消化法也是本方案的适当替代方法，可提高从脾脏或其他淋巴器官中获取白细胞的得率⁵。

流式细胞术是白细胞免疫表型分析的重要技术。因此，为进行流式细胞术检测而进行的充分样本制备和富集，也需要使用适当的缓冲液来重悬细胞，并用于稀释抗体试剂。许多实验方案在制备染色缓冲液和MACS缓冲液时，交替使用FBS和BSA。然而，这些试剂也可从eBioscie.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1X 磷酸盐缓冲液	Thermo Scientific Hyclone	SH30028.02	不含 Ca2+/Mg2+/酚红
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A7906	让 BSA 在 PBS 中静置溶解；无菌环境
胎牛血清（FBS）	Thermo Scientific Hyclone	SV3001403HI	热灭活；无菌环境
大鼠抗小鼠 CD16/32 单克隆抗体（Fc 封闭）	BD Biosciences	553142	无菌环境
抗小鼠 CD11b（Mac-1）FITC	eBioscience	11-0112	无菌环境
抗小鼠 Ly6G（Gr-1）APC	eBioscience	17-5931	无菌环境
抗小鼠 Ly6G（Gr-1）PE	eBioscience	12-5931	无菌环境
DAPI	Invitrogen	D1306	系列稀释，无菌环境
细胞解离筛	Sigma-Aldrich	CD1-1KT	使用前高压灭菌
70-μm 细胞筛	BD Biosciences	352350	无菌环境
1X 红细胞裂解缓冲液	eBioscience	00-4333-57	使用前恢复至室温；无菌环境
培养皿	Fisher Scientific	08-757-12	无菌环境
50 ml 锥形离心管	Thermo Fisher Scientific, Inc.	339652	无菌环境
5 ml 12×75 mm 聚苯乙烯圆底管	BD Biosciences	352054	又称 FACS 管；无菌环境
96 孔 V 型底板	Corning	3897	无菌环境
台盼蓝	Cellgro	25-900-CI	无菌环境
PE MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801	无菌环境
AutoMACS Pro 分离仪	Miltenyi Biotec	130-092-545
AutoMACS 柱	Miltenyi Biotec	130-021-101
AutoMACS 运行缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-221