聚乙烯醇海绵模型植入

摘要

本文介绍了一种在动物伤口修复模型中分析药物、生长因子和/或经处理细胞作用的有用工具。该技术利用聚乙烯醇（PVA）海绵的特性，递送并容纳所需治疗物质，同时提供一个可被切除并进行分析的平台。

摘要

伤口愈合是一个复杂且多步骤的过程，涉及多种细胞类型、生长因子和化合物^1-3。由于其复杂性，体内实验是研究伤口愈合最全面的方法。目前已有多种可用于研究急性伤口愈合的体内模型，包括切口模型、切除模型、死腔模型和烧伤模型。死腔模型是一种人工的多孔植入物，用于研究组织形成以及各种物质对伤口的影响。常用的死腔模型包括聚乙烯醇（PVA）海绵、钢丝网圆筒、膨体聚四氟乙烯（ePTFE）材料以及Cellstick^1,2。

每种死腔模型都因其材料组成和植入方法的不同而具有各自的局限性。钢丝网圆柱模型在植入后存在渗入的滞后期，需要较长时间才能开始形成肉芽组织¹。伤口愈合的后期阶段最适合使用ePTFE模型进行分析^1,4。Cellstick模型是由硅胶管包裹的纤维素海绵，通常用于研究人类手术伤口及伤口渗出液²。聚乙烯醇（PVA）海绵仅适用于急性期研究，因为随着时间推移，它会引发异物反应，导致动物体内出现巨细胞反应⁵。与其他材料不同，PVA海绵易于插入和取出，由惰性且不可降解的材料制成，同时又足够柔软，可进行切片以用于组织学分析^2,5。

在伤口愈合研究中，聚乙烯醇（PVA）海绵对于分析肉芽组织形成、胶原沉积、伤口液成分以及各种物质对愈合过程的影响非常有用^1,2,5。除了用于研究伤口愈合的多种特性外，PVA海绵还被广泛应用于其他多种类型的研究中，例如肿瘤血管生成、药物递送以及干细胞存活与移植的研究^1,2,6,7。由于其高度可调节性、既往广泛的使用经验以及可重复的实验结果，PVA海绵是众多研究的理想模型^1,2。

本文将介绍在小鼠伤口愈合模型中，PVA海绵圆盘的制备、植入与回收方法（图1）。

方案

1. 海绵制备

1. 将海绵在0.9%（w/v）氯化钠水溶液中搅拌过夜以使其水化。
2. 通过高压灭菌对水化后的海绵进行灭菌。对于75 mL的样品，在121 °C下高压灭菌25分钟。

注意：以下所述的用处理剂加载海绵的步骤为可选操作。

3. 在超净台内使用无菌器械，用镊子从溶液中取出一块海绵。用镊子挤压海绵，并用真空吸头尽可能吸除海绵中的溶液。将挤干的海绵放入组织培养皿中，注意在各块海绵之间留出空间。可使用多个孔板以分隔不同的处理组。
4. 将处理溶液直接滴加到海绵的中心位置。溶液滴加后，用移液器吸头轻轻按压海绵，有助于海绵充分吸收溶液。注意：我们所使用的海绵直径为 6 mm，厚度为 2.75 mm，最多可容纳 25 μL 溶液。
5. 待所有海绵加载完毕后，可将孔板置于冰上保存，直至植入小鼠体内。

2. 手术步骤

1. 适当麻醉动物并给予预先镇痛药物。整个操作过程每只动物约需20分钟。对于一只30 g的小鼠，使用每分钟1.5升氧气混合1.5%异氟烷进行麻醉诱导和维持。当动物对夹趾反射测试无反应时，将其置于仰卧位的鼻罩中。使用电动剃毛器在肋骨下方腹部下部剃除约1英寸×1英寸的区域，并清除剪下的毛发。
2. 用聚维酮碘擦拭剃毛区域进行消毒，随后用70%酒精擦拭，重复此聚维酮碘-酒精消毒步骤三次。
3. 在拉紧皮肤的同时，使用手术刀做垂直切口，切口长度为拟植入海绵直径的1.5至2倍，注意避免切开体腔。
4. 用镊子夹住皮肤边缘，使用梅茨鲍姆剪刀沿切口两侧缓慢分离皮肤与肌肉组织。所形成的皮下袋应横跨小鼠体宽，从肋骨区域延伸至后肢。
5. 用镊子从两侧夹起第一块拟植入动物体内的海绵，将其转移至直头镊子中，使海绵被从顶部和底部夹持。
6. 用镊子夹住皮肤边缘并提起，以便插入海绵。缓慢插入海绵，尽量避免接触皮肤或下方肌肉组织，因为一旦海绵接触组织后将难以移动。对所有海绵重复此步骤。
7. 所有海绵植入后，放置两到三针缝合线关闭切口。使用镊子将切口两侧对齐，将缝线穿过双层皮肤组织。第一结扣收紧至刚好闭合皮肤边缘即可，然后从相反方向再打一个结扣完成方结，此次将结拉紧。再打两个方结以完成缝合（图2）。根据需要增加缝合针数以完全闭合切口。也可使用其他伤口闭合方法，如皮肤粘合剂（Dermabond）、伤口夹或缝合钉。
8. 将动物从麻醉系统中移出，并在苏醒期间进行监测。动物应能迅速恢复自主活动，并回到术前的活动水平。确保其能够顺利接触到食物和饮水。可在笼底放置一些湿润的食物以帮助恢复。每日继续监测动物是否有痛苦或不适的迹象，并检查切口部位是否出现感染、炎症或裂开。如发现任何恢复相关的并发症，应及时采取适当处理措施。

3. 可选注射

注意：将海绵植入动物体内后，可向其中注射细胞、药物、生长因子等溶液。这有助于分析在不同递送时间和给药方案下所注射物质的作用效果。若进行注射操作，应始终设置对照组。

1. 为了将目标溶液注入海绵中，首先确定需要给予小鼠的物质剂量。该物质需要浓缩，以确保注射体积小于海绵总容量的一半。
2. 准备用于注射的注射器（对于小鼠，我们使用28 G针头）。
3. 将接受注射的动物置于麻醉状态。
4. 当动物对夹捏测试不再有反应时，即可进行注射。
5. 进行注射时，以45°角将针头穿过海绵中心处的皮肤，然后将针头插入海绵，深度约为海绵厚度的一半。目标是将溶液准确注入海绵的正中心。
6. 为确认针头已进入海绵，缓慢垂直提起针头。如果针头位于海绵内，海绵应随针头一同上移。
7. 缓慢向海绵内注射，然后撤出针头。如果存在多个需要注射的海绵，先前注射部位可能会有部分液体被挤出。

4. 海绵移除

注意：在移除海绵时，需格外小心地操作海绵。避免使用手术器械刺穿海绵，并注意避开周围组织中的主要动脉，以防大量血液渗入海绵。

1. 动物安乐死后，用镊子夹住皮肤，在靠近海绵处做切口，取出海绵。
2. 小心将海绵与其周围的包膜分离，避免采集海绵周围多余的组织。对于药物递送或形态测量等检测，切除的精确度要求较低。

5. 代表性结果

取出的海绵可根据将要进行的分析类型，在不同条件下保存。对于切片，回收的海绵可包埋于适合冷冻的介质中，例如最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂，或置于10%福尔马林中，以便后续包埋并进行石蜡切片（图3A和B）。切片效果最佳的方法是将海绵沿直径方向切成两半，并将切面朝下包埋（图4A和B）。应切取包含海绵完整宽度的切片。图3A展示了两个海绵，左侧海绵包埋/切片方式不正确，右侧海绵则处理正确。

用于分析时，可将海绵置于离心管中，并在 -20 °C 下保存，直至准备进行处理。若需进行 RNA 及定量实时 PCR 分析，应将海绵放入离心管中，迅速冷冻后于 -80 °C 保存。此外，可使用 RNA 保护剂（如 QIAGEN 公司的 RNAlater）以稳定 RNA，从而在较高温度下安全储存。通过将海绵挤压于离心管上方，可收集创面渗出液，并将多个海绵的液体合并，以获得具有代表性的样本。还可从海绵中提取活细胞，例如成纤维细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。取出海绵后，可将其置于适合目标细胞类型的适当培养基中。可通过物理方法（如剪碎）或酶解方法（如胶原酶消化）处理海绵以释放细胞。

图 1。 三种不同尺寸的脱水聚乙烯醇（PVA）海绵圆盘。

图 2。 小鼠伤口愈合模型图像，显示侧向伤口及四个聚乙烯醇（PVA）海绵的位置。

图 3. (A) 包埋石蜡的海绵切片在 4 倍放大下的 H & E 染色，以及 (B) 10 倍放大下的三色染色。

图 4. (A) 沿直径切开的海绵图像。(B) PVA 海绵半片，切面朝下嵌入 OCT 中。

讨论

伤口愈合的海绵模型有多种变异形式；可在包括人类在内的许多不同物种中进行，海绵也可植入背部^1,2,8。在人类及某些其他物种的研究中，可能需要将海绵置于多孔硅胶管中，以防止海绵被包囊化，并便于取出^4,8。海绵植入的位置可根据预期结果和技术人员的操作技能进行调整。背部植入可能导致海绵在皮下移动，而腹侧植入则更具挑战性，因其存在切开至腹腔的风险。可通过导管装置连接海绵，实现持续且可控的药物递送，从而避免多次注射⁹。较小的管状海绵甚至可通过针头注射植入⁸。海绵的组成材料不仅限于聚乙烯醇，还可由多种材料单独或组合制备而成⁷。

在动物体内进行海绵的制备和放置时，操作的一致性和正确理解至关重要。如果海绵是从片材上切割而成，则必须保证重量相近，以确保可比性。如果需要在海绵中加载细胞或处理物质，则每个海绵中加入的量必须精确。海绵在动物体内放置的位置会影响愈合过程，且距离头部越远，愈合能力越弱^1,10。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙烯醇海绵	Medtronic Inc.	CF120	海绵的尺寸和孔隙度取决于具体实验需求
15号手术刀片	BD Biosciences	371115
梅氏剪刀	Thermo Fisher Scientific, Inc.	79-211
止血钳	Fine Science Tools	13004-14
持针器	Fine Science Tools	12004-16
5-0 尼龙缝线	Ethicon Inc.	698
O.C.T. 包埋剂	Tissue-Tek	4583