一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

摘要

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。

摘要

当T细胞受体（TCR）与抗原提呈细胞（APC）表面表达的主要组织相容性复合体（pMHC）蛋白所结合的抗原肽片段结合时，信号转导即被启动。TCR复合物由配体结合亚单位TCRαβ异源二聚体组成，该二聚体通过非共价方式与CD3二聚体（包括εδ和εγ异源二聚体以及ζζ同源二聚体）相连¹。受体结合后，CD3的ζ链被Src家族激酶Lck磷酸化，从而招募Syk家族激酶Zap70，后者进一步被Lck磷酸化并激活。随后，Zap70磷酸化衔接蛋白LAT和SLP76，启动近端信号复合物的形成，该复合物包含大量不同的信号分子²。

该复合物的形成最终导致钙离子和Ras依赖性转录因子的激活，进而启动一系列复杂的基因表达程序，从而引发T细胞分化²。TCR信号（以及由此产生的分化状态）受到多种其他因素的调控，包括抗原效力以及与共刺激/共抑制受体、趋化因子受体和细胞因子受体之间的串扰^3-4。因此，在不同刺激条件下研究近端信号复合物的空间和时间组织，对于理解TCR信号通路及其受其他信号通路的调控机制至关重要。

研究T细胞中T细胞受体（TCR）在质膜上启动信号传导的一个非常有用的模型系统是玻璃支撑的脂双层，如先前所述^5-6它们可被用于向T细胞呈递抗原性pMHC复合物、黏附分子及共刺激分子，作为人工抗原提呈细胞（APCs）。通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）对T细胞与脂双层之间的相互作用进行成像，可将激发光限制在玻璃与细胞表面之间约100 nm的范围内。 ^7-8这使得我们能够主要对细胞膜上的信号事件进行成像。由于我们关注的是信号蛋白向TCR复合物的募集过程，因此我们描述了一种双相机全内反射荧光（TIRF）成像系统，可同时并实时观察用荧光标记的H57抗体Fab（抗原结合片段）（该抗体特异性识别TCRβ，由杂交瘤H57-597，ATCC，ATCC编号：HB-218纯化获得）标记的TCR，以及带有GFP标签的信号蛋白。由于T细胞及其TCR上发生的信号事件具有高度动态性，这种成像策略十分必要。该成像方式已使研究人员能够对单个配体进行成像 ^9-11 以及信号分子向活化受体的募集，是研究生物化学的优良系统 原位^12-16.

方案

实验步骤：

1. 使用 Amaxa 小鼠 T 细胞核转染试剂盒进行转染

本文描述了使用 Amaxa 小鼠 T 细胞核转染试剂盒，将编码 GFP 标记的信号分子的表达质粒转染至初始态或体外活化的原代 T 细胞中的方法。T 细胞的体外活化通过使用负载肽段的脾源性抗原呈递细胞（APC）进行，具体操作如前所述⁷。本研究中使用的所有 T 细胞均表达 AND TCR，该受体可识别与 MHC 分子 I-E^k 结合的 MCC 肽段（88-103）。转染操作基本遵循制造商的推荐方案；然而，本文提供了一些有助于提高转染后 T 细胞存活率的实用技巧。与初始 T 细胞相比，体外活化的 T 细胞在转染后的存活率和转染效率均显著更高。

1. 开始前，为每项转染准备2 mL添加物T细胞培养基，向其中加入20 μL的培养基组分A和20 μL的组分B，以及100 μL胎牛血清（5%）。将培养基置于12孔板中，在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中平衡至少1小时。或者，可预先配制含5%血清和组分A的培养基分装液并冷冻保存。若采用此方法，则解冻所需数量的分装液，加入组分B，并进行平衡处理。

- 转染后细胞重悬时，培养基的预平衡极为重要，因为若培养基温度过低或pH值偏离7.2，均会导致细胞死亡。

2. 接下来，制备转染混合物。将 82 μL 小鼠 T 细胞核转染溶液与 18 μL 补充剂 2 以及 5 μg 质粒 DNA（浓度不低于 0.5 μg/μL）混合。通过轻弹离心管或使用微量移液器充分混匀。

- 对于每种用于转染的质粒构建体，必须针对固定数量的细胞进行质粒剂量的滴定。对于某些较大的构建体，可能需要更多的DNA。DNA应不含内毒素。

3. 将500万至1000万个细胞转移至15 mL离心管中。室温下以600 rpm离心5分钟。使用真空抽吸装置尽可能吸除上清液。

- 厂家建议以低于90×g的离心力离心细胞；在我们的实验中，该速度对应75×g。选择适当的相对离心力（RCF）以获得细胞沉淀可能是最关键的变量，因为低RCF离心可避免细胞膜受损。

4. 通过轻柔缓慢地用移液枪吹打细胞沉淀，将其重新悬浮于转染混合物中，直至无明显细胞团块存在。通常将细胞完全通过移液枪头吸取不超过3-4次即可完成。
5. 使用移液枪小心地将细胞悬液转移至经认证的Amaxa电转杯中，确保无气泡产生。盖上电转杯盖。
6. 在Nucleofector仪器上选择程序X-001。将电转杯插入Nucleofector电转杯架中，并启动所选程序。

- 转染细胞后，应立即将其转移至预先平衡的培养基中。制造商建议，细胞在核转染试剂中放置的时间不应超过15分钟。

7. 将比色皿和预平衡的完全培养基移至超净台中。使用提供的塑料移液管，向比色皿中加入约 500 μL 培养基，并将细胞悬液逐滴转移至培养板中的培养基内。
8. 成像前将细胞在 37 °C 下孵育 4 小时。初始T细胞则应在 30 °C 而非 37 °C 下孵育，以维持其对抗原的反应性。

- 通常孵育三到四小时后，T细胞即可检测到GFP标记蛋白的表达。我们选择在此时间点进行成像，是因为此时表达水平较低，过表达带来的假象可降至最低。然而，如果需要过表达某种特定蛋白，则应在转染4小时后将T细胞从Amaxa培养基中移出。具体操作是再次以较低的相对离心力（RCF）离心收集细胞，并将细胞重悬于预先平衡的T细胞培养基中，该培养基需添加50 U/mL白细胞介素2（IL-2），细胞密度为每毫升200万个细胞。

2. 全内反射荧光显微镜

全内反射荧光显微镜的描述：

1. 总体配置：光学组件基于一台原本配备 Olympus TIRF 模块的 Olympus IX71 荧光显微镜构建。我们很快发现，该模块在单次准直状态下无法实现不同波长激光线的共焦准直，因而存在色差效应。因此，该模块无法支持使用不同激发波长进行同时的全内反射荧光（TIRF）成像。为此，我们着手构建一套定制的 TIRF 装置，以最大限度减少系统中的色差效应，具体细节将在下文详述。本文所述方法最初为 150 倍放大、数值孔径（NA）1.45 的 TIRFM 物镜（Olympus）开发，但同样适用于 60 倍放大、NA 1.45 的物镜版本。对于宽场照明，显微镜连接至金属卤化物 Lambda-XL 光源，并配备装有激发滤光片的激发滤光轮（Sutter Instruments）。为实现样品载物台相对于物镜的自动定位，显微镜配备了电动控制的 XY 平移台和压电控制的 Z 轴载物台（ASI）。图像采集使用两台相同的 QuantEM 电子倍增（EM）CCD 相机（Photometrics）。这些相机的像素尺寸与 150 倍 TIRF 物镜提供的放大倍数高度匹配，最终实现每像素 0.1 μm 的分辨率。EMCCD 相机还具备足够的灵敏度，可用于观察低表达水平的 GFP 转染细胞。
2. 激光器：用于 TIRF 照明的系统包含 5 台激光器，共提供 6 条激光线（405、440、488、514、561 和 640 nm），并通过单模光纤（Solamere Technologies）耦合输出。氩离子激光器和 561 nm 半导体泵浦固体（DPSS）激光器（输出 488、514 和 561 nm）经由声光可调谐光纤（AOTF）进行强度调控，而半导体激光器（405、440 和 640 nm）的强度则通过调节其电源电压进行控制。AOTF 上的电压以及半导体激光器的电源电压由数据采集卡（DAC）板（Measurement Computing）通过 MetaMorph 软件（Molecular Devices）进行控制。半导体激光器的耦合效率为 30%，而由于氩离子和 DPSS 激光器的光束直径较小，其耦合效率约为 60%。
3. TIRF 模块：如前所述，为实现 TCR 及其相关信号分子的同时成像，必须具备色差校正的 TIRF 照明系统，且在采集不同波长的荧光发射时无需重新准直或重新对焦。TIRFM 采用通过物镜照明的方式实现，如先前所述¹⁷。将输送激光的光纤电缆固定于一个配备 XY 光纤夹持器的光纤耦合装置中，该装置安装在由微米驱动的光学导轨上，用于 Z 方向调节（Thorlabs）。为实现 TIRF 照明，使用两片透镜系统（L1（准直透镜）和 L2（聚焦透镜），见图 1）将激光束聚焦于物镜的后焦平面，从而使光束以准直状态从物镜射出。这确保了从物镜射出的所有光线相对于样品平面具有相同的角度。光纤末端被置于准直透镜的焦点处。通过沿光学导轨相对于准直透镜移动微米调节装置（Z 方向），可调节光束焦点，并通过 XY 调节旋钮调整光束的 X 和 Y 位置。由于 150 倍物镜的后光圈极小，我们发现要实现 TIRF，后焦平面上的激光光斑必须足够小。为达到产生小光斑所需的聚焦效果，必须使用短焦距透镜（Keir Neumann，个人通讯）；因此，我们采用了一块焦距约为 108 mm 的聚焦透镜，并将其置于物镜前的二向色镜立方体中。准直透镜则更靠近引入 TIRF 照明的分束器。为最大限度减少不必要的色差效应，我们为准直透镜和聚焦透镜均采用了消色差双合透镜（由两种不同折射率材料制成的透镜元件熔合而成的色差校正透镜），并带有抗反射涂层（JML Optical）。可通过检查光束在后光圈中心位置时是否以准直状态从物镜射出来验证焦点，此时光束应在房间天花板上形成一个紧密的光斑。随后将聚焦光斑的位置移向光圈边缘（Y 方向），使光束在像平面上以大角度会聚，最终达到全内反射的临界角。使用这些光学组件，我们在同一准直状态下实现了 442 至 640 nm 所有波长的同步准直。因此，单次光学对准即可实现多波长的同时 TIRFM 成像。
4. 双相机装置：通过构建双相机系统，利用二向色镜将发射光分为两个波长范围，实现了来自两种不同荧光团的荧光发射的同步采集（图 2）。发射光从物镜反射后，从显微镜右侧端口射出。由于大多数物镜为无限远校正型（成像于无穷远），需使用管镜来聚焦图像。为同时操控两个发射波长，右侧端口的管镜被移除。安装了一个带有 C 接口螺纹的定制适配器（Sutter Instruments），并连接至二向色镜支架（Edmund Optics）。在该支架中安装了可将 GFP 发射光与用于标记 TCR 的有机染料（Alexa546、Alexa647 等）发射光分离的二向色镜。该模块之后，在两条光路中均依次连接了管镜支架、发射滤光片支架和延长管。管镜（TL1 和 TL2（图 2））的焦距为 180 mm。通向 EM CCD 相机的延长管间隙用黑纸覆盖，以屏蔽杂散光。为便于两个通道的对准，相机安装在两个定制的 XYZ 平移台（Holmarc Products）上。

以下我们介绍如何对显微镜进行调整，以实现双通道同步成像。相关步骤包括调整全内反射荧光（TIRF）照明、调节激光功率，以及利用亚分辨率微球对两个输出图像进行对齐。

1. 开始之前，打开显微镜所有组件的电源。然后启动计算机和软件，并确保软件能够识别所有硬件组件。
2. 作为共定位标准使用时，将1 μL亚分辨率（0.2 μm）Fluoresbrite多荧光微球稀释至2 mL PBS中，并将0.25 mL微球悬浮液加入Nunc Lab-Tek II 8孔腔室盖玻片系统的每个孔中。将腔室载玻片系统放置在物镜上方的平台上。将吸附在玻璃表面的微球调整至焦平面清晰对焦。
3. 利用XYZ光纤耦合装置的Y轴对准功能，调节激光光束位置，使其位于物镜后光瞳的中心。此步骤应在物镜处于玻璃平面清晰对焦的位置时进行。若光束未达到准直，需调节Z轴微调装置以实现完全准直。所有实验中将使用的激光谱线均需逐一检测其准直状态。在此阶段，使用激光功率计测量每条激光线的功率，并将其调节至每个通道20–30 μW。

-T细胞对激光辐射极为敏感，照射强度需限制在总共50 μW以内。

4. 使用TIRF照明在活体模式下采集微珠的图像。调节光纤耦合装置上的Y轴对准微米旋钮，使光束逐渐远离光路顶部移动，直至其相对于物镜光轴的角度接近90度。当达到全内反射（TIR）的临界角时，激光将不再从物镜射出。此时通过在盖玻片平面上下聚焦来判断TIRF对准情况。如果能够观察到悬浮在溶液中的微珠，则说明光束相对于物镜法线的角度仍需进一步增大。在正确的TIRF对准状态下，仅有一个光学平面处于焦点上（即仅能观察到吸附在盖玻片上的微珠）。当对表面染色并已在表面铺展的T细胞进行成像时，可实施更精细的TIRF对准检测。（参见第3.4点）。
5. 实现TIRF照明后，可对两个成像通道进行相互对准。聚焦于微珠，并比较两个通道所生成图像中可识别特征的位置。利用其中一个相机支架上的X轴和Y轴微调螺钉，将微珠的相对位置尽可能对齐。保存两个通道的图像。这些图像将用作共定位标准，以对齐两个通道。
6. 还需对相机进行对准，使其彼此之间达到齐焦（parfocal）。这可通过采集一组在Z方向上相隔100 nm的亚分辨率微珠的图像来实现。如果两个相机所捕获的微珠最大强度像素位于同一平面上，则表明它们已达到齐焦状态。

3. 成像

显微镜设置完成后，接下来需要制备流动腔室，其中包含玻璃支撑的脂双层，该脂双层如前所述呈现抗原和黏附分子⁶，随后对转染的T细胞与基底相互作用的过程进行全内反射荧光显微镜（TIRFM）观察。脂双层的已发表方案^5-6按原法执行，唯一不同的是：在流动腔室组装完成后，脂质体不再在盖玻片上孵育20分钟，而是在组装后立即向流动池中注入HBS-BSA缓冲液。

1. 组装一个流动室，其中玻璃盖玻片上形成含有 Ni-NTA 脂质的平面脂双层。通过其组氨酸标签将黏附分子 ICAM-1（100 个分子/μm²）和肽-MHC 复合物 MCC 负载的 I-E^k（5–10 个分子/μm²）整合到脂双层中。共刺激分子 CD80 通过 GPI 锚定方式加入（100 个分子/μm²）。
2. 将流动池置于显微镜载物台上并固定。连接厂家提供的加热装置以控制流动池温度。将物镜定位至脂双层区域，并将脂双层平面调至焦点。开启物镜和流动池的加热功能，使腔室温度稳定在 37 °C。
3. 转染的 T 细胞在 80×g 转速下离心收集，孵育 4 小时后重悬于 HBS-BSA 缓冲液中，并添加 10 μg/mL H57 Fab 或 20 μg/mL H57 单链可变片段（scFv）以标记 TCR。随后将细胞注入流动池中。由于 Fab 或 scFv 具有较高的解离常数，成像过程中需持续存在于溶液中；其在培养基中的存在不会显著增加背景信号，因为 TIRF 的激发场非常薄。
4. 设置成像条件，使双通道实时采集可显示 TCR 和 GFP 通道的实时预览，有助于寻找转染细胞。通过向上调节焦平面至玻璃界面以检测是否存在侧膜染色，从而确认 TIRF 照明效果。若侧膜未进入焦点，则表明 TIRF 对准良好。随后对转染细胞进行单次或序列成像，以生成视频。

4. 图像处理与数据分析

该软件将两个相机的图像输出到单个画幅中。每个相机的输出为 512 × 512 像素，因此输出图像的尺寸为 1024 × 512 像素。首先需要将图像拆分为对应于两个相机的独立帧。来自两个通道的亚分辨率微珠图像被叠加，以确定对齐参数。我们系统的一个特定特征是其中一个通道相对于另一个通道存在 1 度的旋转（见图 3）。该旋转最可能的来源是相机支架。在此旋转基础上，还需在 X 和 Y 方向上进行进一步的相对线性变换，以实现微珠之间的精确对齐。每次实验中均会获取微珠图像，以确定两个通道对齐的精确参数。随后，将这些线性和旋转变换应用于所有图像，再进行图像分割算法处理和共定位分析。

5. 代表性结果

本文所述系统可适用于研究质膜上任何受体下游的信号传导过程。该系统在研究T细胞受体（TCR）信号传导时尤其具有信息价值，因为信号传导发生在光学可分辨的簇状结构中，即TCR微簇，或如近期研究所述，发生在内体中¹⁸。如果信号传导发生在低于分辨率极限的受体簇或非簇状分布的受体中，则需要进行额外实验以解释数据。如前所述，当TCR与肽-MHC复合物结合时，TCR复合物中的CD3链会被Src家族激酶Lck磷酸化。磷酸化的CD3ζ链随后招募Syk家族激酶Zap70。因此，通过观察Zap70的招募情况，可反映CD3ζ链的磷酸化状态。TCR刺激强度可通过使用在TCR接触残基位点发生突变的肽段进行调节，这类肽段被称为改变肽配体（altered peptide ligands, APLs）。图4展示了一项代表性实验，其中激动性肽段能够强有力地将Zap70招募至TCR微簇，而低效肽段T102L则无法将Zap70招募至TCR微簇，表明在此情况下CD3ζ链未被磷酸化。我们之所以能够得出这一结论，是因为仅需观察通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）即可清晰检测到的TCR簇中Zap70的招募情况。实验中采用自动分割算法对每个细胞中Zap70微簇的数量进行计数。补充视频中还展示了TCR与Zap70相关荧光信号的同步成像结果。请注意片状伪足的动态特性。

图 1. 自制全内反射照明装置的图像与示意图。图 A 显示了安装在显微镜上的全内反射照明装置的照片，图 B 为该装置的示意图，展示了光路路径。示意图和图像中显示了集光镜、分光镜、带有 X、Y 和 Z 调节功能的光纤耦合装置、准直透镜 L1，以及安装在二向色立方体内的聚焦透镜 L2 和全内反射物镜的位置。插图为聚焦透镜安装在二向色立方体内的局部放大图。

图 2. 双相机系统的图像与示意图。图 A 显示了连接在显微镜上的双相机系统的实物照片，图 B 为该系统的示意图。示意图和图像展示了物镜、反射镜、二向色镜、管镜 TL1 和 TL2、发射滤光片 F1 和 F2，以及安装在支架上并配有各自 X、Y 和 Z 调节装置的两个相机 C1 和 C2 的位置。

图3. 使用亚分辨率小球对两个通道进行对齐。图A和图B显示了对齐前（图A）和对齐后（图B）亚分辨率小球的叠加图像。图A显示其中一个通道相对于另一个通道发生了旋转。图C和图D分别为图A和图B图像的局部放大区域。图E显示未经处理的双通道细胞叠加图像。将图D中获得的对齐参数应用于图F所示图像。请注意，图F中来自两个通道的片状伪足完全对齐，而图E中则未对齐。所有图中比例尺为4 μm。

图4. 不同APL刺激下Zap70向TCR微簇的募集 体外 活化的T细胞被转染了编码与GFP融合的Zap70的质粒，并在含有6个分子/μm²的Ni-NTA玻璃支撑双层膜上孵育² 肽负载的His标签-I-E^k，100 个分子/μm² Alexa647标记的His标签ICAM-1和每平方微米100个分子² GPI锚定的CD80。所加载的肽段如插图所示。ICAM-1 指含有每平方微米100个分子的双层膜中的细胞² 使用Alexa-647标记的His标签ICAM-1进行双通道同步采集全内反射荧光显微镜（TIRF）成像，同时持续存在Alexa546标记的H57 Fab片段（非阻断型）用于标记TCR。细胞与脂双层接触后最长观察一小时。采用自动簇计数软件分析每个细胞中Zap70簇的数量，每种情况至少分析40个细胞。所有图像的比例尺为2 μm。

图 5. 使用两种不同类型相机的双相机系统校准。该图显示了利用双相机系统对亚分辨率荧光小球成像后进行校准叠加的结果，其中两个相机具有不同的像素尺寸（绿色：6.45 μm 像素尺寸，采用 2×2 binning 模式；红色：16 μm 像素尺寸，未采用 binning）。插图为视野中心方框区域的放大视图。比例尺：5 μm。

补充视频。 Zap70 对激动型肽刺激下 TCR 微簇的募集。体外活化的 AND T 细胞转染了编码与 GFP 融合的 Zap70 的质粒，并在含有 6 个分子/μm² 肽负载的 His 标签 I-E^k、100 个分子/μm² Alexa647 标记的 His 标签 ICAM-1 以及 100 个分子/μm² GPI 锚定 CD80 的玻璃支撑 Ni-NTA 双层膜上孵育。在持续存在 Alexa546 标记的 H57 Fab 片段（非阻断性）以标记 TCR 的条件下，进行双通道同步采集的全内反射荧光显微镜观察。一个转染细胞视野被连续成像 40 次，每帧时间分辨率为 10 秒。比例尺为 2 μm。点击此处查看补充视频。

讨论

本文介绍了一种利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）和玻璃支持的脂质双层作为人工抗原呈递细胞（APC）来研究抗原特异性原代小鼠T细胞信号转导的系统。该技术依赖于在这些细胞中成功表达GFP标记的蛋白。转染T细胞始终是一项具有挑战性的任务。通常采用电穿孔或使用逆转录病毒或慢病毒进行基因递送。这两种方法各有优劣，没有一种方法在所有方面都优于另一种。我们发现电穿孔具有以下优点：1）不需要细胞处于活跃分裂状态（逆转录病毒需要，而慢病毒不需要）；2）通过调整细胞转染后成像前的孵育时间，可以调控蛋白的表达水平。最大的缺点是，我们发现很难在原代细胞中表达分子量较大的蛋白。我们已建立一种方法，可在电穿孔后获得很高的细胞存活率，因此该方法也适用于实现siRNA介导的基因沉默。

我们还在此描述了一种定制的双通道同步采集TIRF显微镜，该显微镜具有色差校正功能，且无需针对不同波长进行单独准直。然而，这些功能在商业产品中已有提供。我们的系统基于该领域专家发表的TIRF显微镜原理构建，成本低于商业替代方案。本设计可能受到的一个批评是，我们对不同激发波长使用了相同的入射角，这将导致不同激发波长下的TIRF穿透深度不同。我们认为这种效应较小，因为隐逝波是一种指数衰减的场，而TIRF场的深度与波长呈线性关系。靠近玻璃表面的荧光分子在两种波长下的激光强度不会有任何差异。对于接近穿透深度的荧光分子，488 nm与640 nm两种波长间的强度差异为1.3倍，488 nm与561 nm两种波长间的强度差异为1.15倍。该系统还可与利用TIRF照明的超分辨率技术结合使用。

我们还描述了一个定制的双相机系统。与TIRF系统类似，此类装置也有商业化的版本可供选择。我们的系统具有更换滤光片和二向色镜的灵活性，因此可用于不同波长组合的实验。该系统的缺点是需要旋转一度以对齐两幅图像。此问题可通过使用压电驱动且具备旋转对准功能的相机支架来解决。我们已成功在此显微镜上实现了双相机系统，其中两个相机型号不同，像素尺寸也不同。如果某一应用需要在一个通道中具有高灵敏度，而在另一通道中具有大动态范围（而这些特性通常难以在同一台相机中同时具备），则此类系统将非常有用。我们使用Photometrics HQ-2相机在2×2 binning模式下工作，结合像素尺寸为16 μm的Photometrics Quant-EM相机，使HQ-2的有效像素尺寸达到12.9 μm。Quant-EM相机采用焦距为180 mm的管镜，而HQ-2相机则采用焦距为145 mm的管镜。HQ-2相机由Metamorph软件控制，Quant-EM相机则通过另一台计算机上的Micro-Manager软件以外部触发模式进行控制。外部触发信号由测量计算公司的DAC数据采集板的数字输出提供，并在Metamorph软件的“配置照明设置”中被设置为额外的快门控制。管镜焦距之比与有效像素尺寸之比相匹配。典型的对齐效果如图5所示。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠T细胞Amaxa核转染试剂盒	Lonza Inc.	VPA-1006
PureLink HiPure质粒中量提取试剂盒	Life Technologies	K2100-05	用于无内毒素DNA制备
Amaxa核转染装置	Lonza Inc.	AAD-1001
重组小鼠IL-2	PeproTech Inc	212-12
Fluoresbrite多功能荧光微球 0.20μm	Polysciences, Inc.	24050-5
Lab-Tek II 8孔腔室盖玻片	Thermo Fisher Scientific, Inc.	155409