方法文章

小鼠中枢神经系统干细胞移植的多模态成像

DOI：

10.3791/3906

⸱

2012年6月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Hematology, University of Antwerp, 2Bio Imaging Lab, University of Antwerp

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种优化的多模态成像流程，用于在啮齿类动物脑内对细胞移植物进行多模态成像，包括：（i）活体生物发光成像与磁共振成像，以及（ii）死后组织学分析。在单个动物上联合使用这些成像方式，可实现对细胞移植物的高分辨率、高灵敏度和高特异性的评估。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在过去的十年中，干细胞移植作为多种疾病在临床前和临床研究中的一种主要或辅助治疗手段，受到越来越多的关注。然而，迄今为止，关于干细胞移植后功能改善和/或组织再生的研究结果仍存在较大差异。通常可观察到一定的临床益处，但对其潜在机制尚缺乏深入理解1。因此，众多研究致力于开发不同的分子成像技术，以监测干细胞移植情况，最终准确评估移植干细胞的存活、命运及其生理状态，以及/或其微环境的变化。分子成像所检测到的一个或多个参数的变化可能与所观察到的临床效应相关。在这一背景下，我们的研究聚焦于联合使用生物发光成像（BLI）、磁共振成像（MRI）和组织学分析来评估干细胞移植效果。

BLI 通常用于在细胞移植后无创地进行细胞示踪，并随时间监测细胞存活情况2-7，其原理基于一种生化反应：表达荧光素酶报告基因的细胞在与其底物（例如 D-荧光素）相互作用后能够发光8, 9。另一方面，MRI 是一种具有临床适用性的非侵入性技术10，可用于高分辨率精确定位细胞移植物11-15，尽管其灵敏度在很大程度上取决于细胞标记磁共振成像对比剂后所产生的对比效果。最后，死后组织学分析是验证非侵入性技术所获得研究结果的首选方法，具有最高的分辨率和灵敏度。此外，终点组织学分析可基于荧光报告蛋白的使用和/或通过特异性抗体对细胞进行直接标记，对移植物细胞和/或周围组织进行详细的表型分析。

综上所述，本文通过直观展示生物发光成像（BLI）、磁共振成像（MRI）和组织学技术的互补性，揭示了小鼠中枢神经系统（CNS）内干细胞移植后与干细胞和/或微环境相关的不同特征。以骨髓来源的基质细胞为例，这些细胞经基因工程改造后可表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和萤火虫荧光素酶（fLuc），并标记了蓝色荧光的微米级氧化铁颗粒（MPIOs），将其移植到免疫功能健全的小鼠中枢神经系统中，并通过BLI、MRI和组织学方法对移植结果进行监测（图1）。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 细胞准备

  1. 应使用经过基因工程改造、可表达荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白报告蛋白的体外培养干细胞群体开展实验。本研究采用如Bergwerf先前所述的表达荧光素酶/eGFP的小鼠骨髓来源基质细胞（BMSC-Luc/eGFP） 等2, 5.
  2. 细胞标记前两天，将BMSC-Luc/eGFP细胞以8 x 10⁵的密度接种5 每T75培养瓶接种细胞，使用15 ml添加1 μg/ml嘌呤霉素的完全扩增培养基（CEM）。
  3. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养细胞 48 小时2.
  4. 加入 5 x 106 每毫升培养基中加入 Glacial Blue 微米级氧化铁颗粒（GB MPIO），加入至正在生长的细胞培养物中（总量：75 x 10）6 每15 ml培养基中的颗粒数（置于T75培养瓶中）。
  5. 孵育16小时，以通过内吞作用促进颗粒摄取。
  6. 洗去残留颗粒，继续培养细胞24小时，以获得细胞汇合度及GB MPIO的均匀分布。
  7. 通过荧光显微镜观察并计数eGFP+细胞中eGFP+与GB MPIO+细胞占总eGFP+细胞数量的比例，以验证颗粒摄取情况。
  8. 用 10 ml PBS 将 GB MPIO 标记的 BMSC-Luc/eGFP 细胞洗涤两次，经胰蛋白酶-EDTA 处理（每 T75 培养瓶加入 5 ml，作用 5 分钟）后收集细胞。
  9. 洗涤收获的细胞，并重悬于终浓度为 133 x 106 细胞/毫升 在 PBS 中。
  10. 将细胞置于冰上直至移植。

2. 小鼠中枢神经系统内的细胞移植

  1. 通过腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（16 mg/kg）混合物使小鼠麻醉。
  2. 等待5分钟，直至小鼠完全入睡。
  3. 剃除小鼠头部毛发，以便进行无菌操作。
  4. 将小鼠固定于立体定位仪中。
  5. 对皮肤进行消毒，并润湿小鼠眼睛以防止脱水。
  6. 沿中线做头皮切口以暴露颅骨，并使用牙科钻头在以下坐标位置钻孔：前囟后方2 mm，外侧2 mm。
  7. 短暂涡旋混匀细胞悬液，然后用注射器吸取细胞悬液。
  8. 将注射器针头置于硬脑膜下2.5 mm深度，静置1分钟以平衡压力。
  9. 使用自动微量注射泵，在硬脑膜下2 mm深度以0.70 μl/min的速度注射3 μl细胞悬液（含4 × 105 个细胞）。
  10. 额外等待5分钟，以防止注入的细胞悬液回流。
  11. 缓慢撤出针头，在缝合皮肤前对伤口边缘进行消毒。
  12. 皮下注射300 μl 0.9% NaCl溶液以防止脱水，并将小鼠置于加热灯下使其从麻醉中恢复。根据机构标准给予术后镇痛处理。

3. 体内 生物发光

  1. 通过3%异氟烷与氧气的混合气体使小鼠麻醉。
  2. 将小鼠置于光子成像仪中，并将麻醉水平降至1.5%异氟烷与氧气。
  3. 以每公斤体重150 mg的剂量静脉注射D-荧光素。
  4. 使用Photo Vision软件采集5分钟的图像。
  5. 使用M3vision软件进行图像处理。通过固定的感兴趣区域对检测到的信号进行定量分析。

4. 体内 磁共振成像

  1. 使用 O2:N2O（3:7）混合气体中含 3% 异氟烷对小鼠进行麻醉。
  2. 将小鼠置于水平 9.4T 磁共振系统的固定器中，并将麻醉水平降低至 O2:N2O（3:7）混合气体中含 1% 异氟烷。
  3. 润湿小鼠眼睛以防止脱水，连接直肠探头以监测体温，并将传感器置于小鼠腹部下方以监测呼吸频率。
  4. 维持呼吸频率在 110 ± 10 次/分钟，并将体温控制在 37 ± 0.5 °C 的狭窄范围内。
  5. 将表面射频线圈置于小鼠头部上方，并将小鼠置于磁体中心位置。
  6. 采集一组 10 张冠状面 T2 加权自旋回波（SE）图像以获取特定解剖信息，同时采集 T2* 加权梯度回波（GE）图像以研究干细胞迁移，面内分辨率为 70 μm2。序列参数设置如下：重复时间（TR）：500 ms，回波时间（TE）：8 ms（GE 序列）；重复时间（TR）：4200 ms，回波时间（TE）：12.16 ms（SE 序列）；视野（FOV）：18×18 mm2，矩阵：256×256，层厚 1 mm，层间距 1 mm（使用 Paravision 5.1 软件）。
  7. 使用 Amira 4.0 软件进行数据处理。

5. 尸检组织学

  1. 通过吸入异氟烷（4%）、氧气（0.5 L/min）和氮气（1 L/min）的混合气体，使小鼠深度麻醉2分钟。通过颈椎脱位法处死小鼠。
  2. 取出小鼠脑组织，并将其固定于含4%多聚甲醛的PBS溶液中，固定2小时。
  3. 将脑组织依次置于不同浓度梯度的蔗糖溶液中进行脱水处理：在含5%蔗糖的PBS中放置2小时，随后在含10%蔗糖的PBS中放置2小时，最后在含20%蔗糖的PBS中过夜。
  4. 使用液氮冷冻脑组织，并将组织储存在-80 °C条件下，直至切片。
  5. 使用冷冻切片机将脑组织切成10 μm厚的切片。
  6. 使用荧光显微镜对未染色的冷冻切片进行观察，检测GB MPIO颗粒产生的蓝色荧光以及表达eGFP的细胞产生的绿色荧光。
  7. 对未染色的冷冻切片进行观察，检测炎症细胞产生的绿色/红色背景荧光。
  8. 进行进一步的免疫组织化学和免疫荧光染色，以鉴定与细胞移植物相互作用的内源性细胞群体（例如小胶质细胞、星形胶质细胞、T细胞等）。

6. 代表性结果

我们在此直观展示了一种优化的操作流程，用于在小鼠中枢神经系统（CNS）中成功实现表达荧光素酶/eGFP的（干细胞）细胞群的多模态成像。首先，所述的GB MPIO标记方法可实现对BMSC-Luc/eGFP细胞的高效标记，该标记效果可通过荧光显微镜轻松验证图2A）。接下来，将经GB MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP移植至小鼠中枢神经系统后，可通过生物发光成像持续监测细胞移植物的存活情况 体内 基于荧光素酶活性的生物发光成像（BLI）图2B）。此外，可通过以下方法监测移植细胞的精确定位： 体内 基于GB MPIO铁含量的MRI图2C最后，组织学分析可用于验证生物发光成像（BLI）和磁共振成像（MRI）所获得的结果。通过随时间推移eGFP表达保持稳定，证实了稳定的存活状态。图 2D）。通过eGFP表达细胞与蓝色荧光MPIO的共定位，可精确定位并评估移植细胞的存活情况。此外，干细胞的双重荧光标记可降低因炎性细胞产生的背景荧光而导致假阳性结果的可能性。5.

细胞标记、移植、活体BLI/MRI示意图；显微镜观察、成像、组织学分析。
图1. 操作流程概览

  1. 细胞标记：将 BMSC-Luc/eGFP 细胞以每毫升培养基 5 × 106 个 GB MPIO 粒子进行标记。经 16 小时孵育及随后 24 小时静置后，收集细胞用于脑内移植。
  2. 细胞移植：将标记 GB MPIO 的 BMSC-Luc/eGFP 细胞移植至小鼠脑内，移植坐标为前囟后 2 mm，中线右侧 2 mm，硬脑膜下 2 mm。
  3. 活体 生物发光成像（BLI）：静脉注射 D-荧光素钠 150 mg/kg 体重后，使用 Photon Imager 采集 5 分钟内的发光信号。
  4. 活体 磁共振成像（MRI）：获取一组共 10 张冠状面 T2 加权自旋回波（SE）图像和 T2* 加权梯度回波（GE）图像，面内分辨率为 70 μm2。序列参数如下：重复时间（TR）：500 ms，回波时间（TE）：8 ms（GE 序列）；重复时间（TR）：4200 ms，回波时间（TE）：12.16 ms（SE 序列）；视野（FOV）：18×18 mm2，矩阵：256×256，层厚 1 mm，层间距 1 mm。
  5. 死后组织学分析：使用荧光显微镜检测 10 μm 厚的冷冻切片中表达 eGFP 及呈蓝色荧光标记的 BMSC。

用于研究分析的体外细胞标记、体内成像、MRI 和组织学示意图
图 2。 干细胞移植物的多模态成像

  1. Glacial blue (GB) MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP的直接免疫荧光显微镜观察
  2. 体内 注射了4x10⁶个细胞的动物的生物发光成像5 植入后第1周和第2周，GB MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP细胞。植入后第1周和第2周检测到的BLI信号的统计分析。数据表示为每秒每球面度每平方厘米光子数（ph/s/sr/cm²）的平均值2) 来自小鼠注射部位显示清晰BLI信号的固定感兴趣区域，计算5分钟时间段内的±标准误。
  3. 小鼠脑内GB部位经MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP（左图：(i) T2加权自旋回波图像和(ii) T2*加权梯度回波图像）与未标记的BMSC-Luc/eGFP（右图：(iii) T2加权自旋回波图像和(vi) T2*加权梯度回波图像）移植灶的冠状面二维磁共振成像。
  4. 植入后第2周对GB MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP移植物进行组织学分析。（i）通过直接免疫荧光分析定位表达eGFP及GB MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP移植物。（ii）（i）的高倍放大细节。（iii）GFAP抗原免疫荧光染色，显示在GB MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP周围形成星形胶质细胞瘢痕组织。（vi）Iba-1抗原免疫荧光染色，显示小胶质细胞侵入并包绕GB MPIO标记的BMSC-Luc/eGFP。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本报告中，我们描述了一种优化的实验方案，结合三种互补的成像技术（生物发光成像、磁共振成像和组织学）对免疫功能正常小鼠中枢神经系统内的细胞移植进行详细表征。通过细胞报告基因标记（基于萤火虫荧光素酶和eGFP基因修饰）与GB MPIO直接细胞标记相结合，可实现对干细胞移植物的精确定量与定位分析 体内.

为了对BMSC进行颗粒标记，建议使用GB MPIO颗粒（粒径1.63 μm）并结合其阴离子表面（含羧基取代基），以促进非吞噬性细胞通过内吞作用摄取这些颗粒16-18。然而需要指出的是，获得高标记效率所需的孵育时间取决于细胞类型。例如，吞噬性细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）能够更快地内化这些颗粒（孵育时间为0.5–1小时），而非吞噬性细胞（如BMSC或神经干细胞）则需要至少16小时的孵育时间才能实现有效标记。在进行细胞标记实验时必须考虑这一因素，并且应始终在实验前通过荧光显微镜和/或流式细胞分析确定标记效率。由于使用GB MPIO对细胞群体进行标记不会影响细胞活力、细胞增殖或细胞表型5，因此这些颗粒中同时包含氧化铁和荧光染料，为...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究工作得到了安特卫普大学研究基金 ID-BOF 2006（授予 PPo 和 AVdL）、比利时弗拉芒科学基金会（FWO-Vlaanderen，比利时）的研究基金 G.0136.11 和 G.0130.11（授予 AVdL、ZB 和 PPo）以及 1.5.021.09.N.00（授予 PPo）、弗拉芒科学技术研究所（IWT）SBO 研究基金 IWT-60838：BRAINSTIM（授予 ZB 和 AVDL）、比利时弗拉芒政府部分资助的 Methusalem 研究基金（授予 ZB）、欧洲共同体第六框架计划网络研究项目 DiMI（EC-FP6-NoE DiMI，项目编号 LSHB-CT-2005-512146）和 EMIL（EC-FP6-NoE EMIL，项目编号 LSHC-CT-2004-503569），以及比利时大学间吸引力中心计划 IUAP-NIMI-P6/38（授予 AVDL）的支持。Nathalie De Vocht 获得了弗拉芒科学基金会（FWO-Vlaanderen）的博士研究生奖学金。Peter Ponsaerts 是弗拉芒科学基金会（FWO-Vlaanderen）的博士后研究员。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IMDMLonza Inc.BE12-722F细胞生长培养基CEM的组分
胎牛血清GIBCO, by Life Technologies10270-106细胞生长培养基CEM的组分
马血清GIBCO, by Life Technologies1605-122细胞生长培养基CEM的组分
青霉素-链霉素GIBCO, by Life Technologies15140细胞生长培养基CEM的组分
两性霉素B（Fungizone）GIBCO, by Life Technologies15290-018细胞生长培养基CEM的组分
PBSGIBCO, by Life Technologies14190
嘌呤霉素（Puromycine）Invitrogenant-pr-1
胰蛋白酶（trypsin）GIBCO, by Life Technologies25300
GB MPIOBangs LaboratoriesME04F/7833
D-荧光素（D-luciferin）Promega Corp.E1601
氯胺酮（Ketamine, Ketalar）Pfizer Pharma GmbH
赛拉嗪（Xylazine, Rompun）Bayer AG
异氟烷（Isoflurane）Isoflo05260-05
0.9% NaCl溶液Baxter Internationl Inc.
多聚甲醛（paraformaldehyde）Merck & Co., Inc.1.04005.1000
蔗糖（sucrose）ApplichemA1125
微量注射泵（Micro-injection pump）KD scientificKDS100
光子成像仪（Photon imager）Biospace Lab
9.4T磁共振成像仪（9.4T MR scanner）Bruker CorporationBiospec 94/20 USR
BX51显微镜（BX51 microscope）Olympus CorporationBX51
Mycrom HM冷冻切片机（Mycrom HM cryostat）ProsanHM525
注射器（syringe）Hamilton Co7635-01
30号针头（30 gauge needle）Hamilton Co7762-03
Photo Vision软件Biospace Lab
M3vision软件Biospace Lab
Paravision 5.1软件Bruker Corporation
Amira 4.0软件Visage Imaging

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. Molecular imaging of stem cells. , (2008).
  2. Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice. BMC Biotechnol. 9, 1(2009).
  3. Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. Recognition of cellular implants by the brain's innate immune system. Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).
  4. Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS. J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).
  5. De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo. Mol Imaging Biol. , (2011).
  6. Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research. Stem Cell Rev. , (2011).
  7. Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice. Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).
  8. Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).
  9. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).
  10. Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. MR tracking of stem cells in living recipients. Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).
  11. Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat. 17, 1282-1291 (2009).
  12. Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain. Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).
  13. Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).
  14. Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).
  15. Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study. Neuroimage. 21, 311-317 (2004).
  16. Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study. Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).
  17. Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents. Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).
  18. Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. Cellular MR imaging. Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).
  19. Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells. Blood. 102, 867-872 (2003).
  20. Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. In vivo detection of single cells by MRI. Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).
  21. Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. MRI detection of single particles for cellular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).
  22. Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype. Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).
  23. Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses. Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).
  24. Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging. Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).
  25. Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).
  26. Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging. Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).
  27. Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector. Gene. 194, 115-123 (1997).
  28. Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87. Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).
  29. Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging. FASEB J. 20, 106-108 (2006).
  30. Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy. Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

EGFP

相关文章