本文介绍了一种优化的多模态成像流程，用于在啮齿类动物脑内对细胞移植物进行多模态成像，包括：（i）活体生物发光成像与磁共振成像，以及（ii）死后组织学分析。在单个动物上联合使用这些成像方式，可实现对细胞移植物的高分辨率、高灵敏度和高特异性的评估。
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本文内容
摘要
摘要
在过去的十年中，干细胞移植作为多种疾病在临床前和临床研究中的一种主要或辅助治疗手段，受到越来越多的关注。然而，迄今为止，关于干细胞移植后功能改善和/或组织再生的研究结果仍存在较大差异。通常可观察到一定的临床益处，但对其潜在机制尚缺乏深入理解1。因此，众多研究致力于开发不同的分子成像技术，以监测干细胞移植情况，最终准确评估移植干细胞的存活、命运及其生理状态，以及/或其微环境的变化。分子成像所检测到的一个或多个参数的变化可能与所观察到的临床效应相关。在这一背景下，我们的研究聚焦于联合使用生物发光成像（BLI）、磁共振成像（MRI）和组织学分析来评估干细胞移植效果。
BLI 通常用于在细胞移植后无创地进行细胞示踪，并随时间监测细胞存活情况2-7，其原理基于一种生化反应：表达荧光素酶报告基因的细胞在与其底物（例如 D-荧光素）相互作用后能够发光8, 9。另一方面，MRI 是一种具有临床适用性的非侵入性技术10，可用于高分辨率精确定位细胞移植物11-15，尽管其灵敏度在很大程度上取决于细胞标记磁共振成像对比剂后所产生的对比效果。最后，死后组织学分析是验证非侵入性技术所获得研究结果的首选方法，具有最高的分辨率和灵敏度。此外，终点组织学分析可基于荧光报告蛋白的使用和/或通过特异性抗体对细胞进行直接标记，对移植物细胞和/或周围组织进行详细的表型分析。
综上所述，本文通过直观展示生物发光成像（BLI）、磁共振成像（MRI）和组织学技术的互补性，揭示了小鼠中枢神经系统（CNS）内干细胞移植后与干细胞和/或微环境相关的不同特征。以骨髓来源的基质细胞为例，这些细胞经基因工程改造后可表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和萤火虫荧光素酶（fLuc），并标记了蓝色荧光的微米级氧化铁颗粒（MPIOs），将其移植到免疫功能健全的小鼠中枢神经系统中，并通过BLI、MRI和组织学方法对移植结果进行监测（图1）。
方案
1. 细胞制备
- 应使用经过基因工程改造、可表达荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告蛋白的体外培养干细胞群体启动实验。本实验采用如Bergwerf et al.2, 5先前所述的表达荧光素酶/eGFP的小鼠骨髓来源基质细胞（BMSC-Luc/eGFP）。
- 在细胞标记前两天，将BMSC-Luc/eGFP细胞以每T75培养瓶8 × 105个细胞的密度接种于15 ml完全扩增培养基（CEM）中，并添加1 μg/ml嘌呤霉素。
- 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养48小时。
- 向正在生长的细胞培养物中加入每毫升培养基5 × 106个Glacial Blue微米级氧化铁颗粒（GB MPIO）（总计：每个T75培养瓶15 ml培养基中加入75 × 106个颗粒）。
- 孵育16小时，以使细胞通过内吞作用摄取颗粒。
- 洗去未被摄取的颗粒，并继续培养24小时，以获得细胞融合度及GB MPIO的均匀分布。
- 通过荧光显微镜观察验证颗粒摄取情况，计数eGFP阳性细胞中同时为GB MPIO阳性的细胞比例。
- 用10 ml PBS将标记了GB MPIO的BMSC-Luc/eGFP细胞洗涤两次，并在胰蛋白酶-EDTA处理后（每个T75培养瓶加入5 ml，作用5分钟）收集....
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讨论
在本报告中，我们描述了一种优化的实验方案，结合三种互补的成像技术（生物发光成像、磁共振成像和组织学）对免疫功能正常小鼠中枢神经系统内的细胞移植进行详细表征。通过细胞报告基因标记（基于萤火虫荧光素酶和eGFP基因修饰）与GB MPIO直接细胞标记相结合，可实现对干细胞移植物的精确定量与定位分析 体内.
为了对BMSC进行颗粒标记，建议使用GB MPIO颗粒（粒径1.63 μm）并结合其阴离子表面（含羧基取代基），以促进非吞噬性细胞通过内吞作用摄取这些颗粒16-18。然而需要指出的是，获得高标记效率所需的孵育时间取决于细胞类型。例如，吞噬性细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）能够更快地内化这些颗粒（孵育时间为0.5–1小时），而非吞噬性细胞（如BMSC或神经干细胞）则需要至少16小时的孵育时间才能实现有效标记。在进行细胞标记实验时必须考虑这一因素，并且应始终在实验前通过荧光显微镜和/或流式细胞分析确定标记效率。由于使用GB MPIO对细胞群体进行标记不会影响细胞活力、细胞增殖或细胞表型5，因此这些颗粒中同时包含氧化铁和荧光染料，为.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究工作得到了安特卫普大学研究基金 ID-BOF 2006（授予 PPo 和 AVdL）、比利时弗拉芒科学基金会（FWO-Vlaanderen，比利时）的研究基金 G.0136.11 和 G.0130.11（授予 AVdL、ZB 和 PPo）以及 1.5.021.09.N.00（授予 PPo）、弗拉芒科学技术研究所（IWT）SBO 研究基金 IWT-60838：BRAINSTIM（授予 ZB 和 AVDL）、比利时弗拉芒政府部分资助的 Methusalem 研究基金（授予 ZB）、欧洲共同体第六框架计划网络研究项目 DiMI（EC-FP6-NoE DiMI，项目编号 LSHB-CT-2005-512146）和 EMIL（EC-FP6-NoE EMIL，项目编号 LSHC-CT-2004-503569），以及比利时大学间吸引力中心计划 IUAP-NIMI-P6/38（授予 AVDL）的支持。Nathalie De Vocht 获得了弗拉芒科学基金会（FWO-Vlaanderen）的博士研究生奖学金。Peter Ponsaerts 是弗拉芒科学基金会（FWO-Vlaanderen）的博士后研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| IMDM | Lonza Inc. | BE12-722F | 细胞生长培养基CEM的组分 |
| 胎牛血清 | GIBCO, by Life Technologies | 10270-106 | 细胞生长培养基CEM的组分 |
| 马血清 | GIBCO, by Life Technologies | 1605-122 | 细胞生长培养基CEM的组分 |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | 细胞生长培养基CEM的组分 |
| 两性霉素B（Fungizone） | GIBCO, by Life Technologies | 15290-018 | 细胞生长培养基CEM的组分 |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| 嘌呤霉素（Puromycine） | Invitrogen | ant-pr-1 | |
| 胰蛋白酶（trypsin） | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
| D-荧光素（D-luciferin） | Promega Corp. | E1601 | |
| 氯胺酮（Ketamine, Ketalar） | Pfizer Pharma GmbH | ||
| 赛拉嗪（Xylazine, Rompun） | Bayer AG | ||
| 异氟烷（Isoflurane） | Isoflo | 05260-05 | |
| 0.9% NaCl溶液 | Baxter Internationl Inc. | ||
| 多聚甲醛（paraformaldehyde） | Merck & Co., Inc. | 1.04005.1000 | |
| 蔗糖（sucrose） | Applichem | A1125 | |
| 微量注射泵（Micro-injection pump） | KD scientific | KDS100 | |
| 光子成像仪（Photon imager） | Biospace Lab | ||
| 9.4T磁共振成像仪（9.4T MR scanner） | Bruker Corporation | Biospec 94/20 USR | |
| BX51显微镜（BX51 microscope） | Olympus Corporation | BX51 | |
| Mycrom HM冷冻切片机（Mycrom HM cryostat） | Prosan | HM525 | |
| 注射器（syringe） | Hamilton Co | 7635-01 | |
| 30号针头（30 gauge needle） | Hamilton Co | 7762-03 | |
| Photo Vision软件 | Biospace Lab | ||
| M3vision软件 | Biospace Lab | ||
| Paravision 5.1软件 | Bruker Corporation | ||
| Amira 4.0软件 | Visage Imaging |
参考文献
- Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. Molecular imaging of stem cells. , (2008).
- Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in....
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重印与许可
