监测软体动物 Aplysia 细胞内钙离子浓度变化及突触效能

摘要

我们展示了如何在Aplysia的神经节制备中同时监测细胞内游离钙浓度和突触效能的变化。我们使用荧光染料Calcium Orange对细胞内钙进行成像，并利用尖锐（细胞内）电极诱导和监测突触传递。

摘要

有研究表明，细胞内钙离子浓度的变化介导了多种重要突触可塑性形式的诱导（例如，同突触易化）。 ¹这些假设可通过同时监测细胞内钙离子变化和突触效能的改变来验证。我们展示了如何通过将钙成像与细胞内记录技术相结合来实现这一目标。本实验在软体动物的口神经节中进行 Aplysia californica该制备方法具有多项实验优势：神经节可轻松分离 Aplysia 并且实验采用成年神经元，这些神经元形成正常的突触连接，并具有正常的离子通道分布。由于该动物的代谢率较低，且其自然生存环境的温度相对较低（14–16 °C）， Aplysia，制备物可长期保持稳定。

为了检测细胞内游离钙的变化，我们将使用钙橙（Calcium Orange）的细胞非渗透性版本。 ² 可通过离子电泳轻松将其导入神经元。当这种长波长荧光染料与钙结合时，荧光强度会增加。Calcium Orange 具有快速的动力学特性 ³ 并且与比率型染料（如 Fura 2）不同，成像时无需使用滤光轮。该染料具有较好的光稳定性，且光毒性低于其他染料（如 fluo-3）。 ^2,4与所有非比率型染料一样，Calcium Orange 可指示钙离子浓度的相对变化。但由于无法排除染料加载和扩散过程中染料浓度变化的影响，因此无法进行校准以提供绝对的钙离子浓度。

使用直立式固定载物台的复式显微镜，结合能够以每秒约30帧速率记录的CCD相机对神经元进行成像。Aplysia中的这种时间分辨率足以检测由单个动作电位引起的细胞内钙浓度的微小变化。同时使用锐利电极刺激并记录已鉴定的突触前和突触后神经元之间的突触传递。每次实验结束后，自定义脚本将电生理数据与成像数据合并。为确保精确同步，我们利用安装在显微镜相机接口上的LED发出的光脉冲作为同步信号。通过调控突触前钙离子水平（例如通过细胞内注射EGTA），可检验关于细胞内钙离子在介导不同类型可塑性中的作用的特定假设。

方案

1. 准备

1. 通过注射75-100 ml等渗氯化镁溶液使动物麻醉。我们用于成像的Aplysia通常重150-200克，购自Marinus Scientific。
2. 将麻醉后的动物固定在涂有石蜡的培养皿中。注射针头适用于此目的；无需无菌操作。使用粗镊子和普通剪刀在动物足部做切口，暴露口球组织。找到口神经节。使用弹簧剪刀和精细镊子小心切断所有口神经，以游离神经节。
3. 取出神经节并置于含有人工海水的Sylgard包被培养皿中。用几枚昆虫针穿过口神经以固定神经节。使用超细镊子和弹簧剪刀剥离口神经节的结缔组织鞘，以暴露神经元用于细胞内记录。然后使用约15枚细小昆虫针（minutien针）重新固定神经节。神经节必须牢固固定，因为在成像过程中任何移动都会造成问题。

2. 准备电极

1. 使用带丝玻璃毛细管（例如 WPI TW100F-4）和拉制仪制备电极。应根据需要调整拉制参数，以获得所需阻抗的电极。当使用 3 M KAc（乙酸钾）溶液填充时，若电极需进行斜面打磨，其阻抗通常约为 10 MOhm；若省略打磨步骤，则阻抗约为 5 MOhm。
2. 使用注射器和微填充针将一组电极填充含 3 M KAc/30 mM KCl 的溶液。这些电极将用于电生理记录。
3. 将另一组电极的后端浸入钙离子指示剂染料中进行填充，染料此前已用约 40 μl 蒸馏水溶解 500 μg 染料。当电极尖端充满染料后，再从后端回填约 1/4 英寸的 200 mM KCl 溶液，以确保良好的电接触。
4. 对电极进行斜面打磨是有益的，因为这有助于染料注射，并减少多次穿膜造成的损伤。我们使用自制的打磨装置，产生含有盐水/氧化铝粉末悬浮液的液流。电极固定在夹持器上，其尖端以 45° 角进入液流。持续监测电极阻抗，并在 KAc 填充电极的阻抗降至约 5 MOhm 时停止打磨。染料填充的电极打磨相同时间，其阻抗通常为 15–20 MOhm。

3. 加载钙离子指示剂染料

1. 将制备好的样本置于电生理记录装置上，并通过视觉定位目标突触前神经元。我们的许多实验使用的是摄食过程中发挥作用的特定感觉神经元 B21 ^{5, 6}。B21 胞体位置相对固定，体积较大（约 100 μm），形态细长，易于识别。
2. 用含有钙离子指示剂染料的电极穿刺目标神经元。可通过穿刺其突触后神经元 B8 来验证 B21 的身份：向 B21 注入约 8 nA 的去极化电流可引发动作电位，并在 B8 中产生易化的突触后电位 ⁷。
3. 通过施加超极化脉冲（通常为 -15 nA，1 Hz，占空比 75%）持续约 30 分钟，将染料注入目标突触前神经元。若染料加载成功，神经元胞体将呈现淡粉色。随后缓慢将含染料的电极从神经元中撤出。
4. 将样本静置约 30 分钟，以使染料扩散至与下游神经元形成突触连接的细小突起中。

4. 钙成像与电生理记录

1. 将样本置于成像显微镜上。培养皿通过Permagum密封胶条固定在冷却平台上，这种胶条与黏土不同，遇湿仍能保持黏性。该固定式显微镜通过移动物镜进行聚焦，载物台保持静止，从而可安装磁力支架操纵器。由于高倍放大下振动（尤其是横向移动）会成为问题，整个成像系统应放置在防震平台上。
2. 使用含有常规电解质溶液的电极穿刺突触前和突触后神经元。
3. 选择适合成像Calcium Orange的滤光片组（激发波长549 nm，发射波长576 nm）⁸，并调整相机。大多数科学级CCD相机允许研究者选择读出的CCD像素子集，此外还可将像素合并（binning）。选择较小的像素子集可提高速度，而合并像素可增强灵敏度。这两个设置与曝光时间共同决定了帧率，即每秒可采集的图像数量。合适的设置应能以500 × 300像素覆盖580 × 350 μm²的成像区域（使用10倍物镜和0.5倍相机适配器）。在光路中加入中性密度滤光片，将照明强度调节至在曝光时间<25 ms时获得正确曝光所需的最低水平。这些设置应实现约30 Hz的帧率——在Aplysia中，该速度足以捕捉单个动作电位引发的钙信号变化。最后，关闭视场光阑，使仅成像区域被照明。
4. 在成像软件中标记需要测量的神经元区域。在Elements AR软件中，可在“时间测量”模块中通过设置感兴趣区域（ROIs）完成。B21是一种双极神经元，先前研究表明其侧支过程与目标突触后神经元形成接触⁹。我们通常在神经元侧支的一级、二级和三级分支上分别设置ROI进行成像。此外，在染料填充神经元附近设置一个额外的ROI用于测量背景值，该值将在后续分析中从所有其他数据点中扣除。
5. 设置电生理记录系统（本实验中为Spike II）等待相机“帧读出”信号提供的触发信号。启动图像采集（Elements AR）；Spike II将在相机获取第一帧图像时自动开始记录。也可使用Power 1401的TTL输出短暂点亮安装在显微镜相机端口的LED，以提供用于后续同步成像与电生理数据的信号。
6. 通过向突触前神经元注入一系列短促的去极化电流脉冲（以所需频率）进行刺激。重要的是要监测每个脉冲（例如使用刺激触发的示波器），以确认是否成功产生动作电位。尽管Calcium Orange相比其他染料具有很高的光稳定性，仍建议在无刺激条件下记录一次对照试验，以评估染料漂白的程度。
7. 在需要操控细胞内钙浓度的实验中，将EGTA等药物引入突触前神经元，并重复上述刺激与数据采集步骤。

5. 典型数据的分析

1. 通过将成像数据（每个感兴趣区域测得的强度值列表）写入文本文件来导出数据。随后，Spike II 中的自定义脚本可导入该文本文件。此脚本还会根据各个探针的面积对数值进行归一化处理，并减去背景探针的值。然后将数据点作为“虚拟 RealWave”通道与电生理数据一同绘制。使用 Spike II 中的“通道处理/时间偏移功能”，以 LED 信号为参考，精确对齐成像数据点。
2. 为获得以百分比变化表示的数值，可通过计算荧光的相对变化 dF/F_o = (F - F_o) / F_o 来分析成像数据。其中 F_o 表示刺激前的荧光水平，F 表示刺激期间的荧光水平。

6. 代表性结果

图1. 实验的整体示意图。实验在Aplysia的神经节制备物上进行。通过荧光染料对细胞内钙离子的变化进行成像，该染料通过离子电泳法导入突触前神经元。随后用尖锐电极穿刺突触前和突触后神经元，以诱导并监测突触传递。

图2. 从Aplysia口神经节中已鉴定神经元进行钙成像和细胞内记录。(A) 神经元B21成像侧支的照片。方框表示测量的兴趣区域。(B1) B21的细胞内刺激引发动作电位（下部迹线）以及突触后跟随神经元B8中的易化性突触后电位（PSPs，中部迹线），导致B8也产生动作电位。突触前钙荧光的增加显示在上部迹线中。(B2) 突触前EGTA对同突触易化的影响。在细胞内刺激前约15分钟，将EGTA注入B21细胞内。据认为EGTA是一种作用较慢的钙螯合剂，在低浓度下其作用速度不足以抑制突触传递。注意广泛性钙信号的减弱以及相应PSP幅度的降低。(C) PSP幅度与突触前钙信号相关。 点击此处查看大图。

讨论

我们展示了可用于同时监测细胞内钙离子浓度并评估突触传递效能的技术。这些技术有助于确定不同形式的短期可塑性是如何介导的。

成像使用荧光显微镜和CCD相机进行。与大多数功能性成像装置相比，该技术对设备的要求相对较低。该方法简单且易于掌握。虽然使用CCD相机成像能够以良好的时间分辨率观察较大区域，但其空间分辨率有限。因此，该技术适用于检验有关细胞内钙离子广泛性或“背景性”升高的作用的假设。为了提高空间分辨率并研究树突棘中的钙动力学，可对本方案稍作修改，改用激光扫描共聚焦显微镜或双光子显微镜，并结合钙指示剂Calcium Green I进行成像¹⁰。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钙橙	Invitrogen	C-3013
EGTA	Sigma	E-4378
钙校准缓冲液试剂盒	Invitrogen	C-3008MP	适用于测试信号的灵敏度和动态范围
<强>表1. 所用试剂。
FN-1 直立荧光显微镜	尼康仪器公司	使用 Narishige ITS-FN1 载物台
NMN-21 操作器	Narishige	用磁铁固定在载物台上
CoolSNAP HQ2 CCD相机	光度测量
NIS元素AR	尼康仪器公司	我们使用了 3.22 版本
10X/0.3w 平场荧光物镜	尼康仪器公司	这款水浸物镜具有长达3.5 mm的工作距离
X-Cite 120 PC 金属卤化物灯	EXFO	用于荧光成像
LS-DWL 卤素灯	Sumica
ET-CY3滤光片组	Chroma Technology
Power 1401 A/D 转换器	剑桥电子设计	采样频率为 3 kHz
Spike II 软件	剑桥电子设计	我们使用了 7.07 版本
SEC-10 LX 放大器	NPI 电子	与10倍前置放大器头级一起使用
Model 410 放大器	布朗利精密仪器	用于放大和过滤信号
WS-4	减k技术	成像振动隔离
冷却平台	定制	通过可变速率泵送冰水的黄铜板
<强>表2. 使用的设备。