监测变化的细胞内钙离子浓度和突触效能的软体动物海兔

Summary

我们演示了如何在细胞内游离钙离子浓度和突触效能的变化，可以同时监测神经节准备的海兔。我们的图像使用的荧光染料，钙奥兰治，用锋利的（细胞内）电极和诱导和监测突触传递的细胞内钙离子。

Abstract

它已被建议的改变的细胞内钙介导诱导了一些重要的形式的突触可塑性（例如，单突触型长期便利^）1。这些假设可以通过同时监测细胞内钙的变化和变更，在突触效能测试。我们演示了如何这可以通过与细胞内记录技术相结合钙成像。我们的实验是进行中的软体动物海兔夜蛾的口腔神经节。该制剂具有许多实验的有利特征:Ganglia可以很容易地从海兔中除去和实验用成人的神经元，使正常突触连接，并具有一个正常的离子通道分布。由于低代谢率的动物和相对低的温度（14-16℃），是天然的海兔 ，制剂是稳定的，很长一段时间。 ENT">检测细胞内游离钙离子浓度的变化，我们将使用细胞浸透版本的钙橙^2，这是很容易的神经元通过离子导入"加载"到。当这个长波长的荧光染料结合钙荧光强度增加。钙橙色快速动力学特性，不同比例染料（如探针Fura 2），不需要滤光轮的成像，这是相当照片的稳定，减少光毒性比其他染料（如，荧光^-3）2,4。像所有的非比例染料，钙橙色表示钙离子浓度的相对变化。但是，因为它考虑到由于加载和扩散染料浓度的变化是不可能的，它不能被校准，以提供绝对的钙离子浓度。

一个直立的，固定的阶段，化合物使用显微镜用CCD照相机能够记录每秒30帧左右的图像神经元。在这个时间分辨率海兔是绰绰有余，即使只有一个尖峰诱导细胞内钙离子浓度的改变，来检测。同时，夏普电极用于诱导和记录确定前和突触后神经元突触传递的。在每次试验结束，自定义脚本，结合电生理和影像学资料。为了确保正确的同步，我们使用一个光脉冲从LED安装在显微镜的相机端口。操作突触前钙的水平（例如，通过细胞内EGTA注射），让我们来测试特定的假设，细胞内钙离子的作用，在调解各种形式的可塑性。

Protocol

1。准备

1. 麻醉的动物注射75-100毫升等渗氯化镁溶液。我们使用成像的海兔一般在150-200克，并从马里努斯科学。
2. 针麻醉动物蜡盖菜。注射器针头的工作以及用于此目的，无菌操作技术是没有必要的。总产钳和标准剪刀做一个切口在动物的脚和暴露颊质量。找出颊神经节。使用春风似剪刀和细镊子，小心地切割颊神经节。
3. 删除的节，并将其放置在一个Sylgard的涂层菜含有人工海水。将一些昆虫引脚通过颊神经，稳定神经节。 Desheath使用超细钳和春风似剪刀，以免暴露的神经元细胞内记录的口腔神经节。然后重新针神经节，约15细虫（分utien）引脚。节必须牢牢掌握在地方举行的任何运动将在成像过程中的问题。

2。准备电极

1. 拉使用玻璃毛细管用灯丝电极（例如WPI TW100F-4）和一个牵拉。应设置单独创建所需的电阻的电极。当填充有3 M醋酸钾（乙酸钾）我们的电极电阻通常为约10兆欧姆，如果电极是倾斜的，或约5兆欧姆如果斜切步骤被省略。
2. 填充的溶液含有3 M KAc/30 mM KCl中使用的注射器和microfil的针电极的一组。这些电极将被用于电生理学。
3. 填充与钙指示剂染料的第二组电极，通过浸渍染料中的电极的后端，先前与大约重组。 40微升蒸馏水为500μg染料。当在电极的前端已填充，回填土约1/4英寸用200mM的KCl，以确保良好的电接触的电极的端部。
4. 锥电极是有利的，因为这有利于染料注射和时间造成的伤害由多个膜贯穿。我们使用自定义的倒角，从而生成流的盐水/氧化铝粉悬浮液。电极被安装在一个支架内，和它的端部进入的流在45°的角度。电极电阻的连续监测和终止斜切当阻力达到约5兆欧为醋酸钾充满的电极时。的染料填充电极斜切一个相等的时间量，并典型地具有15-20兆欧姆的电阻。

3。载入中钙指示剂染料

1. 将准备上电钻机，直观地定位在突触前神经元的利息。我们的实验已经完成了一个确定的感觉神经元，利用在喂养过程中，B21 ^5，6。相对固定positio的N，尺寸（约100微米），B21的长形的胞体，它很容易找到。
2. 穿刺含有钙指示剂染料与电极的神经元的利益。刺穿突触后神经元B8，B21的身份进行验证。去极化的B21〜8 nA电流触发峰值，并在促进抽水蓄能电站B8 ^7的结果。
3. 注入染料在突触前神经元的利益，通过超极化脉冲（通常为-15 nA的，1赫兹，75％的占空比），约30分钟。如果染料加载成功，神经元的胞体将获得一个淡淡的粉红色。中取出的含染料的电极通过缓慢地撤回从神经元。
4. 发布准备约30分钟，以使染料扩散到精细的工序，使从动神经元突触接触。

4。钙成像和电生理记录

1. 将准备的成像力显微镜氧化聚乙烯。与Permagum密封线件，不同的是，粘土，仍然粘湿的时候冷却平台上保持与该制剂的菜。固定台显微镜主要由移动目标。阶段保持静止，它允许连接磁铁安装机械手。作为高倍率使得振动（特别是横向运动）的一个问题，整个成像设置应放置在隔振平台。
2. 与含有正常电解质溶液的电极穿刺突触前和突触后神经元。
3. 选择一个过滤器模块适用于图像钙橙色（激发波长549 nm，发射576纳米^）和调整摄像头。让研究者选择最科学的CCD相机的CCD读出的细胞的一个子集。此外，细胞可以组合（离散化）。选择一个较小的子集的增长速度，而分级提高了灵敏度。这两个设置，一起曝光时间，确定帧速率，即可以每秒采集多少张图像。合适的设置将图像的面积为580×350微米，500×300像素（使用10倍镜头和0.5倍的相机适配器）。添加中性密度过滤器的光路调整的照明强度的最小量，提供正确的曝光的曝光时间<25毫秒。这些设置导致大约30Hz的帧速率-在海兔是速度不够快，图像的单穗诱发钙的改变。最后，关闭，以便只有被照亮的成像区域的场光圈。
4. 在成像软件，你要测量神经元的区域标记。 AR软件中的元素，这是在"时间测量"部分，通过把地区的利益（投资回报率）。 B21是一个双极性神经元，和以前的工作已经证明，其横向过程联系人感兴趣的⁹突触后神经元。我们一般图像小学，中学，第三胸罩通过放置一个ROI在每个部分的神经元中的横向过程nches。旁边的染料填充神经元的一个额外的投资回报测量提供一种购买]是从所有其它的数据点中减去背景值。
5. 指导电生理采集（在这些实验中穗II）等待相机"帧读出"信号提供一个触发信号。启动图像采集（元素AR），穗II将自动开始录音时，相机将拍摄第一帧。您还可以使用TTL输出功率1401上的LED安装在显微镜的相机端口暂时关闭。这将提供一个信号，随后同步成像和电生理数据。
6. 刺激突触前神经元通过注入一系列简要的去极化电流脉冲在所需的频率。重要的是要监视每个脉冲（如刺激触发示波器），以确定是否一个动作电位是successfully产生。 ，而钙橙色是非常相比，其他染料光稳定性，这是一个好主意，记录无刺激的对照试验，检查多少染白化现象。
7. 在实验中，细胞内钙离子浓度的被操纵，药物如EGTA引入突触前神经元，并重复上述的刺激和数据采集步骤。

5。有代表性的数据分析

1. 它写入到一个文本文件中导出的成像数据（测得的强度值列表中的每个投资回报率）。在穗II自定义脚本可以导入的文本文件。该脚本还带的各个探针的区的归一​​化值，并减去的值的背景探针。的数据点，然后绘制作为"虚拟RealWave"通道旁边的电生理学数据。 "道工序/时移功能在穗II"是用来精确地对准成像数据POI个核苷酸，使用LED的信号作为参考。
2. 要获取值的百分比变化，分 ​​析成像数据计算的相对变化荧光DF / F _O =（FF _{O）/ F} o的。 _F o的代表在刺激之前的刺激和F的荧光的荧光水平。

6。代表性的成果

图1。总体方案的实验。在海兔神经节准备进行实验。细胞内钙的变化进行成像用荧光染料，这是离子电渗疗法的突触前神经元引入。可以诱导和监控，使突触传递和突触后神经元，然后用锋利的电极刺穿。

海兔口腔神经节神经元细胞内记录。 （A）照片的成像侧枝神经元B21。的方块表示测得的地区的利益。 （B1）的B21细胞内刺激唤起了动作电位（底部的迹线）和促进突触后电位（私人参建居屋计划）跟随神经元的突触后B8（中跟踪）造成的，也火了动作电位。增加突触前细胞钙离子荧光显示在顶部曲线。 （B2）单突触型长期促进突触前EGTA的影响。 EGTA细胞内注入B21〜15分钟内刺激。 EGTA它被认为是一个缓慢作用的钙离子螯合剂，它在低浓度时抑制突触传递速度不够快。注意的广泛钙信号和相应的减少在PSP振幅减少。 （C）的的PSP幅度与突触前calciu的米的信号。 点击这里查看大图 。

Discussion

我们证明，可用于同时监测细胞内钙离子浓度和评价疗效突触传递的技术。这些技术是有用的，用于确定如何短期可塑性的各种形式的介导。

用荧光显微镜，CCD摄像机的摄像进行。这些设备的要求也比较适中相比，功能最全的成像设置。该技术简单，易于学习。虽然用CCD照相机的成像允许可视化的大面积具有良好的时间分辨率，空间分辨率是有限的。因此，它是一种有用的技术进行测试的假设，比较普遍的"背景"增加细胞内钙离子的作用。为了提高空间分辨率和研究钙动力学在棘，激光扫描共聚焦显微镜，或双光子显微镜和钙指示剂钙格林我可以可以使用，只有轻微的修改协议^10。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
钙橙色	Invitrogen公司	C-3013
EGTA	西格玛	E-4378
钙校准缓冲液试剂盒	Invitrogen公司	C-3008MP	用于测试的信号的灵敏度和动态范围的非常有用
氯化镁六水合物	西格玛	M0250	0.33米的解决方案中使用的麻醉动物

设备名称	公司	评论
FN-1直立荧光显微镜	尼康仪器	与成茂ITS-FN1阶段
NMN-21机械手	成重	安装在舞台上与磁铁
CoolSNAP HQ CCD相机	光度
NIS元素A​​R （版本3.22）	尼康仪器	用于收购的荧光数据成像软件
福陆公司的目标10X/0.3w计划	尼康仪器	这水浸没透镜有很长的工作距离为3.5毫米
的X-Cite 120 PC金属卤化物灯	EXFO	用于荧光成像
LS-DWL 卤素灯	Sumica旅游
ET-CY3滤波器组	色度技术	;
电源1401 A / D转换器	剑桥电子设计	在3 kHz取样，
穗II （7.07版）	剑桥电子设计	软件用于收购电数据
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