我们展示了如何在Aplysia的神经节制备中同时监测细胞内游离钙浓度和突触效能的变化。我们使用荧光染料Calcium Orange对细胞内钙进行成像，并利用尖锐（细胞内）电极诱导和监测突触传递。
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摘要
摘要
有研究表明，细胞内钙离子浓度的变化介导了多种重要突触可塑性形式的诱导（例如，同突触易化）。 1这些假设可通过同时监测细胞内钙离子变化和突触效能的改变来验证。我们展示了如何通过将钙成像与细胞内记录技术相结合来实现这一目标。本实验在软体动物的口神经节中进行 Aplysia californica该制备方法具有多项实验优势：神经节可轻松分离 Aplysia 并且实验采用成年神经元，这些神经元形成正常的突触连接，并具有正常的离子通道分布。由于该动物的代谢率较低，且其自然生存环境的温度相对较低（14–16 °C）， Aplysia，制备物可长期保持稳定。
为了检测细胞内游离钙的变化，我们将使用钙橙（Calcium Orange）的细胞非渗透性版本。 2 可通过离子电泳轻松将其导入神经元。当这种长波长荧光染料与钙结合时，荧光强度会增加。Calcium Orange 具有快速的动力学特性 3 并且与比率型染料（如 Fura 2）不同，成像时无需使用滤光轮。该染料具有较好的光稳定性，且光毒性低于其他染料（如 fluo-3）。 2,4与所有非比率型染料一样，Calcium Orange 可指示钙离子浓度的相对变化。但由于无法排除染料加载和扩散过程中染料浓度变化的影响，因此无法进行校准以提供绝对的钙离子浓度。
使用直立式固定载物台的复式显微镜，结合能够以每秒约30帧速率记录的CCD相机对神经元进行成像。Aplysia中的这种时间分辨率足以检测由单个动作电位引起的细胞内钙浓度的微小变化。同时使用锐利电极刺激并记录已鉴定的突触前和突触后神经元之间的突触传递。每次实验结束后，自定义脚本将电生理数据与成像数据合并。为确保精确同步，我们利用安装在显微镜相机接口上的LED发出的光脉冲作为同步信号。通过调控突触前钙离子水平（例如通过细胞内注射EGTA），可检验关于细胞内钙离子在介导不同类型可塑性中的作用的特定假设。
方案
1. 准备
- 通过注射75-100 ml等渗氯化镁溶液使动物麻醉。我们用于成像的Aplysia通常重150-200克，购自Marinus Scientific。
- 将麻醉后的动物固定在涂有石蜡的培养皿中。注射针头适用于此目的；无需无菌操作。使用粗镊子和普通剪刀在动物足部做切口，暴露口球组织。找到口神经节。使用弹簧剪刀和精细镊子小心切断所有口神经，以游离神经节。
- 取出神经节并置于含有人工海水的Sylgard包被培养皿中。用几枚昆虫针穿过口神经以固定神经节。使用超细镊子和弹簧剪刀剥离口神经节的结缔组织鞘，以暴露神经元用于细胞内记录。然后使用约15枚细小昆虫针（minutien针）重新固定神经节。神经节必须牢固固定，因为在成像过程中任何移动都会造成问题。
2. 准备电极
- 使用带丝玻璃毛细管（例如 WPI TW100F-4）和拉制仪制备电极。应根据需要调整拉制参数，以获得所需阻抗的电极。当电极填充3 M KAc（乙酸钾）溶液后，若需进行斜面打磨，其电阻通常约为10 MΩ；若省略打磨步骤，则电阻通常约为5 MΩ。
- 使用注射器和微填充针将一组电极填充含3 M KAc/30 mM KCl的溶液。这些电极将用于电生理记录。
- 将另一组电极的后端浸入钙离子指示剂染料中进行填充，染料此前已用约40 μl蒸馏水溶解500 μg染料。当....
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讨论
我们展示了可用于同时监测细胞内钙离子浓度并评估突触传递效能的技术。这些技术有助于确定不同形式的短期可塑性是如何介导的。
成像使用荧光显微镜和CCD相机进行。与大多数功能性成像装置相比，该技术对设备的要求相对较低。该方法简单且易于掌握。虽然使用CCD相机成像能够以良好的时间分辨率观察较大区域，但其空间分辨率有限。因此，该技术适用于检验有关细胞内钙离子广泛性或“背景性”升高的作用的假设。为了提高空间分辨率并研究树突棘中的钙动力学，可对本方案稍作修改，改用激光扫描共聚焦显微镜或双光子显微镜，并结合钙指示剂Calcium Green I进行成像10。
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本研究工作得到了 PHS 基金（MH51393）的资助。我们所使用的一部分 Aplysia 由迈阿密大学国家 Aplysia 资源中心提供，该中心受美国国立卫生研究院研究资源中心基金 RR10294 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 钙橙 | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| 钙校准缓冲液试剂盒 | Invitrogen | C-3008MP | 适用于测试信号的灵敏度和动态范围 |
<强>表1. 所用试剂。 | |||
| FN-1 直立荧光显微镜 | 尼康仪器公司 | 使用 Narishige ITS-FN1 载物台 | |
| NMN-21 操作器 | Narishige | 用磁铁固定在载物台上 | |
| CoolSNAP HQ2 CCD相机 | 光度测量 | ||
| NIS元素AR | 尼康仪器公司 | 我们使用了 3.22 版本 | |
| 10X/0.3w 平场荧光物镜 | 尼康仪器公司 | 这款水浸物镜具有长达3.5 mm的工作距离 | |
| X-Cite 120 PC 金属卤化物灯 | EXFO | 用于荧光成像 | |
| LS-DWL 卤素灯 | Sumica | ||
| ET-CY3滤光片组 | Chroma Technology | ||
| Power 1401 A/D 转换器 | 剑桥电子设计 | 采样频率为 3 kHz | |
| Spike II 软件 | 剑桥电子设计 | 我们使用了 7.07 版本 | |
| SEC-10 LX 放大器 | NPI 电子 | 与10倍前置放大器头级一起使用 | |
| Model 410 放大器 | 布朗利精密仪器 | 用于放大和过滤信号 | |
| WS-4 | 减k技术 | 成像振动隔离 | |
| 冷却平台 | 定制 | 通过可变速率泵送冰水的黄铜板 | |
<强>表2. 使用的设备。 |
参考文献
- Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res.....
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